Name: 纵在体内的Cerebrovasculature影像:相关性疾病CNS (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解利用纵向双光子显微镜在阿尔茨海默病小鼠模型中追踪脑血管重塑的方法。这种微创技术可无炎症地实时观察血管变化，为研究中枢神经系统疾病的脑血管机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢法国抗癫痫联盟（资助 M.A-L）、法国国家健康与医学研究院 Avenir R12087FS 项目（资助 F.J）、蒙彼利埃大学（资助 F.J）以及脑科学研究联合会（资助 N.M）提供的经费支持。我们感谢蒙彼利埃 IPAM 活体成像核心平台的 Chrystel Lafont 提供的技术支持。同时感谢威尔康奈尔医学院 Mary Vernov 对手稿的校对。

小鼠可自由进食、饮水，并维持在12小时光照-12小时黑暗的循环环境中。ad libitum 所有涉及实验动物的操作均符合国家及欧洲法律法规，并经法国教育与科学研究部批准（CEEA-LR-00651-01）。本实验共使用6只转基因5xFAD小鼠和4只同窝野生型（WT）对照小鼠。
1. 术前准备
<ol>
	<li>手术前 48 小时，通过腹腔注射 Methoxy-X04（10 mg/kg）以标记 Aβ 沉积物11。</li>
	<li>制备无菌人工脑脊液（aCSF）（120 mM NaCl、26.2 mM NaHCO3、2.5 mM KCl、1 mM NaH2PO4、1.3 mM MgCl2、10 mM 葡萄糖；在加入 2.5 mM CaCl2 前，用 95% O2/5% CO2 气体饱和）。</li>
	<li>使用高压灭菌器或热珠灭菌器对手术器械（剪刀、镊子、刀片和钻头）进行灭菌，用于无菌手术。</li>
	<li>用 70% 乙醇清洁手术台和显微镜载物台，并覆盖干净的吸水布。</li>
	<li>腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（分别为 75&#160;mg/kg 和 10&#160;mg/kg）以及镇痛剂酮洛芬（2.5 mg/kg）&#160;。</li>
	<li>通过夹捏足垫或尾部检查麻醉深度是否适当。</li>
	<li>将无菌眼膏涂抹于眼睛，并剃除从鼻部至耳部区域的毛发，注意避免损伤胡须。可使用脱毛膏，但必须随后用清水仔细冲洗，以防皮肤刺激。剩余毛发可用刀片剃除。使用聚维酮碘消毒液对皮肤进行消毒。</li>
	<li>将小鼠置于双目显微镜下，从耳部至鼻部做皮肤切口。将皮肤向两侧拉开以暴露颅骨。切开骨膜，并反复用无菌 aCSF 冲洗颅骨，以防止可能的出血。</li>
</ol>
2. 血管标记与薄颅窗制备（40 分钟）
<ol>
	<li>用棉签去除眼药膏。滴一滴局部眼科麻醉剂（丁卡因 1%）&#160;轻轻按压眼窝周围的皮肤，使眼球突出。</li>
	<li>在眶后窦注射异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（70 kDa）（100 mg/kg 或 50 µl 的 50 mg/ml 溶液；使用皮下胰岛素针头），操作步骤参照 Yardeni 及其同事所述方法 12将无菌眼膏涂抹于眼睛。</li>
	<li>确保皮肤被充分拉回，并使选定成像区域周围的颅骨保持清洁干燥。在头固定装置的窗口周围涂抹少量氰基丙烯酸酯胶水（该装置由堆叠的刀片组成，参见 图1），并在目标区域周围轻轻按压数秒以粘合 10.</li>
	<li>将皮肤边缘拉至颅骨固定装置窗口的边缘，确保该区域干燥。用少量兽用级氰基丙烯酸酯胶水固定皮肤和窗口边缘，并等待其完全干燥（图1).</li>
	<li>使用头部固定装置将动物固定在实验台上。用无菌aCSF冲洗，并确保皮肤与头部固定装置之间的腔室完全密封。用保温毯包裹小鼠以维持正常体温。</li>
	<li>在 aCSF 溶液中进行颅骨减薄，操作步骤如前所述10注意，颅骨并非完全去除。需定期更换人工脑脊液（aCSF），以清除骨碎片并防止组织过热。残留的骨碎片可用短暂的气流吹除。&#160;aCSF 溶液还可减弱钻孔过程中产生的振动。 
	注意：小鼠颅骨厚度因动物年龄和感兴趣区域的不同而有所差异，通常在80至150 µm之间。</li>
