Name: 直接节段性肝内交付使用大鼠肝门部夹具模型方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习大鼠肝门部夹具模型方法，通过门静脉直接灌注药物分子以研究缺血再灌注损伤。该技术可减少分布容积，为肝移植及器官移植研究提供靶向给药方案。

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我们感谢Dennis Mathias所做的插图工作。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）T32AI 106704-01A1项目以及俄亥俄州立大学器官移植、灌注、工程与再生Flesch基金（T. Flesch Fund for Organ Transplantation, Perfusion, Engineering and Regeneration）的资助。

所有操作均按照机构动物护理指南和美国国家研究委员会《实验动物人道护理与使用指南》（IACUC）的规定进行，并已获得俄亥俄州立大学IACUC委员会的批准。
1. 初始设置
<ol>
	<li>设置手术显微镜和手术室（图3，图4）。开启所有设备，包括麻醉维持和生命体征监测设备。打开电外科设备和加热垫。将输液泵放置在手术台附近。
	<ol>
		<li>用麻醉注射器抽取10 mL用于吸入的液态异氟烷（分子量184.5），并将其放入麻醉机中。</li>
		<li>在手术台附近放置一个200 mL的液氮容器，在用于处理血液样本的离心机附近另放一个。</li>
		<li>将手术器械、4-0和7-0编织丝线、无菌棉签、4×4无纺布纱布、5 mL注射器以及27号胰岛素注射器放置在手术台附近。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备异氟烷麻醉舱，并确保麻醉诱导输送系统中已加入足量的异氟烷。</li>
</ol>
2. 麻醉诱导
<ol>
	<li>操作大鼠前，应穿戴以下个人防护装备（PPE）：外科口罩、外科手套和一次性防护服。</li>
	<li>称量大鼠体重并记录。 
	注意：应使用Sprague Dawley大鼠。</li>
	<li>将大鼠放入麻醉舱中，打开异氟烷和氧气，通过异氟烷舱诱导麻醉。</li>
	<li>使用电动剃毛器剪除动物腹部的毛发，以获得更清洁的暴露区域（图5）。</li>
	<li>将动物重新放回异氟烷舱中额外麻醉一分钟。进行足趾夹捏测试以确认麻醉深度。</li>
</ol>
3. 实验步骤
<ol>
	<li>将大鼠鼻部置于鼻罩内，并用固定装置或胶带将四肢固定在加热垫上。</li>
	<li>通过麻醉输送系统、鼻罩和异氟烷继续实施麻醉，对于体重在200至250克之间的动物使用3.6%浓度，体重超过250克的动物使用4%浓度。通过脚趾夹捏和皮肤夹捏测试确认麻醉深度。</li>
	<li>使用锐利剪刀沿腹中线从耻骨至剑突水平切开皮肤（图6）。</li>
	<li>沿腹白线从耻骨至剑突切开腹膜进入腹腔，注意避免损伤膀胱或肠道。由于肝脏前部靠近剑突处亦与腹膜粘连，确保在此区域切开腹壁前先将其松解。</li>
	<li>在右肝叶下缘水平处横向切开皮肤及腹膜。</li>
	<li>将麻醉浓度下调至1.6%（体重200–250 g动物）或2%（体重>250 g动物）。</li>
	<li>使用弯头蚊式钳抬起剑突。</li>
	<li>放置肋骨牵开器，尽可能将肋骨从中线向两侧拉开（图7）。剪断镰状韧带、膈韧带和胃韧带。用湿润的无菌棉签将肝脏向上翻起。</li>
	<li>根据需要剪断其他韧带以暴露肝门区域。使用生理盐水湿润的纱布进行内脏旋转（图7）。</li>
	<li>采用锐性或钝性分离法清除门静脉肝门部及其全程表面的疏松结缔组织。</li>
	<li>用镊子穿透左门静脉、动脉和胆管后方的疏松结缔组织，形成一个通道，穿过4-0 Potts缝线但暂不打结（图8）。</li>
	<li>清除位于右肾大致水平处汇入门静脉的后支表面的疏松结缔组织。该静脉将用于插管。</li>
	<li>使用胰岛素注射器从下腔静脉（IVC）抽取0.5 mL血液（图9）。将0.5 mL血液置于小瓶中，在135 × g条件下离心12分钟，尝试分离血清。
	<ol>
		<li>若红细胞与血清之间界面不清晰，可在135 × g条件下额外再离心2–3分钟。吸取血清并转移至另一小瓶用于丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测。将样本直接浸入液氮中迅速冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剪取两段7-0缝线并放置于拟插管静脉附近。将第一根7-0缝线尽可能靠内侧环绕该静脉，打结后用弯头蚊式钳牵拉固定（图10）。在该静脉靠近与门静脉交汇处再放置第二根7-0缝线并打一个结，但暂不收紧。</li>
	<li>准备输注泵，连接装有3 mL试剂的5 mL注射器，并预充管路。</li>
	<li>使用显微外科夹夹闭远端门静脉。 
	注：此举可在静脉切开插管时减少出血。</li>
