一个 体外 研究卡波西肉瘤相关疱疹病毒诱导细胞转化的模型

本实验的总体目标是制备与卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染的内皮细胞在年龄和传代次数上相匹配的模拟感染对照细胞，从而能够在适当的对照条件下研究KSHV感染引起的宿主细胞基因表达变化，包括驱动恶性转化的相关改变。该方法有助于明确KSHV相关癌症发生过程中宿主细胞生物学的关键病理生理变化，进而发现可用于疾病预防或治疗的新型治疗靶点。该体系的主要优势在于，KSHV感染后内皮细胞的恶性转化过程发生迅速且可重复，因此可利用在年龄和传代次数上相匹配的对照细胞，对肿瘤发生早期事件进行研究。

尽管这种病毒致癌模型有助于深入了解卡波西肉瘤的发展，但它也可应用于其他类型的癌症研究。由于卡波西肉瘤是一种血管性肿瘤，该细胞培养模型的意义还可延伸至对其他由病理性血管生成驱动的疾病过程的理解。首先，按照文本方案中的描述制备并过滤灭菌的TNE缓冲液。

然后将溶液保存在4°C。在装有60毫升RPMI培养基的T150培养瓶中培养KSHV阳性、EBV阴性的原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1。在37°C、5%二氧化碳条件下维持细胞培养，以获得浓度约为1至1.2 × 10⁶个细胞/毫升的细胞悬液。

当细胞达到适当密度后，用新鲜培养基按1:2比例传代，并加入PMA至终浓度为20纳克/毫升，以诱导KSHV病毒的产生。随后将培养物在37℃孵育5天。孵育5天后，通过在室温下以300 × g离心5分钟收集病毒颗粒。

然后将上清液转移至新离心管中。在4°C条件下，以2,500 × g离心上清液10分钟，以去除细胞碎片。澄清后，在6支超速离心管中，将约30毫升上清液缓慢铺加到5毫升25%蔗糖溶液（溶于TNE缓冲液）之上。

将平衡好的离心管在4°C、真空条件下以75,000 × g离心两小时。离心完成后，倾倒上清液，并用吸水纸擦拭每个离心管的管口边缘，尽可能去除残留液体。随后，将沉淀的病毒颗粒重悬于150 µL TNE缓冲液中，并合并所有样品。

充分混匀混合后的悬液，并将其分装为每份25 µL。将病毒原液于-80 °C保存。在T75培养瓶中，使用EGM培养基培养原代人皮肤微血管或淋巴管内皮细胞。

将细胞培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞融合度达到约50%。在内皮细胞转导前，将PA317 LXSN 16E6E7细胞接种于T150细胞培养瓶中，加入20毫升DMEM，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。当细胞融合度达到约90%时，弃去PA317细胞培养液，更换为16毫升新鲜培养基，继续孵育过夜。

在过夜孵育后，收集PA317细胞培养的培养基，并在室温下以300 × g离心5分钟以澄清。将50%汇合度的内皮细胞培养中的EGM培养基更换为12毫升澄清后的PA317培养基。将细胞孵育4小时。

然后将 PA317 培养基中的 6 毫升更换为 6 毫升新鲜的 EGM 培养基，并将细胞在其中过夜培养。随后，移除内皮细胞培养中的培养基，并向细胞中加入 12 毫升新鲜 EGM 培养基进行换液。继续将细胞额外培养 48 小时。

传代培养内皮细胞时，先移除培养基，并用12毫升无阳离子的PBS洗涤细胞。然后加入3毫升商品化的酶解离溶液，在37摄氏度孵育3分钟。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，在室温下以300 × g离心5分钟。

离心成团后，将细胞重悬于新鲜的EGM培养基中，并将悬液等量分装至三个T75培养瓶中。每瓶培养液体积调整为12毫升EGM。然后加入G418至终浓度为200微克/毫升，以筛选转导的内皮细胞。

通过酶消化法收获转导的内皮细胞，方法如前所述。将内皮细胞沉淀重悬于 1 毫升 EGM 培养基中。然后取 5 微升细胞悬液与 45 微升台盼蓝溶液混合，使用血细胞计数板计数活细胞。

每孔加入2.5 × 10⁵个活细胞接种于六孔板中，每孔含2 mL EGM培养基。次日，吸去EGM培养基，用3 mL含钙镁的PBS洗涤每孔细胞，然后每孔加入2 mL EBM培养基。

为了用KSHV感染细胞，向每个孔中加入5至20微升病毒储备液，并轻轻摇动培养板以混匀悬液。向含有模拟感染细胞的每个孔中加入等体积的TNE缓冲液。在室温下以400 × g离心30分钟后，将培养板在37摄氏度下孵育90分钟。

然后向每个孔中加入 2 mL EGM 培养基，将培养物置于培养箱中过夜。孵育结束后，吸去每个孔中的 EGM 培养基，并更换为 2 mL 新鲜的 EGM 培养基。当细胞融合度达到约 90% 时，通过酶消化法收集细胞，操作步骤如前所述。

将三个孔中的细胞汇集至一个T75培养瓶中，培养瓶上标注感染后总传代次数。在进行检测或冻存之前，将模拟感染和KSHV感染的内皮细胞培养物按1:3比例传代，至少再扩增两代。图中展示的是汇合的模拟感染内皮细胞的显微图像，呈现出典型的鹅卵石样形态。

当培养达到汇合状态时，这些细胞在接触后其细胞分裂受到抑制。KSHV感染的内皮细胞会发展出细长的纺锤形形态，类似于卡波西肉瘤的纺锤细胞。与模拟感染的细胞不同，KSHV感染的内皮细胞即使在达到汇合状态后仍持续增殖，从而形成多层细胞灶。

当失去与基质的接触时，模拟感染的内皮细胞会发生凋亡性细胞死亡（即失巢凋亡），并且无法在软琼脂中形成克隆。相反，KSHV感染的细胞对失巢凋亡具有抗性，并能在软琼脂培养中形成生长克隆。KSHV感染的内皮细胞呈现纺锤形形态的变化，伴随病毒潜伏期蛋白ORF73的表达，以及较弱程度的病毒进程性因子ORF59的表达。

当内皮细胞感染了带有绿色荧光蛋白标记的KSHV BAC16后，细胞呈现出纺锤形形态，并表现出GFP表达，从而证实了KSHV感染与所观察到的表型之间的因果关系。该细胞培养模型建立后，为研究人员评估KSHV感染所诱导的宿主细胞mRNA和蛋白质表达改变提供了途径。因此，已鉴定出若干介导KSHV致癌作用的关键致病机制，这些机制代表了具有前景的治疗靶点。

请注意，KSHV 是一种 BSL-2 级病原体，应采用适当的生物安全防护程序和操作规范进行处理。