	<li>使用牙科钻（中等速度，0.7 mm 钻头），以垂直于颅骨的常规垂直运动方式，在直径 1.0 mm 的范围内开始磨薄颅骨表面，并去除大部分松质骨（前 40–70 µm）。每 20–30 秒更换一次 aCSF。&#160;并限制连续钻孔时间&#160; 3-4 秒&#160;注意，颅缝附近的骨组织血管丰富。使用预先浸泡过aCSF的明胶海绵以止住可能的出血。</li>
	<li>使用锋利的一次性眼科显微手术刀继续减薄颅骨，注意避免施加过大压力。最终区域直径约为 0.5 mm，厚度为 20 - 35 µm。 
	注意：由于骨组织再生和瘢痕形成，每次成像时需进一步减薄窗口。</li>
</ol>
3. 双光子显微镜（45 分钟）
<ol>
	<li>如有必要，注射 19 mg/kg 的氯胺酮&#160;以维持充分的麻醉状态。&#160;</li>
	<li>将固定在头固定装置上的小鼠转移至双光子激光显微镜下。使用数值孔径为 1.0 的 20 倍水浸物镜，通过反射荧光灯将颅骨开窗变薄区域定位在光场中心。确保物镜始终浸没在 aCSF 中。</li>
	<li>启动锁模脉冲激光器（Ti-蓝宝石，680–1040 nm）进行激光扫描。设置激发波长为 750 nm，以分别在蓝色和绿色通道中检测甲氧基-XO4 和 FITC-葡聚糖的发射荧光。 
	注意：显微镜配备两个分光镜，波长分别为 506 nm 和 555 nm。蓝光由配备 470 ± 12 nm 滤光片的 NDD 探测器捕获；绿光由配备 525 ± 25 nm 滤光片的高灵敏度 GaAsP 探测器捕获。从物镜发出的最大激光功率不得超过 10 mW，以避免激光引起的组织损伤。</li>
	<li>以 0.7 倍数字放大倍率采集低倍图像序列（500 µm × 500 µm，512 × 512 像素；步进 2 µm），生成三维图像图谱，用于在后续时间点精确定位感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>以 2 倍数字放大倍率采集 4 幅高分辨率图像拼接图（每幅 200 µm × 200 µm，512 × 512 像素；步进 1 µm）。使用成像软件将视野每次移动 200 µm，以覆盖全部区域。图像拼接序列的深度通常为 250 µm，从每幅图像中软脑膜表面开始采集。</li>
	<li>在将小鼠移出显微镜前，拍摄软脑膜血管系统的照片或手绘二维示意图，以便将来重新定位成像区域。</li>
</ol>
4. 回收与重新成像
<ol>
	<li>在颅骨下方固定的同时施加牵引力，取下头固定装置。若颅骨或皮肤上残留任何胶水，需用精细镊子小心刮除。缝合头皮，并将小鼠置于加热的笼子中，监测其从麻醉中恢复的情况，之后再放回饲养笼。在缝合处涂抹局部抗生素软膏，并在接下来的2天内腹腔注射酮洛芬（2.5 mg/kg）。</li>
	<li>对于重复成像实验，重复步骤1.1至2.5。如有必要，使用显微外科刀片对颅骨进行修薄，以确保图像质量达到最佳。 
	注意：当两次成像实验间隔超过一个月时，可能需要使用牙科钻进一步减薄颅骨。</li>
	<li>根据前次实验（步骤3.6）获取的软脑膜血管二维图谱，在荧光透射光下将小鼠置于显微镜下方并进行定位。</li>
	<li>启动双光子激光扫描，利用步骤3.4中获得的三维图谱，调节显微镜载物台，实现微米级对位。随后按照步骤3.5所述进行详细成像。</li>
</ol>
5. 采集后三维重建与图像分析
<ol>
	<li>使用三维图像分析软件（如 IMARIS，版本 8.0 和 7.7.2）获取血管系统和淀粉样沉积物的三维重建图像。</li>
	<li>使用 归一化层 在图像处理菜单的对比度调整子菜单中使用插件以获得理想的对比度 两个通道的 在整个图像堆栈的深度范围内。</li>
	<li>同时打开同一区域在所有时间点的图像，并始终并行处理 以便比较不同时间点。</li>
	<li>使用filament tracer模块追踪血管。
	<ol>
		<li>单击丝状结构图标以创建新的丝状结构，跳过自动追踪器，选择自动路径法。</li>
		<li>确保所选通道对应于血管图像，使用指针的选择功能，在成像会话中保持一致的血管分叉处点击，同时按住 shift + control 键以确定起点。使用指针的选择功能，按住 shift 键并点击以选择纤维的终点。 
		注意：对获得的血管骨架进行比较，可揭示血管结构的变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逐层分析以追踪新斑块。对蓝色通道应用表面模块，以追踪Aβ斑块的生长情况。点击表面图标创建新表面，并进行自动表面生成。使用阈值法设置并减去背景信号。统计菜单提供与单个淀粉样沉积物表面相关的数据。</li>
</ol>

