Name: 一种用于研究卡波西肉瘤细胞转化的体外模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解KSHV感染诱导内皮细胞恶性转化的体外模型，用于研究卡波西肉瘤发病机制。该方法通过年龄和代次匹配的对照，快速可重复地模拟病毒致癌过程，有助于识别新型治疗靶点。

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本工作由 K12 HD068322（SCM）；R01 CA179921 和 P51 OD011092（AVM）；以及美国心脏协会资助项目 14PRE20320014（SB）支持。

注意：本方案中描述的所有操作均应在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。
1. KSHV 毒株制备
<ol>
	<li>配制 TNE 缓冲液：将 292.24 mg EDTA 溶于 ddH2O 中，定容至 225 mL，并调节 pH 至 8。将 605.7 mg Tris 溶于 ddH2O 中，定容至 225 mL，并调节 pH 至 8。将 EDTA 溶液与 Tris 溶液混合，加入 4.38 g NaCl，最终定容至 500 mL，过滤除菌后于 4 °C 保存。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中，使用添加了 10% 热灭活胎牛血清（FBS）和抗菌剂的 RPMI 培养基，将 KSHV 阳性、EBV 阴性的原发性渗出性淋巴瘤细胞系 BCBL-1 培养至浓度约为 1 至 1.2 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>为诱导 KSHV 产生，将细胞培养物以 1:2 比例传代至新鲜培养基中，并加入佛波醇 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA），使其终浓度为 20 ng/mL，继续培养 5 天。作为替代方案，也可用丁酸钠（NaB；0.1 mM）处理细胞 3 天，以诱导病毒裂解性复制。</li>
	<li>收集病毒颗粒时，首先将培养上清在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞，然后将上清转移至新离心管中。</li>
	<li>为进一步澄清上清，避免细胞碎片的转移，在 4 °C 下以 2,500 × g 离心 10 分钟。 
	注意：作为高速离心澄清培养上清的替代方法，可通过无菌 0.45 µm 滤膜进行过滤。我们观察到使用过滤法会导致滴度显著下降；因此，常规采用第二次离心步骤。</li>
	<li>接下来，在 6 支超速离心管中，将约 30 mL 经澄清的培养上清液小心铺加在 5 mL 25% 蔗糖溶液（溶于 TNE 缓冲液）之上。</li>
	<li>将已平衡的离心管在 4 °C 下真空条件下以 75,000 × g 离心 2 小时。</li>
	<li>弃去上清液，用吸水纸轻轻擦拭管口边缘，尽可能去除残留的上清液和蔗糖溶液，然后将可能不可见的病毒沉淀重悬于 150 µL TNE 缓冲液中。</li>
	<li>合并所有重悬的病毒液，充分混匀后，分装为每份 25 µL，于 -80 °C 冻存。</li>
</ol>
2. 使用 E6 和 E7 乳头瘤病毒基因转导内皮细胞
注意：我们常规使用标准组织培养瓶来培养原代内皮细胞。然而，如果内皮细胞生长状况不理想，则应考虑使用商用培养瓶。
<ol>
	<li>在含有内皮细胞生长培养基（EGM；包含补充了EGM-2 BulletKit [含胎牛血清、氢化可的松、人成纤维细胞生长因子-B、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、抗坏血酸、人表皮生长因子、抗生素和肝素] 的内皮细胞基础培养基[EBM]）的T75细胞培养瓶中，将原代人皮肤微血管或淋巴管内皮细胞（EC）置于37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养至约50%汇合度。</li>
	<li>用于转导时，将PA317 LXSN 16E6E7细胞24,35在添加了10%胎牛血清（FBS）和抗菌剂的DMEM培养基中，于T150细胞培养瓶中置于37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养至约90%汇合度。随后在16 mL培养基中过夜孵育。</li>
	<li>通过在室温下以300 x g离心5分钟澄清PA317培养基。</li>
	<li>移除内皮细胞培养中的EGM，加入12 mL澄清后的PA317培养基覆盖细胞，并孵育4小时。 
