利用大鼠肝门阻断模型进行肝内节段性直接给药的方法

建立这一独特的大鼠肝脏肝门阻断模型，旨在研究感兴趣的药理学分子在改善缺血再灌注损伤方面的作用。该方法有助于回答肝移植领域中的关键问题，即哪些分子可直接注入肝脏以缓解缺血再灌注损伤。该技术的主要优势在于，可将目标分子直接注射至门静脉，从而减少其分布容积。

该技术的意义在于可推广至所有器官的移植，因为它能够用于测试可能添加到器官灌注液中以减轻缺血再灌注损伤的分子。由于插管所用的门静脉分支尺寸较小，对该方法进行可视化演示至关重要。首先通过脚趾夹捏确认麻醉深度适当，然后将大鼠置于解剖显微镜下的加热垫上，并固定其四肢。

接下来，从耻骨至剑突沿中线做腹部皮肤切口，随后沿腹白线在腹膜上做类似切口。进入腹腔时注意避免损伤膀胱或肠管，并在剑突附近向前松解肝脏与腹膜的连接。在肝右叶下缘处通过皮肤和腹膜做横向切口，使用弯头蚊式钳牵开剑突。

使用肋拉钩从正中线尽可能撑开肋骨，并切断镰状韧带、膈下韧带和胃韧带。然后用湿润的无菌棉签将肝脏向上翻起，必要时切断其他韧带以暴露肝门。用生理盐水浸湿的纱布将肝脏进行内脏旋转，随后去除覆盖在肝门部的疏松结缔组织，以及沿门静脉全长走行的疏松结缔组织。

用镊子穿过左门静脉、动脉和胆管后方的疏松结缔组织，形成一个通道，并用4-0 Potts缝线松松地环绕这些血管。然后，清除覆盖在右肾门静脉后支上方的疏松结缔组织。接着，使用胰岛素注射器从下腔静脉抽取0.5毫升血液，并将血液转移至一个小瓶中。

将样品离心，并收集血清至新离心管中，用于液氮速冻。剪取两段7-0缝线。将第一根7-0缝线环置于左门静脉尽可能靠内侧的位置，并使用弯头蚊式钳牵拉该静脉。

在门静脉后支靠近其与门静脉交汇处的位置，打一个松散的第二个7-0结扎环。现在，将装有3毫升试剂溶于0.9%生理盐水的5毫升注射器连接至输液泵，并预冲管路。使用显微外科钳夹住远端门静脉，以减少插管过程中的出血；然后使用小型显微外科剪刀，在7-0固定缝线与门静脉交汇之间的静脉壁上剪出一个0.5毫米的小孔。

使用27-0导管插管左侧门静脉系统，将导管插入至左右门静脉分叉远端。注入1毫升生理盐水以确认导管位置，并观察肝脏左外叶和方叶是否变白。手动确认导管已通过右门静脉起始部，但未超过供应方叶的门静脉起始部，随后收紧Potts缝线，用7-0缝线固定导管，并移除门静脉远端的夹子。

立即开始在15分钟内输注2毫升目标试剂，输注期间持续监测动物的生命体征。从缺血开始1小时后，移除Potts缝线和导管，然后收紧通向门静脉后支的7-0缝线。再灌注开始2小时后，从下腔静脉缓慢抽取0.5毫升血液，随后将血液缓慢滴注转移至新的小瓶中。

必要时施加轻柔压力以止住静脉出血。随后对血液进行离心，并将一半血清迅速冷冻，用于后续处理，方法如前所示。在实验终点时，环形切开膈肌，并切断肝脏与腹腔之间残留的其他结缔组织。

采集肝脏，从左叶和中叶获取四个大样本，从右叶获取另外四个大样本。随后将样本分别放入已标记的独立小瓶中，并在液氮中快速冷冻，以用于后续处理。在正常盐水和经门静脉夹闭后输注PEG-SOD的动物中，血清丙氨酸氨基转移酶水平在再灌注后120分钟时显示出对照组动物与实验组动物肝脏酶表达水平之间存在显著差异。

在对照组与实验组之间，右侧非门夹闭叶的组织丙二醛表达水平未表现出显著差异。然而，左侧门夹闭后灌注叶的组织丙二醛表达水平显著高于对照组未再灌注、未灌注叶，以及右侧聚乙二醇-超氧化物歧化酶（PEG-SOD）灌注叶。组织谷胱甘肽表达也呈现相同趋势。

Western blot 分析显示，在门静脉阻断和再灌注后，左叶中裂解型caspase-3的表达水平升高，而在经 PEG-SOD 灌注处理的动物中该表达水平降低，密度测定结果证实这些差异具有统计学显著性。熟练掌握后，若操作得当，该技术可在 3 小时 30 分钟内完成。在进行该操作时，需注意在放置门静脉远端夹时，应充分牵拉门静脉分支，以便于插管。

掌握此操作后，可用于研究多种药理学物质的影响。观看本视频后，您应能充分理解如何插管左侧门静脉系统。