	<li>使用小型显微外科剪刀，在7-0固定缝线与其和门静脉交汇点之间的静脉壁上剪开一个0.5 mm的小孔。使用27-0导管插入左门静脉系统（图11，图12）。将导管插入至左右门静脉分叉远端。</li>
	<li>通过注入1 mL生理盐水检查导管位置，观察肝脏左外侧叶和中叶是否变苍白。手动确认导管已越过右门静脉起始处，但尚未超过供应中叶的门静脉分支起始处。</li>
	<li>收紧Potts缝线并开始记录缺血时间。收紧7-0缝线，固定静脉与27-0导管，随后移除远端门静脉上的夹子。</li>
	<li>启动输注泵，开始输注聚乙二醇-超氧化物歧化酶（PEG-SOD，0.00067 g/mL）。输注开始时间应尽可能接近缺血开始时间。</li>
</ol>
4. 监测
<ol>
	<li>在整个输注过程中持续监测动物的生命体征。在15分钟内输注2 mL 0.9%生理盐水或含有PEG-SOD（0.00067 g/mL）的0.9%生理盐水2 mL。</li>
</ol>
5. 再灌注
<ol>
	<li>从缺血开始计时，等待一小时。此为1小时的热缺血时间。</li>
	<li>移除Potts缝线。取出27-0导管。收紧静脉周围的7-0缝线。记录时间。此时间点标志着再灌注的开始。</li>
</ol>
6. 持续采样
<ol>
	<li>在再灌注后120分钟从下腔静脉（IVC）抽取0.5 mL血液。抽血时应缓慢进行，以避免红细胞溶血。将血液缓慢滴入样品管中。每次采血后应确保下腔静脉的出血得到控制。
	<ol>
		<li>若仍有持续出血，可用无菌棉签或一块1 cm × 1 cm大小的纱布轻轻按压止血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以135 × g离心12分钟。如果分离效果不充分，可再额外离心2–3分钟，转速仍为135 × g。</li>
	<li>将一半血清放入样品管中，用于后续ALT检测。迅速冷冻保存这些样本。</li>
</ol>
7. 安乐死
<ol>
	<li>在大鼠仍处于麻醉状态时，剪断下腔静脉（IVC）和上腔静脉（SVC），并持续监测直至血流、呼吸和心跳停止。</li>
	<li>切开膈肌，并通过环形切开膈肌并切断肝脏与腹腔之间残留的结缔组织，进行简短的肝切除术。将肝脏从腹腔中取出。</li>
	<li>从肝脏的左叶和中叶取四个样本，从右叶取四个样本。样本应尽可能大，其大小仅受限于可用的肝组织量。将这些样本放入已标记的小瓶中，并在液氮中速冻。用于后续组织三磷酸腺苷（ADP）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）的检测。</li>
</ol>
8. 实验后分析
<ol>
	<li>根据制造商说明书，使用诊断试剂盒检测肝组织和血清样品中的谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性。</li>
	<li>用裂解缓冲液匀浆肝组织，并通过Bradford法进行定量。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离组织裂解液，并使用抗切割型caspase-3和actin抗体进行免疫印迹分析。使用公开可用的软件对Western blot结果进行定量。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均声明无利益冲突。

本系列实验表明，与对照组（生理盐水）相比，向左叶和中叶注射PEG-SOD可显著降低丙氨酸氨基转移酶（ALT）的释放、细胞膜脂质过氧化（MDA）水平，并维持谷胱甘肽（GSH）水平。肝脏组织转氨酶，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT），是肝细胞损伤的明确标志物。左叶注射PEG-SOD后ALT水平降低，提示PEG-SOD具有保护作用。组织MDA水平升高表明脂质过氧化增强，通常被视为氧化应激和组织损伤的标志。活性氧（ROS）的过量产生会导致MDA生成增加26。动物左叶和中叶组织中MDA水平在注射PEG-SOD后显著降低，进一步证明了PEG-SOD的保护作用。这与目前的认识一致，即PEG-SOD可保护细胞免受部分还原态活性氧物种造成的损伤27。此外，在活性氧存在的情况下，氧化型谷胱甘肽（GSSG）被还原为还原型谷胱甘肽（GSH）28。注射PEG-SOD的肝脏左叶和中叶中GSH水平得以维持，进一步支持了PEG-SOD的保护效应。此外，实验还显示，在经历缺血-再灌注损伤的组织中，活化型caspase-3（凋亡产物）水平升高。左叶经PEG-SOD处理后，活化型caspase-3减少，提示PEG-SOD可减少细胞凋亡的发生。
超氧化物歧化酶（SOD）是清除活性氧物种的关键酶。该酶催化两个超氧阴离子转化为过氧化氢和水。随后，过氧化氢酶将过氧化氢转化为水和氧气，从而完成这一过程25。天然SOD的半衰期较短，限制了其在实验模型中的应用，直到聚乙二醇偶联超氧化物歧化酶（PEG-SOD）的开发才得以改善。将SOD与聚乙二醇偶联后，其半衰期从6分钟延长至14小时。Nguyen et al. 在大鼠模型中通过系统给药证明了PEG-SOD能够减轻肝缺血引起的脂质过氧化29。