<ol><li>Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cerebral+microvascular+plasticity+from+birth+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).</li>
<li>Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbed+neural+activity+disrupts+cerebral+angiogenesis+during+a+postnatal+critical+period%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period.</a> Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).</li>
<li>Masamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+sprouting%2C+extension%2C+and+creation+of+new+capillary+connections+with+adaptation+of+the+neighboring+astrocytes+in+adult+mouse+cortex+under+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).</li>
<li>Marchi, N., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+remodeling+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular remodeling and epilepsy.</a> Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).</li>
<li>Giannoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+pathology+during+the+progression+of+experimental+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).</li>
<li>Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+amyloidosis+impairs+the+gliovascular+unit+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).</li>
<li>Herzig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+is+targeted+to+the+vasculature+in+a+mouse+model+of+hereditary+cerebral+hemorrhage+with+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis.</a> Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).</li>
<li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraneuronal+beta-amyloid+aggregates%2C+neurodegeneration%2C+and+neuron+loss+in+transgenic+mice+with+five+familial+Alzheimer%27s+disease+mutations%3A+potential+factors+in+amyloid+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation.</a> J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li>
<li>Liston, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+glucocorticoid+oscillations+promote+learning-dependent+synapse+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance.</a> Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Klunk, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04%2C+a+systemically+administered+Congo+red+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Cao, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+experience-dependent+molecular+changes+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+attack%3A+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Joseph-Mathurin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+immunization+worsens+iron+deposits+in+the+choroid+plexus+and+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds.</a> Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).</li>
<li>Sadowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

开颅技术 体内 双光子显微镜具有可对大视野进行无限次成像的优势13,14然而，该技术也会在目标区域引发炎症反应14，通常不兼容或影响神经血管读数15相反，去薄颅骨的经颅成像技术不会引发神经炎症，因而能够可靠地对脑血管结构和斑块积聚进行成像。10,14该技术的第二个优势在于，对于经验丰富的操作者，去骨瓣成窗的成功率可高达80%至90%。影响成功率的主要问题是未能准确判断骨厚度，导致过度减薄并最终发生骨折；经验丰富者结合双目显微镜优良的光学性能可有效减少此类问题。然而，该技术仍存在若干局限性。首先，与开颅手术相比，其成像深度受限。其次，随着时间推移，覆盖于骨表面的瘢痕组织可能降低经颅成像的质量。第三，由于每次成像均需进一步轻微减薄颅骨，因此难以进行超过4次的成像操作。因此，实验初期即应确定成像次数，以优化各次操作之间的减薄增量。此外，已有研究报道一种慢性经颅窗口方法，即在减薄颅骨制备基础上用盖玻片粘合形成稳定窗口，以限制骨组织随时间的再生。16尽管该技术效率较高，但我们发现，这种方法仅能将骨再生延迟数周，最终在较长...

