Name: 鼠标显微注水技术进行有针对性的物质传递到中枢神经系统通过的颈内动脉 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学习小鼠显微手术灌注技术，通过颈内动脉将外源性物质直接递送至脑部，无需穿透颅骨。该方法创伤小、保持神经元网络完整性，可实现高浓度物质递送，适用于神经科学研究。

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我们感谢Lei Chen博士（纽约西奈山医学院）首次在我们的实验室中建立了该模型的应用，感谢Gretchen Wolff博士（德国海德堡德国癌症研究中心）在我们实验室中推广了该技术。本研究部分得到以下基金支持：HL126559、DA039576、MH098891、MH63022、MH072567、DA027569以及NSC 2015/17/B/NZ7/02985。

以下方案所涉及的实验程序已获得迈阿密大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。此外，所有操作均在经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。
1. 手术小鼠的准备
<ol>
	<li>使用实验室麻醉系统，将异氟烷与氧气混合，对小鼠进行麻醉。异氟烷浓度设定在4-5%之间。&#160;并在商用仪器上设置氧气流速为2 L/min（见材料表）。将动物转移至手术台面，在体视显微镜下通过鼻罩维持麻醉（使用异氟烷浓度1.5–2.5，氧气流速2 L/min）。
	<ol>
		<li>确保小鼠呼吸频率约为1 - 2次/秒，且无喘息现象。同时，确认动物无胡须刺激反应和足底反射（趾夹反射）。术中至少每5分钟监测一次呼吸频率和呼吸努力程度。.&#160;遵循特定的机构动物护理和使用委员会以及兽医指南，对啮齿类动物麻醉进行监测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌棉签在每只眼睛上涂抹一滴眼用润滑剂，以防止干燥。&#160;建议给予抗炎药和镇痛药以缓解不适。</li>
	<li>动物仰卧时，通过鼻罩维持麻醉。</li>
	<li>用擦拭布对动物颈部区域擦拭三遍以清洁该区域&#160;使用70%乙醇和氯己定进行消毒。用剃刀剃除动物手术区域的毛发（详见下文）。</li>
</ol>
2. 颈总动脉（CCA）的解剖分离
<ol>
	<li>在体视显微镜下进行整个显微手术操作。使用手术剪和镊子在颈部正中做一浅表切口，从胸骨上方至下颌下方（约3至4厘米）。</li>
	<li>用镊子仔细分离脂肪和结缔组织，暴露气管。</li>
	<li>将一个枕头（圆形物体，直径约0.5厘米）置于小鼠颈部后方，以伸展颈部，进一步暴露手术区域。</li>
	<li>使用组织牵开器或钩子分离组织。</li>
	<li>在动物气管左侧，小心用镊子分开结缔组织，暴露左侧颈总动脉（CCA）。</li>
	<li>用镊子仔细去除所有结缔组织，暴露颈总动脉分叉处以及颈外动脉和颈内动脉的起始段。</li>
</ol>
3. 准备用于物质输注的CCA
<ol>
	<li>使用镊子将两段尼龙缝合线（每段约 1 cm）插入颈外动脉（ECA）下方。</li>
	<li>在 ECA 尽可能高的位置打一个永久结。</li>
	<li>在 ECA 尽可能低的位置、紧邻颈总动脉（CCA）分叉上方，打一个可拆除的结。此结应比上方的结更松。</li>
	<li>在尽可能低的位置，使用血管夹闭合颈总动脉（CCA）。</li>
	<li>使用血管夹闭合颈内动脉（ICA）。</li>
	<li>使用显微解剖弹簧剪在两个结之间的 ECA 上做一个小切口（约 2 mm）。</li>
</ol>
4. 物质输注 通过 ICA
<ol>
	<li>组装灌注系统。将一段长约6英寸的毛细管（理想尺寸：2.5 mm × 1.2 mm）连接至含有250 µl待灌注物质（如药物、病原体、细胞外囊泡等）的结核菌素注射器上，并将毛细管尖端轻轻插入步骤3.6中制作的切口。</li>
	<li>继续缓慢推进毛细管，使其到达颈外动脉分叉处与夹闭颈总动脉（CCA）的夹子之间的中点位置。</li>
	<li>结扎下方的颈外动脉（ECA）结。确认结扎松紧适度，既能保证毛细管具有一定活动性，又可防止液体泄漏。</li>
	<li>移除颈内动脉（ICA）上的夹子。</li>
	<li>轻柔地推动注射器活塞，以大约10 µl/秒的速度进行物质灌注。</li>
</ol>
5. 输注后操作步骤
<ol>
	<li>将夹子重新放回颈内动脉（ICA）上。</li>
	<li>轻柔地移除毛细管管路。</li>
	<li>完全结扎远端颈外动脉（ECA）的结。</li>
	<li>移除颈内动脉（ICA）和颈总动脉（CCA）上的夹子。</li>
</ol>
6. 切口关闭与术后护理
<ol>
	<li>移除牵开器或组织钩以及垫枕。</li>
	<li>使用无菌生理盐水清洁缝合区域。</li>
	<li>使用尼龙缝线/缝合针和镊子关闭切口。</li>
	<li>给予抗炎药和镇痛药以缓解术后不适。</li>
	<li>将动物置于放置在加热垫上的笼子中至少1小时，并监测其恢复情况。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).</li>
<li>Frisella, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+recombinant+adeno-associated+virus+improves+cognitive+function+in+a+murine+model+of+mucopolysaccharidosis+type+VII%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII.</a> Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).</li>