该技术存在多种潜在的改进方法，其中一些已在文献中有所描述。根据所采用的模型，分子可通过吸入11、硬膜外输注12、腹腔注射17,18,21,22、静脉给药10,14,15,19,23,24，或注射至外周肠系膜上静脉8等方式递送。
本方案中有几个关键步骤，其中最重要的是门静脉插管。必须注意在静脉上切开的孔不能过大，因为组织具有很强的弹性，切口会自行扩大。我们建议使用显微手术剪先切开一个直径约0.5 mm的孔。可通过器械将套管插入切口，相比徒手操作，这种方法更灵活精准。此外，在初始插入套管时，应将其方向对准左、右门静脉的分叉处，以避免刺破静脉后壁。当套管尖端到达分叉部位后，即可将其进一步送入左侧门静脉。一旦套管进入左门静脉（该血管供应左叶和中叶），可通过触诊静脉内部来手动确认其位置。此外，也可通过注入少量冷生理盐水，观察肝脏供血区域是否出现苍白现象，从而验证套管位置是否正确。
大鼠肝门阻断模型为研究肝缺血-再灌注损伤提供了一个可重复且稳定的平台。研究人员已采用多种不同的门阻断模型来研究抗氧化剂及其他小分子的保护作用6,7,8,9,10,11,12,13,14。模型的差异点包括：被夹闭的血管、发生缺血的肝段、是否夹闭胆管，以及再灌注持续的时间6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。 此外，当该模型用于研究某种分子给药的影响时，给药途径也存在异质性8,10,11,12,14,15,17,18,19,21,22,23,24。本研究所述方法具有若干优势。首先，对缺血肝段的门静脉系统进行直接插管，可实现药理学物质在肝段内的直接递送，从而可将肝脏其他叶作为内部对照。其次，肝段插管可缩小被研究分子的分布容积，通过将物质直接注入目标肝段，降低系统性副作用的风险。肝段直接插管还允许在缺血前、缺血中或缺血后递送物质，从而可在缺血-再灌注损伤周期的任一时间点研究该分子的作用效果。随着缺血时间的延长和损伤程度的增加，该模型还可为肝再生研究提供更多机会。
该方法也存在一些局限性。首先是启动成本。对于尚未配备手术显微镜的实验室而言，购置一台手术显微镜可能是一笔较大的初期投入。若无显微镜，该技术可能难以甚至无法实施。其次是学习曲线所需的时间。尽管该操作相对简单，但仍需要一定练习，初学者可能需要进行大量操作才能达到熟练水平。
总之，该模型为研究肝脏缺血-再灌注损伤提供了一个可重复、简单且经济高效的平台。尽管在本方案中输注了聚乙二醇化超氧化物歧化酶（一种自由基清除剂）25，但该模型也可用于输注多种不同的药物物质，以评估其对肝脏缺血-再灌注损伤的影响。

肝脏主要手术中采用入肝血流阻断以及肝移植手术，均需要经历一段暖缺血时间及随后的再灌注期，从而导致缺血/再灌注（I/R）损伤1。肝脏I/R损伤的后果已有大量文献详细阐述1,2,3。文献中描述的I/R损伤后果包括：活性氧物质的生成，炎症级联反应的启动（包括中性粒细胞、库普弗细胞和内皮细胞的活化），血红素加氧酶系统的活化以及Toll样受体的活化，内皮素与一氧化氮之间的失衡，核因子-κB的活化，以及促炎性细胞因子和黏附分子合成的增强1,2,3。这些促炎性事件可能导致细胞凋亡、坏死、器官功能障碍，最终导致器官衰竭3。
用于肝移植的器官若发生缺血-再灌注（I/R）损伤，可能导致早期移植物失功，并因边缘供体器官更易受损而加剧当前供体短缺的问题3。目前，美国等待肝移植的潜在受者达15,226人4，而2015年仅实施了5,950例肝移植手术5。由于器官供体资源极为有限，亟需开展针对肝脏I/R损伤的研究，以优化移植物功能并提高器官利用效率。
用于研究肝缺血-再灌注损伤的动物模型包括大鼠肝门阻断模型和大鼠肝移植模型。目前有多种大鼠肝门阻断模型在使用，其中最常见的是采用显微外科夹夹闭供应左外叶和中叶的门静脉、肝动脉和胆管的模型。6,7,8,9,10,11,12 30至60分钟6,7,10,13,14，随后进行60分钟至24小时的再灌注期7,9,10,13,14 允许切除大鼠肝脏的左侧叶和中叶，其约占肝实质的70%9一些旨在研究缺血预处理的实验方案包括在通过夹闭肝门血管诱导较长时间缺血之前，对肝门血管或后肢进行间歇性夹闭。9,13. 文献中还描述了多种改良方法。第一种是夹闭供应左外叶和方叶的门静脉和肝动脉，但不包括胆管15第二种改良方法是在离断门静脉、肝动脉和胆管之前，通过夹闭这些结构来诱导全肝缺血。16,17,18,19,20第三种改良方法包括夹闭右叶肝门血管30至60分钟。8. 另一种改良方法是夹闭一只后肢的血管束，以诱导肝脏损伤13,21. 本文展示了门静脉阻断术的多种操作方法 图1A-D.
大鼠肝脏肝门阻断模型已被用于研究不同分子和化合物对肝缺血/再灌注（I/R）的影响。根据所采用的模型，这些分子可通过吸入11、硬膜外输注12、腹腔注射17,18,21,22、静脉给药10,14,15,19,23,24，或注入外周肠系膜上静脉8等方式递送。
本报告中详述的大鼠肝脏肝门阻断模型包括通过门静脉的侧支直接插管至缺血节段的门脉供血区（图2），从而实现将待研究药物直接输送至肝段组织。我们的方法是诱导左侧叶和中叶缺血60分钟，在此期间直接向缺血节段输注待研究物质，本实验中为聚乙二醇化超氧化物歧化酶（一种自由基清除剂）25。在诱导缺血前及再灌注后120分钟采集血液样本。随后处死大鼠，并采集左叶和中叶组织样本。此外，还采集右叶组织样本作为内部对照。