脑血管系统是一种多细胞结构，在解剖和功能上均与神经元紧密耦合。在脑发育过程中以及中枢神经系统（CNS）疾病进展期间，血管会发生动态重塑。 1,2普遍认为，脑血管损伤是多种中枢神经系统疾病（包括癫痫、阿尔茨海默病（AD）、创伤性脑损伤和脑炎）的显著特征。 3,4因此，追踪脑血管变化 体内 在建模中枢神经系统疾病从发病到慢性阶段的过程中，这一因素变得尤为重要。由于脑血管的改变常与神经元损伤或可塑性变化同时发生，因此对神经血管系统的成像成为解析中枢神经系统疾病病理生理机制的关键切入点。
本方案描述了一种基于纵向双光子成像的技术，用于在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中追踪脑血管系统的重塑过程。AD是一种进行性病理过程，其特征是由于淀粉样斑块沉积导致大口径和小口径脑血管出现结构缺陷5-7。该方法可实现对淀粉样沉积物的可视化，并在疾病发展过程中持续追踪其位置变化和生长情况，同时关联神经血管重塑的动态过程。每次成像前，向转基因AD小鼠体内注射活体荧光染料，以标记脑血管系统和淀粉样斑块8。通过磨薄颅骨建立的经颅窗口，对同一感兴趣区域（ROI）进行多次重复成像，该方法具有非侵入性，是目前在活体小鼠脑内评估神经血管重塑的首选方法2,5,9,10。
以下流程概述了手术方案、图像采集与处理。该方法主要表征了大脑淀粉样血管病（CAA）在大型软脑膜动脉和穿支小动脉中的早期进展。

<table><tbody><tr><td>甲氧基-X04</td><td>tocris</td><td>4920</td><td>使用剂量为 10 mg/kg</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记右旋糖酐 70 Kda</td><td>sigma</td><td>46945</td><td>使用剂量为 100 mg/kg</td></tr><tr><td>明胶海绵/Bloxang</td><td>Bausch and Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微外科刀片</td><td>surgistar</td><td>6900</td><td>必须锋利且无凹痕</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>betadine</td><td></td><td>抗菌溶液</td></tr><tr><td>双目立体显微镜</td><td>olympus</td><td>SX10</td><td>本操作中，最佳的图像对比度至关重要</td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>zeiss</td><td></td><td>Zeiss LSM 710mp</td></tr><tr><td>精细剪刀-ToughCut</td><td>Fine science tools</td><td>14058-09</td><td>该剪刀专为切割皮肤和软组织而优化设计</td></tr></tbody></table>

纵向的 体内 脑血管成像：与中枢神经系统疾病的相关性

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

脑血管的重塑是脑部疾病的常见特征。体内成像技术对于检测随着时间推移、与神经元活动或血流相关的脑血管可塑性或损伤至关重要。体内双光子显微镜技术可实现对活体大脑中大范围细胞单元结构与功能可塑性的研究。特别是，薄颅骨窗制备方法可在不引发显著脑部炎症的情况下，实现对皮层感兴趣区域（ROI）的可视化。重复对皮层感兴趣区域进行成像具有可行性，从而可在多种中枢神经系统（CNS）疾病进展过程中，对疾病标志性特征进行时间序列上的表征。该技术可探及脑表面250 μm范围内的软脑膜结构，依赖于由遗传性细胞标记物编码的荧光探针和/或活体染料的检测。后者（例如，荧光葡聚糖）用于描绘脑血管结构的管腔部分。本方案相关的是使用一种体内淀粉样蛋白沉积标记物Methoxy-O4，以评估阿尔茨海默病（AD）的进展。我们还描述了图像采集后的处理方法，用于追踪血管变化和淀粉样蛋白沉积。尽管目前聚焦于AD模型，但本方案同样适用于其他存在病理性脑血管改变的中枢神经系统疾病。

本方案描述了一种随时间推移可视化脑血管系统和淀粉样沉积物的方法。通过注射荧光染料标记淀粉样沉积物（methoxy-XO4）11，并灌注脑血管管腔（FITC-Dextran）1。利用三维图像分析软件模块，对连续时间点采集的固定视野图像生成三维图像。在5XFAD小鼠5（阿尔茨海默病的遗传模型）体感皮层中获得的代表性图像显示，大多数Aβ沉积物出现在3至4月龄之间，并在实质中（图2）以及穿支血管周围（图3）逐渐增大。斑块沉积的同时，邻近脑血管系统发生显著重塑，并偶见血管闭塞（图2）。仅观察到极少数斑块体积减小的情况，表明该过程以斑块累积为主。 图2 和 图3 说明实质内及血管周围的淀粉样负荷与体感皮层中的血管生成和血管闭塞相关。然而，由于大多数血管性斑块积聚于较大的穿支动脉，而闭塞主要发生在小口径血管，因此血管性淀粉样斑块与血管闭塞之间的关系仍不明...