<li>Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+growth+and+angiogenesis+around+cortical+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke.</a> Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+methotrexate+to+epidermal+growth+factor+receptor-positive+brain+tumors+by+means+of+cetuximab+%28IMC-C225%29+dendrimer+bioconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates.</a> Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).</li>
<li>Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+in+ischemic+mouse+brain+induced+by+stem+cell-derived+brain+implants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).</li>
<li>Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+biochemical+analysis+of+carrier-mediated+efflux+of+drugs+through+the+blood-brain+and+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+importance+in+the+drug+delivery+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain.</a> J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+gene+delivery+to+the+brain%3A+the+vascular+route%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drug and gene delivery to the brain: the vascular route.</a> Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).</li>
<li>Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+influences+organ-specific+metastasis+of+B16F10+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells.</a> Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).</li>
<li>Huang, R. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+targeted+to+the+brain+using+a+transferrin-conjugated+polyethyleneglycol-modified+polyamidoamine+dendrimer%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer.</a> FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).</li>
<li>Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracarotid+delivery+of+oncolytic+HSV+vector+G47Delta+to+metastatic+breast+cancer+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain.</a> Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).</li>
<li>Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+Selenium+Supplementation+Modulates+Growth+of+Brain+Metastatic+Tumors+and+Changes+the+Expression+of+Adhesion+Molecules+in+Brain+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Trace+Elem+Res%22%5BJournal%5D)">Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels.</a> Biol Trace Elem Res. , (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的输注显微手术已被证明在将具有各种生物学特性的外源性物质递送至中枢神经系统（CNS）方面非常成功，同时可防止其在体内广泛扩散1,12。血脑屏障的破坏是多种中枢神经系统相关疾病的病理特征；因此，评估外源性物质与血脑屏障之间关系具有重要的研究意义和科学价值。
本手术模型对动物造成的创伤较小，且与极低的死亡率相关1,12。此外，该操作不会干扰中枢神经系统功能或脑血流1,12。该手术最关键的步骤是在颈外动脉（ECA）上进行正确切口，切口大小应仅允许毛细管插入。若切口过大，将导致输注物质外漏，从而需要在对侧重新进行ECA手术。为避免此情况，毛细管的直径应大于切口，并应具有锋利的边缘，以利于其进入动脉。从技术层面而言，经过充分培训的人员可...