这种方法具有诸多优势。首先，当所研究的药理学物质可直接注射至缺血区域时，其分布容积相较于注射到体循环或腹腔内的分布容积要低得多。此外，这种方法虽不能完全消除，但可减少系统性副作用的可能性。

<table><tbody><tr><td>斯普拉格-多利大鼠&amp;nbsp;</td><td>Harlan Sprague Dawley Inc.&amp;nbsp;</td><td>200–250 克&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>M500-N w/ OHS</td><td></td></tr><tr><td>活性炭罐</td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-2001-8</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 分子量 184.5&amp;nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pressure-Lok 精密分析注射器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Valco Instruments Co, Inc.&amp;nbsp;</td><td>SOMNO-10ML</td><td></td></tr><tr><td>电外科设备</td><td>Macan&amp;nbsp;</td><td>MV-7A</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Braintree Scientific&amp;nbsp;</td><td>HHP2</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 小动物麻醉系统</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>SS-MVG-Module</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>PS-MSTAT-RT</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉舱&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-0530LG</td><td></td></tr><tr><td>SurgiVet</td><td>Isotec</td><td>CDS 9000 台式机</td><td></td></tr><tr><td>氧气&amp;nbsp;</td><td>Praxair</td><td>98015</td><td></td></tr><tr><td>27-0 微型套管</td><td>Braintree Scientific&amp;nbsp;</td><td>MC-28</td><td></td></tr><tr><td>肋骨牵开器&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>INS600240</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇-超氧化物歧化酶（PEG-SOD）</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S9549 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>GenieTouch</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Baxter</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>4 × 4 非织造海绵&amp;nbsp;</td><td>Criterion</td><td>104-2411</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1009175</td><td></td></tr><tr><td>U-100 27 号胰岛素注射器</td><td>Terumo</td><td>22-272328</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>REF 309603</td><td></td></tr><tr><td>4-0 编织丝线缝合线</td><td>Deknatel, Inc.