本文描述了一种在淀粉样斑块积聚过程中追踪脑血管重塑的方法 体内 使用纵向双光子显微镜技术。通过减薄颅骨制备方法，可观察荧光染料以评估阿尔茨海默病小鼠模型中脑血管损伤的进展。

大脑血管系统的重塑是多种脑部疾病的常见特征。活体成像技术对于检测脑血管结构及功能改变至关重要……

本实验的总体目标是在长时间内追踪小鼠大脑血管系统在慢性疾病发展过程中的重塑情况。该方法有助于回答神经科学领域中的一些关键问题，例如脑血管系统重塑在中枢神经系统疾病中的作用。该技术的主要优势在于其微创性且不引起神经炎症，因此非常适合用于研究那些炎症本身参与其中的病理过程。该技术可实现软脑膜及皮层穿支血管的可视化，可作为组织学技术的补充，用于直接观察血脑屏障实质内的微毛细血管。本次演示由Margarita Arango-Lievano完成，她是我实验室的博士后。开始此操作前，使用70%乙醇清洁手术台和显微镜载物台，并用干净的吸水布覆盖。接着，通过脚掌或尾部夹捏检查麻醉深度是否适当。然后将无菌眼膏涂抹于眼睛表面，并用刀片剃除从鼻部至耳部区域的毛发。随后，使用聚维酮碘消毒液对皮肤进行消毒。将小鼠置于双目显微镜下，从耳部至鼻部沿中线做皮肤切口。向两侧牵拉皮肤以暴露颅骨。然后撕除骨膜，用无菌人工脑脊液反复冲洗颅骨以止住可能的出血。在此过程中，用棉签清除眼药膏，随后滴加一滴局部眼用麻醉剂。轻压眼眶周围皮肤以使眼球突出。随后，向眶后窦注射与葡聚糖偶联的FITC。接着，将无菌眼膏涂抹于眼睛。确保将皮肤回缩，并使选定成像区域周围的颅骨保持清洁干燥。然后在颅骨固定装置的窗口周围涂抹少量氰基丙烯酸酯胶水，并将固定装置粘附在目标区域周围。随后，对颅骨固定装置施加轻柔压力，持续数秒。将皮肤边缘拉至颅骨固定装置窗口的边缘，确保该区域干燥。用少量氰基丙烯酸酯胶水固定皮肤和窗口边缘，并等待其干燥。随后，使用颅骨固定装置将动物固定在实验台上。用无菌人工脑脊液（ACSF）冲洗目标区域的颅骨，并确保皮肤与头固定装置之间的腔室完全密封。随后，用保温毯包裹小鼠以维持正常体温。接着在 ACSF 溶液中进行颅骨薄化，以减弱钻孔过程中产生的振动。需定期更换人工脑脊液（ACSF），以清除骨屑并防止组织过热。使用牙科钻，在直径约1毫米的范围内，沿平行于颅骨的方向进行常规垂直运动，开始磨薄颅骨表面，并去除大部分松质骨。注意颅骨缝附近的骨组织血管丰富。如果出现出血，应用预先浸泡过ACSF的明胶海绵压迫止血。因此我们保留颅骨以减少炎症反应，但在减薄过程中施加过大的压力或产热也可能导致炎症。使用锋利的一次性眼科显微手术刀继续减薄颅骨，最终形成一个直径约0.5毫米、厚度为20至35微米的区域，注意避免施加过大的压力。由于骨再生和瘢痕形成，每次成像时都需要进一步减薄颅窗。在此步骤中，将带有头固定装置的小鼠转移至双光子激光显微镜下。使用数值孔径为 1.0 的 20X 水浸物镜，通过落射荧光灯将薄颅窗定位在光学视野中心。确保物镜始终浸没在ACSF中。接下来，使用锁模脉冲激光器开始激光扫描。将激发波长设置为750纳米，以在蓝色通道中检测methoxy-X04的发射荧光，在绿色通道中检测FITC-葡聚糖的发射荧光。以0.7倍数字变倍获取低倍率图像序列，以建立三维图谱，用于在后续时间点精确定位感兴趣区域（ROI）。然后以2倍数字变倍获取四幅高数字放大倍率的图像拼接图。使用成像软件，以200微米为步长移动成像窗口，以捕获所有区域。每幅镶嵌图像中，堆栈的深度通常从软脑膜表面开始为250微米。在将小鼠移出显微镜前，应拍摄或手绘软脑膜血管的二维图，以便将来重新定位成像区域。此处展示的是五月龄和四月龄五乘FAD小鼠微血管系统与淀粉样蛋白沉积的两个重建图像的对比结果。淀粉样斑块用白色星号标示，五个月时新出现的斑块用黄色星号标示。斑块减少的罕见情况用橙色星号标示。新形成的微血管用黄色箭头标示，而血管闭塞则用红色箭头标示。该图显示了大管径血管上的淀粉样血管沉积物。同时，也可在小管径血管上观察到淀粉样斑块。红色箭头指示闭塞的血管，白色星号指示正在生长的淀粉样斑块。因此，一旦掌握该技术，包括手术和成像步骤在内，可在1.5小时内完成。在实施该操作时，重要的是要规划好成像次数，以避免在首次成像时造成颅窗过度变薄。总体而言，这些操作可实现对疾病进展过程中脑血管系统变化的动态追踪。