体内中枢神经系统（CNS）疾病模型需要将外源性物质（如药物、病原体或外泌体）有效递送至大脑。因此，理想的递送方法应对动物造成最小创伤，保持神经网络的完整性，并在大脑中实现较高的物质浓度1。
已有多种局部递送物质的外科手术方法被报道，包括鞘内、脑内和脑室内注射或植入2,3,4,5。然而，这些方法被认为会对中枢神经系统（CNS）造成创伤，且仅能给予少量目标物质。此外，有研究表明，外源性物质可能被脑脊液迅速清除6，且采用上述技术时，物质向脑实质的渗透范围有限7。全身性递送方法（如口服、肺部、皮下和静脉途径）在动物模型中更为常用，但由于其他器官的摄取作用，这些方法将物质递送至中枢神经系统的效率较低8,9。因此，这些递送途径需要使用较高剂量的给药物质，从而增加了副作用和毒性的风险10,11。
本文介绍了一种小鼠输注显微手术技术，该技术可通过颈内动脉直接将物质有效递送至脑内。除了能够靶向中枢神经系统递送外，该技术不会绕过正常的生理屏障，因此与治疗药物或病原体进入脑组织所涉及的生物学过程高度相关。

<table><tbody><tr><td>麻醉仪器</td><td>Vetequip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tool</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>直头手术镊</td><td>Fine Science Tool</td><td>00108-11</td><td></td></tr><tr><td>弯头手术镊</td><td>Fine Science Tool</td><td>00109-11</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>尼龙缝合线</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 104</td><td></td></tr><tr><td>毛细管（Micro-Renathane 0.010&amp;rdquo; x 0.005&amp;rdquo; 每英尺）&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE01050</td><td></td></tr><tr><td>缝合用缝线</td><td>VWR</td><td>95057-036</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>FisherScientific</td><td>50-121-8005</td><td></td></tr></tbody></table>

用于将物质靶向递送至中枢神经系统的 小鼠 微外科灌注技术 通过 颈内动脉

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

中枢神经系统（CNS）疾病及其相关的血脑屏障破坏性疾病的动物模型，通常需要将外源性物质递送至脑组织。这些外源性物质可能引发损伤效应，也可能构成治疗策略的一部分。目前将外源性物质递送至脑内的最常用方法是全身性给药，例如皮下注射或静脉注射。尽管这些方法被广泛使用，但仍存在多种局限性，包括脑内递送效率较低。相比之下，将物质直接局部递送至中枢神经系统的外科方法更具特异性，并可避免其他器官对外源性物质的摄取。目前已有多种用于中枢神经系统递送的外科技术，但这些方法往往具有较高的创伤性。本文介绍一种小鼠灌注显微外科技术，可通过颈内动脉将物质高效递送至脑内，且创伤极小，不会干扰中枢神经系统的正常功能。

本文所述的小鼠输注显微手术技术具有很高的通用性，已用于将不同物质直接递送至大脑，包括在脑转移形成的一个代表性模型中递送肿瘤细胞1,12。
该技术也适用于评估不同病原体在中枢神经系统（CNS）中的病理特征。在一种HIV感染的小鼠模型中，通过输注手术将病毒颗粒直接注入颈总动脉（CCA）。我们发现，术后7天，通过实时PCR检测，中枢神经系统呈HIV阳性。此外，同侧半脑的感染水平比对侧半脑高6-10倍（图2）。
本文所述输注手术的另一种适用方法是将细胞外囊泡（ECVs），主要是外泌体，递送至中枢神经系统。图3显示在输注24小时后，小鼠同侧脑组织中存在携带绿色...

本方案描述了一种小鼠显微外科灌注技术，可通过颈内动脉将物质直接有效地递送至脑内。

中枢神经系统（CNS）疾病及其相关的血脑屏障破坏性疾病的动物模型，需要递送外源性……

该手术技术的总体目标是在不穿透颅骨的情况下，将外源性物质递送至小鼠脑内。该方法有助于解答神经科学领域中关于药物、病原体和外泌体在脑内作用的关键问题。该技术的主要优势在于对动物造成的创伤极小，能够保持神经网络的完整性，并在脑内实现较高的物质浓度。首先，在诱导室中使用异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉。麻醉诱导完成后，将动物转移至体视显微镜下的手术台，并连接鼻罩以维持手术深度的麻醉状态。确保呼吸频率保持在每秒一次至两次，且无喘息现象。此外，确保动物对胡须刺激或脚趾夹捏无反应。使用无菌棉签在每只眼睛上涂抹一滴眼用润滑剂，以防止角膜干燥。用剃刀剃除手术区域的毛发后，使用70%乙醇和氯己定对术区进行消毒处理。在体视显微镜下观察，使用手术剪和镊子从胸骨上方至下颌下方沿中线切开颈部。用镊子仔细分离脂肪和结缔组织，暴露气管。然后将一个直径约0.5厘米的柔软圆形物体置于颈部后方，以伸展颈部并进一步暴露操作区域。接下来，使用钩子或组织牵开器分离气管周围的组织。在气管左侧，小心地用镊子分开结缔组织，以暴露左侧颈总动脉（CCA）。用镊子仔细去除所有结缔组织，暴露颈总动脉起始处分出的颈外动脉和颈内动脉的分叉处。暴露颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）后，用镊子将一段1厘米长的尼龙缝合线置于颈外动脉下方。然后放置第二段1厘米长的缝合线。最后在ECA尽可能高的位置打一个永久结。在颈外动脉（ECA）的最低可能位置、紧邻颈总动脉（CCA）分叉上方，打一个较松的可拆除结。然后使用血管夹在尽可能低的位置夹闭颈总动脉（CCA），并夹闭颈内动脉（ICA）。在颈外动脉上做小切口之前，正确夹闭颈内动脉可防止出血。现在，使用显微解剖弹簧剪在两条结扎线之间的颈外动脉上做一个两毫米的切口。保持切口较小非常重要，因为过大的切口会导致待输注物质泄漏。通过将六英寸的毛细管连接到含有250 µL待输注物质的结核菌素注射器上，组装输注系统。然后将毛细管尖端轻轻插入颈外动脉的切口内。继续推进毛细管尖端，直至其到达颈总动脉分叉处与颈总动脉夹之间中点位置。结扎下方的颈外动脉结。确保结扎松紧适度，既能保持毛细血管通透性，又可防止液体渗漏。随后，移除颈内动脉（ICA）上的夹子。轻柔地推动注射器活塞，以每秒约10 µL的速度注入物质。注入测试物质后，将夹子重新放回颈内动脉（ICA）。轻轻移除毛细管。然后，完全结扎远端颈外动脉（ECA）的结。移除颈内动脉（ICA）和颈总动脉（CCA）上的夹子，然后撤去牵开器或组织钩及垫枕。用无菌生理盐水清洁待缝合区域，随后使用尼龙缝线缝合切口。在给予经批准的抗炎剂和镇痛剂以缓解术后不适后，将动物置于带有加热垫的笼子中至少一小时，并监测其恢复情况。该直方图显示了通过左侧颈内动脉输注病毒七天后，利用实时PCR检测HIV的结果。与预期一致，左侧半脑的病毒水平较高。该免疫荧光图像显示了通过颈内动脉输注细胞外囊泡后，小鼠脑组织切片中GFP标签CD63（一种外泌体标志物）的分布情况。图中绿色显示的表达CD63的细胞外囊泡与小鼠脑微血管相关。若操作熟练，正确实施该技术可在20分钟内完成。该技术问世后，为神经退行性疾病领域的研究人员探索药物、病原体与外泌体在小鼠体内的相互作用开辟了道路。