</td><td>198737LP</td><td></td></tr><tr><td>7-0 编织丝线缝合线</td><td>Teleflex Medical&amp;nbsp;</td><td>REF 103-S</td><td></td></tr><tr><td>1.8 mL Arcticle 冷冻管</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1418-7410</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微外科器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>小型剪刀&amp;nbsp;</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td>RS-5610</td><td></td></tr><tr><td>大型剪刀</td><td>S&amp;T&amp;nbsp;</td><td>SAA-15</td><td></td></tr><tr><td>镊子 — 大角度</td><td>S&amp;T&amp;nbsp;</td><td>JFCL-7</td><td></td></tr><tr><td>镊子 — 小角度&amp;nbsp;</td><td>S&amp;T</td><td>FRAS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>夹钳施加器</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5440</td><td></td></tr><tr><td>剪刀 — 非显微</td><td>FST 14958-11</td><td>14958-11</td><td></td></tr><tr><td>镊子 — 直头&amp;nbsp;</td><td>S&amp;T&amp;nbsp;</td><td>FRS-15 RM8TC</td><td></td></tr><tr><td>大型显微外科夹</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18055-01</td><td></td></tr><tr><td>小型显微外科夹</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18055-01</td><td></td></tr><tr><td>小型显微外科夹</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>小型显微外科夹</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>小型蚊式钳</td><td>通用&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;分析&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Biovision</td><td>K752-100</td><td></td></tr><tr><td>丙二醛（MDA）检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab118970</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒</td><td>Cayman Chemical</td><td>7030002</td><td></td></tr><tr><td>抗体 — Cleaved Caspase-3 和 Actin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>Antibody 9661</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件&amp;nbsp;</td><td>美国国立卫生研究院&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解与提取缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>10-188</td><td></td></tr></tbody></table>

利用大鼠肝门阻断模型进行肝内节段性直接给药的方法

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

肝脏主要手术中采用入肝血流阻断以及肝移植手术，均需经历一段时间的热缺血及随后的再灌注过程，从而导致缺血/再灌注（I/R）损伤，并引发多种不良后果。对于拟用于肝移植的边缘性供肝而言，潜在的I/R损伤会降低器官利用率，进而加剧目前供体短缺的问题。因此，迫切需要深入研究肝I/R损伤，以减轻其对移植后移植物功能的不利影响。目前常采用大鼠肝门阻断模型来评估不同分子对肝I/R损伤的作用。根据具体实验设计，这些分子可通过吸入、硬膜外输注、腹腔注射、静脉给药或经外周肠系膜上静脉注射等方式给予。本研究建立了一种用于评估药物分子缓解I/R损伤效果的大鼠肝门阻断模型。该大鼠肝门阻断模型的关键在于通过门静脉侧支直接插管至缺血肝段的供血分支，实现药物对肝段的直接靶向输送。本方法的具体操作为：对左侧外叶和中叶肝脏实施60分钟缺血，在此期间持续输注待研究物质。本例中，将聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD）——一种自由基清除剂——直接输注至缺血肝段。系列实验结果表明，输注PEG-SOD可有效减轻肝I/R损伤。该方法的优势在于可将药物直接注入缺血肝段，从而减少药物分布容积，并降低全身性不良反应的发生风险。