longitudinal-vivo-imaging-cerebrovasculature-relevance-to-cns

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

纵<em&gt;在体内</em&gt;的Cerebrovasculature影像：相关性疾病CNS

来源：Arango-Lievano, M. 等，中枢神经系统疾病的脑血管纵向活体成像研究。J. Vis. Exp.

阿尔茨海默病小鼠模型中脑血管与淀粉样斑块的活体成像

本文介绍了一种利用血管造影技术对脑内血管结构进行定量分析的方法 体内 和 离体...

利用双光子显微镜在HIV诱导的神经炎症小鼠模型中定量分析脑血管结构

本方案描述了联合近红外荧光（NIRF）成像与微型计算机断层扫描（microCT）技术用于可视化脑血栓栓塞的应用。该技术可实现对血栓负荷及其演变过程的定量分析。NIRF成像技术可用于观察离体脑组织中荧光标记的血栓，而microCT技术则利用金纳米颗粒在活体动物体内实现血栓的可视化。...

结合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞

我们描述了一种实验性脑型疟疾的小鼠模型，并展示了如何追踪炎症和微血管病理变化 体内 使用磁共振成像。...

体内追踪实验性脑型疟疾模型中水肿发展及微血管病理变化的磁共振成像研究

脑血流动力学与光散射特性的同步评估 体内...

同时评估脑血流动力学与脑组织光散射特性 在体 内 使用多光谱漫反射成像的大鼠脑成像

尽管多光子成像仅在组织表面有限深度范围内有效，但通过pCLE可实现任意深度下3...

清醒小鼠海马毛细血管的体内光纤耦合临床前共聚焦激光扫描内窥显微成像（pCLE）

经颅光学成像技术能够通过完整颅骨对活体小鼠大脑皮层中的脑脊液运输进行宽场成像。...

利用荧光大体显微镜通过完整小鼠颅骨在体成像脑脊液运输

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。...

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

本方案介绍了在麻醉小鼠中获取和分析脑包被周细胞的荧光钙成像以及邻近血管血流数据的步骤。这些技术可用于壁细胞生理学研究，并可调整用于研究任何细胞类型的钙瞬变。...

转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于特定化学键的固有振动，实现对生物分子的无标记成像。本实验方案描述了一种集成式受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的仪器装置，用于在活体小鼠脊髓中可视化细胞结构。...

体内 生物组织成像：双光子荧光与受激拉曼散射显微技术结合

成对小脑延髓池纳米注射与激光散斑血流成像联合检测法研究脑血流调节 在体 内

了解利用纵向双光子显微镜在阿尔茨海默病小鼠模型中追踪脑血管重塑的方法。这种微创技术可无炎症地实时观察血管变化，为研究中枢神经系统疾病的脑血管机制提供重要工具。

纵向的体内脑血管成像：与中枢神经系统疾病的相关性

探索更多视频

纵向的 体内 脑血管成像：与中枢神经系统疾病的相关性

探索更多视频

纵向的体内脑血管成像：与中枢神经系统疾病的相关性