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神经科学

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随着神经科学研究日益深入，对脑结构和神经回路的探究需要更高的精确度和分辨率。我们开发了一种利用尖端直径为50微米的硼硅酸盐微导管制备和植入脑内慢性输注系统的方法。...

用于持续递送神经活性物质的微型输注系统的构建与植入

来源：Zamboni, M., et al., 通过脑池内注射诱导软脑膜细胞修饰。J. Vis. Exp.

通过小脑延髓池注射在小鼠模型中实现靶向药物递送

来源：Lim, M.，等。通过颈内动脉注射癌细胞建立脑转移模型。J. Vis. Exp.

通过颈内动脉注射癌细胞建立脑肿瘤转移模型

来源： Leda, A. R., 等．通过颈内动脉向中枢神经系统靶向递送物质的小鼠显微外科输注技术．J. Vis. Exp.

通过颈内动脉灌注将物质靶向递送至小鼠脑部

血脑屏障的破坏有助于某些药物向脑部的递送。通过动脉内给予甘露醇可使血管周围细胞收缩，从而在物理上破坏该屏障。...

血脑屏障破坏的大鼠模型以实现靶向性神经血管治疗

脑转移已成为一个迫切且尚未满足的医疗需求，其发病率不断上升，而治疗选择仍局限于姑息治疗。建立脑转移的实验动物模型 通过...

颈内动脉癌细胞注射构建小鼠脑转移模型

本文报道了一种通过小鼠颈总动脉或大鼠颈外动脉在缺血性脑卒中后递送神经干细胞的方法，该方法适用于注射溶液或悬浮液。注射后的细胞广泛分布于脑实质中，并可在递送后长达30天内被检测到。...

向大鼠和小鼠脑内动脉内递送神经干细胞：应用于脑缺血

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。目前大多数脑转移小鼠模型因伴随全身性转移，干扰了对死亡率和治疗干预效果的分析。本文介绍了一种颈内动脉注射癌细胞的方案，可稳定产生颅内肿瘤，同时全身性肿瘤极少。...

通过颈内动脉注射癌细胞建立脑转移模型

在小鼠模型中，颈内动脉注射后对其进行修复可恢复动脉血流，且不会对注射物质的分布产生负面影响。注射部位的修复有利于通过同一条动脉进行后续注射，并可防止在缺乏完整威尔氏环的小鼠品系中发生脑缺血。...

通过一种新型注射位点修复技术实现小鼠模型颈动脉重复注射

本文介绍了一种在轻度卒中模型中利用流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞功能的实验方案。该方法可实现对神经免疫相互作用的详细研究，并可适用于其他神经退行性疾病的探索，从而加深我们对卒中病理过程中免疫应答机制的理解。...

微型中风小鼠模型中神经免疫相互作用的分离与流式细胞术评估

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