本实验共分为两组，每组3只大鼠。其中三只大鼠的肝脏通过输液泵在15分钟内注入2 mL生理盐水（NS）；另三只大鼠的肝脏通过输液泵在15分钟内注入含有聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD，0.00067 g/mL）的2 mL生理盐水（NS）。如上述方案所述，在肝门阻断前及再灌注120分钟时采集血液样本。此外，在完成120分钟再灌注后，从大鼠肝脏的左叶和中叶采集四份肝组织样本，从右叶采集四份肝组织样本。
在对照组（NS）和实验组（PEG-SOD）动物中，分别于门静脉阻断前及再灌注后120分钟测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。对照组（NS）动物在门静脉阻断前与再灌注后120分钟的ALT水平之间存在显著差异。在再灌注后120分钟，对照组（NS）与实验组（PEG-SOD）动物的ALT水平亦存在显著差异（图13A）。在肝脏左右叶中分别测定对照组（NS）和实验组（PEG-SOD）动物的组织丙二醛（MDA）含量。右叶（未行门静脉阻断）在对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）条件下，组织MDA含量无显著差异。左叶（门静脉阻断及再灌注后）在对照注射（NS）条件下的组织MDA含量与右叶（未行门静脉阻断）相比具有显著差异（p &lt; 0.001）。左叶（门静脉阻断及再灌注后）在对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）条件下的组织MDA水平亦存在显著差异（p &lt; 0.005）（图13B）。测定组织谷胱甘肽（GSH）含量，结果显示右叶（未行门静脉阻断）在对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）条件下的组织GSH含量无显著差异。左叶（门静脉阻断及再灌注后）在对照注射（NS）条件下的组织GSH含量与右叶（未行门静脉阻断）在对照注射（NS）条件下的含量相比具有显著差异（p &lt; 0.05）。左叶（门静脉阻断及再灌注后）在对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）条件下的组织谷胱甘肽含量亦存在显著差异（p &lt; 0.005）（图13C）。对对照组动物的肝脏左右叶进行Western blot分析，结果显示门静脉阻断及再灌注后左叶的cleaved caspase-3表达升高（图13D）。另一次Western blot分析比较了接受对照处理与PEG-SOD处理动物的左叶组织，结果显示接受PEG-SOD处理动物的肝脏组织中cleaved caspase-3表达降低（图13E）。密度测定分析进一步证实，对照组动物左叶肝脏组织中cleaved caspase-3的表达水平显著高于右叶（图13F）。在比较接受PEG-SOD处理的实验组动物与接受生理盐水（Normal Saline）处理的对照组动物的左叶肝组织时，密度测定结果显示，与对照组相比，PEG-SOD处理组动物的cleaved caspase-3表达显著降低（图13G）。
<img alt="显示不同象限视图A-D中肝脏血管结构、静脉、动脉的解剖图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：解剖示意图。A. 大鼠肝脏的解剖示意图。B. 大鼠肝脏的解剖示意图。肝左叶和中叶的门静脉蒂被夹闭，左叶和中叶处于缺血状态。C. 大鼠肝脏的解剖示意图。左叶的门静脉蒂被夹闭，左叶处于缺血状态。D. 大鼠肝脏的解剖示意图。右叶的门静脉蒂被夹闭，右叶处于缺血状态。
<img alt="肝灌注插管示意图；突出显示血管连接和实验手术设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：解剖示意图。 大鼠肝脏的解剖示意图，门静脉通过一支侧支插管。左侧叶和中叶的门脉蒂被缝线环绕，并使用微血管夹夹闭血管束。左侧叶和中叶处于缺血状态。
<img alt="托盘上的手术器械设置；工具包括用于手术的剪刀、镊子和手术刀。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3：器械设置。本图展示了器械的摆放设置。
<img alt="用于详细样本分析的显微镜设置；用于显微观察的实验室设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：手术室设置。 本图展示了手术室的布置。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验室小鼠实验；研究人员穿着个人防护装备；处理大鼠用于科学研究；医学研究设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：腹部毛发修剪。 本图展示了腹部毛发的修剪过程。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="外科显微手术操作，兽医手术设置；医学科学中的精密技术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 
图 6：固定与皮肤切口。 本图展示了大鼠的固定方法及皮肤切口操作。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="大鼠解剖的解剖学研究，突出显示内脏器官，用于教育研究目的。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7：肋骨牵开器放置与内脏去除。 本图展示了肋骨牵开器的放置及内脏去除操作。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="展示哺乳动物内部解剖结构的解剖图；可见肝脏、肠道；生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8：缝线的放置位置。 本图展示了缝线的放置方式。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="大鼠手术操作，检查器官组织；实验室环境中的科学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图9"> 
图9：从下腔静脉采血。 本图展示从下腔静脉进行采血的过程。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="哺乳动物手术过程，开放体腔显示内脏器官，用于生物医学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图10"> 
图10：静脉分支被结扎并牵开。 本图显示静脉分支已被结扎并牵开。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在啮齿类动物上进行外科手术；可见解剖工具；器官功能研究、解剖学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 11"> 
图 11：插管过程。本图展示了插管操作的过程。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示内脏器官的大鼠解剖图，用于解剖学研究的实验操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图12"> 
图12：插管操作。 本图展示了插管过程。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝脏缺血-再灌注实验结果；ALT、MDA 检测、蛋白表达分析、图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig13.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 13"> 
图 13： 代表性结果：利用大鼠肝门阻断模型直接进行肝内节段性递送聚乙二醇化超氧化物歧化酶。 NS = 生理盐水。PEG-SOD = 聚乙二醇化超氧化物歧化酶，ALT = 丙氨酸氨基转移酶，MDA = 丙二醛。A. 比较肝门阻断前与再灌注 120 分钟后的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT，mU/mL）。对照组（NS）在肝门阻断前与再灌注 120 分钟后之间存在显著差异（p &lt; 0.001）。对照组（NS）与实验组（PEG-SOD）在再灌注 120 分钟后也存在显著差异（p &lt; 0.05）。采用学生 t 检验。误差线表示标准差。B. 右叶（无肝门阻断）组织丙二醛水平在接受对照注射（NS）和实验注射（PEG-SOD）时无显著差异。左叶（肝门阻断后及再灌注后）组织丙二醛水平在接受对照注射（NS）时与右叶（无肝门阻断）相比具有显著差异（p &lt; 0.001）。左叶（肝门阻断后及再灌注后）在接受对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）时组织丙二醛水平也存在显著差异（p &lt; 0.005）。采用学生 t 检验。误差线表示标准差。C. 右叶（无肝门阻断）组织谷胱甘肽水平在接受对照注射（NS）和实验注射（PEG-SOD）时无显著差异。左叶（肝门阻断后及再灌注后）组织谷胱甘肽水平在接受对照注射（NS）时与右叶（无肝门阻断）接受对照注射（NS）相比具有显著差异（p &lt; 0.05）。左叶（肝门阻断后及再灌注后）在接受对照注射（NS）与实验注射（PEG-SOD）时组织谷胱甘肽水平存在显著差异（p &lt; 0.005）。采用学生 t 检验。误差线表示标准差。D. Western 印迹显示，对照动物（生理盐水）左叶（肝门阻断后及再灌注后）肝组织中裂解型半胱天冬酶-3 的表达高于右叶（无肝门阻断）。E. Western 印迹显示，与接受对照处理（生理盐水）的动物相比，接受 PEG-SOD 处理的动物肝组织中裂解型半胱天冬酶-3 表达降低。F. 肝门阻断后及再灌注动物肝组织中裂解型半胱天冬酶-3 水平显著升高（p &lt; 0.05）。采用学生 t 检验。误差线表示标准差。G. 比较实验动物（输注 PEG-SOD）与对照动物（输注生理盐水）的左叶肝组织，接受 PEG-SOD 处理的动物裂解型半胱天冬酶-3 显著低于对照动物（生理盐水）。采用学生 t 检验。误差线表示标准差。

建立了一种独特的大鼠肝脏肝门阻断模型，用于研究药物分子在减轻缺血-再灌注损伤中的作用。该模型通过门静脉分支对缺血肝段的门脉供血进行直接插管，从而实现肝脏的直接给药。

大范围肝切除术中采用入肝血流阻断以及肝移植手术，均需经历一段时间的热缺血及随后的再灌注，从而导致……

建立这一独特的大鼠肝脏肝门阻断模型，旨在研究感兴趣的药理学分子在改善缺血再灌注损伤方面的作用。该方法有助于回答肝移植领域中的关键问题，即哪些分子可直接注入肝脏以缓解缺血再灌注损伤。该技术的主要优势在于，可将目标分子直接注射至门静脉，从而减少其分布容积。该技术的意义在于可推广至所有器官的移植，因为它能够用于测试可能添加到器官灌注液中以减轻缺血再灌注损伤的分子。由于插管所用的门静脉分支尺寸较小，对该方法进行可视化演示至关重要。首先通过脚趾夹捏确认麻醉深度适当，然后将大鼠置于解剖显微镜下的加热垫上，并固定其四肢。接下来，从耻骨至剑突沿中线做腹部皮肤切口，随后沿腹白线在腹膜上做类似切口。进入腹腔时注意避免损伤膀胱或肠管，并在剑突附近向前松解肝脏与腹膜的连接。在肝右叶下缘处通过皮肤和腹膜做横向切口，使用弯头蚊式钳牵开剑突。使用肋拉钩从正中线尽可能撑开肋骨，并切断镰状韧带、膈下韧带和胃韧带。然后用湿润的无菌棉签将肝脏向上翻起，必要时切断其他韧带以暴露肝门。用生理盐水浸湿的纱布将肝脏进行内脏旋转，随后去除覆盖在肝门部的疏松结缔组织，以及沿门静脉全长走行的疏松结缔组织。用镊子穿过左门静脉、动脉和胆管后方的疏松结缔组织，形成一个通道，并用4-0 Potts缝线松松地环绕这些血管。然后，清除覆盖在右肾门静脉后支上方的疏松结缔组织。接着，使用胰岛素注射器从下腔静脉抽取0.5毫升血液，并将血液转移至一个小瓶中。将样品离心，并收集血清至新离心管中，用于液氮速冻。剪取两段7-0缝线。将第一根7-0缝线环置于左门静脉尽可能靠内侧的位置，并使用弯头蚊式钳牵拉该静脉。在门静脉后支靠近其与门静脉交汇处的位置，打一个松散的第二个7-0结扎环。现在，将装有3毫升试剂溶于0.9%生理盐水的5毫升注射器连接至输液泵，并预冲管路。使用显微外科钳夹住远端门静脉，以减少插管过程中的出血；然后使用小型显微外科剪刀，在7-0固定缝线与门静脉交汇之间的静脉壁上剪出一个0.5毫米的小孔。使用27-0导管插管左侧门静脉系统，将导管插入至左右门静脉分叉远端。注入1毫升生理盐水以确认导管位置，并观察肝脏左外叶和方叶是否变白。手动确认导管已通过右门静脉起始部，但未超过供应方叶的门静脉起始部，随后收紧Potts缝线，用7-0缝线固定导管，并移除门静脉远端的夹子。立即开始在15分钟内输注2毫升目标试剂，输注期间持续监测动物的生命体征。从缺血开始1小时后，移除Potts缝线和导管，然后收紧通向门静脉后支的7-0缝线。再灌注开始2小时后，从下腔静脉缓慢抽取0.5毫升血液，随后将血液缓慢滴注转移至新的小瓶中。必要时施加轻柔压力以止住静脉出血。随后对血液进行离心，并将一半血清迅速冷冻，用于后续处理，方法如前所示。在实验终点时，环形切开膈肌，并切断肝脏与腹腔之间残留的其他结缔组织。采集肝脏，从左叶和中叶获取四个大样本，从右叶获取另外四个大样本。随后将样本分别放入已标记的独立小瓶中，并在液氮中快速冷冻，以用于后续处理。在正常盐水和经门静脉夹闭后输注PEG-SOD的动物中，血清丙氨酸氨基转移酶水平在再灌注后120分钟时显示出对照组动物与实验组动物肝脏酶表达水平之间存在显著差异。在对照组与实验组之间，右侧非门夹闭叶的组织丙二醛表达水平未表现出显著差异。然而，左侧门夹闭后灌注叶的组织丙二醛表达水平显著高于对照组未再灌注、未灌注叶，以及右侧聚乙二醇-超氧化物歧化酶（PEG-SOD）灌注叶。组织谷胱甘肽表达也呈现相同趋势。Western blot 分析显示，在门静脉阻断和再灌注后，左叶中裂解型caspase-3的表达水平升高，而在经 PEG-SOD 灌注处理的动物中该表达水平降低，密度测定结果证实这些差异具有统计学显著性。熟练掌握后，若操作得当，该技术可在 3 小时 30 分钟内完成。在进行该操作时，需注意在放置门静脉远端夹时，应充分牵拉门静脉分支，以便于插管。 掌握此操作后，可用于研究多种药理学物质的影响。观看本视频后，您应能充分理解如何插管左侧门静脉系统。

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