	注意：将16 mL条件培养基在300 x g下离心5分钟可形成紧密沉淀，便于小心移除12 mL澄清上清液而不扰动沉淀。然而，若担心PA317 LXSN 16E6E7细胞被转移至原代内皮细胞培养物中（包装细胞系会迅速超过内皮细胞生长），可在转移前通过0.45 µm滤膜过滤条件上清液。</li>
	<li>将6 mL PA317培养基更换为新鲜EGM，并过夜孵育。</li>
	<li>用12 mL新鲜EGM重新换液，并继续孵育48小时。</li>
	<li>传代内皮细胞时，移除培养基，用12 mL无阳离子的PBS洗涤一次，然后加入3 mL商品化的酶解解离溶液（例如，TrypLE），于37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，在室温下以300 x g离心5分钟。将所得细胞沉淀重悬于新鲜EGM中，并均等地分种至3个T75培养瓶中，每瓶最终体积为12 mL EGM。</li>
	<li>为筛选成功转导E6和E7的内皮细胞，加入G418至终浓度为200 µg/mL，持续两个传代周期。此后，转导后的内皮细胞可用于感染实验或在液氮中冻存。</li>
</ol>
3. KSHV 感染经转导的 EC 细胞
<ol>
	<li>感染前一天，使用上述商品化酶解离溶液通过酶消化法收获内皮细胞。将细胞沉淀重悬于1 mL EGM培养基中。取5 µL细胞悬液，用台盼蓝稀释至1/10。使用血细胞计数板计数活细胞，并接种2.5 × 10⁵个细胞5 6 孔板中每孔加入 2 mL EGM 培养基培养活细胞。</li>
	<li>感染当天，移除EGM，每孔加入3 mL含钙镁的PBS洗涤细胞，然后每孔加入2 mL EBM。 
	注意：感染过程中必须使用EBM而非EGM，因为EGM中的肝素会抑制病毒颗粒与靶向内皮细胞的结合及其后续感染。</li>
	<li>用KSHV感染细胞时，向每孔加入5至20 µL病毒储备液，轻轻摇动培养板以混匀。对于模拟感染的细胞，向每孔加入等体积的TNE缓冲液。</li>
	<li>将板在室温下以 400 x g 离心 30 分钟，然后在 37 °C 下孵育 90 分钟。</li>
	<li>如果研究目的是探讨需要同步病毒感染的早期事件， 例如，细胞活动的早期事件 从头合成 感染后，此时移除病毒接种液，用 2 mL 新鲜 EGM 洗涤并重新换液。否则，加入 2 mL EGM，继续培养过夜。</li>
	<li>感染后次日用 2 mL EGM 为细胞换液，之后每隔一天换液一次。</li>
	<li>当细胞融合度达到约90%时，使用上述商品化酶解离溶液通过酶消化法收集细胞，然后将三个孔中的细胞合并至T75培养瓶中，记录总传代次数及感染后传代次数。</li>
	<li>以1:3比例传代培养模拟感染和KSHV感染的EC，至少再传代两次，此后细胞可用于实验或在液氮中冻存。 
	注意：与转导了 E6 和 E7 的内皮细胞（EC）的传代类似，模拟感染和 KSHV 感染细胞的维持培养物应在达到汇合前进行传代（约 85% 至 90%）。</li>
</ol>
4. 通过免疫荧光确认 KSHV 感染
注意：检测卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）潜伏相关核抗原（LANA-1/ORF73）可提供可靠的感染定量指标。抗-LANA 抗体可商业获得。
<ol>
	<li>染色前一天，将模拟感染或KSHV感染的EC细胞分别接种于24孔板中，每组两孔，每孔加入1 mL EGM培养基，细胞密度为1 × 105 个/孔，过夜培养。</li>
	<li>用500 µL含钙和镁的PBS洗涤细胞两次，每次在摇床上轻摇洗涤30秒。</li>
	<li>在带有外部排风的通风橱中，加入500 µL 4%多聚甲醛，室温固定细胞15分钟。</li>
	<li>用500 µL洗涤缓冲液（含0.1% Triton X-100和0.02%羊血清的含阳离子PBS）洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入500 µL含2%羊血清的洗涤缓冲液，室温封闭细胞30分钟。</li>
	<li>用500 µL洗涤缓冲液洗涤细胞三次。</li>
	<li>将模拟感染或KSHV感染的一孔细胞加入200 µL用洗涤缓冲液按1:100稀释的一抗，室温摇床上孵育30分钟；其余两孔仅加入200 µL洗涤缓冲液，作为对照。</li>
	<li>用500 µL洗涤缓冲液洗涤细胞三次。</li>
	<li>向所有四个孔中各加入200 µL用洗涤缓冲液按1:100稀释的二抗，室温摇床上孵育30分钟。</li>
	<li>用500 µL洗涤缓冲液洗涤细胞三次。</li>
	<li>每孔加入20 µL含DAPI的封片剂，并加盖盖玻片，使用倒置荧光显微镜观察染色结果。</li>
	<li>通过计数至少200个细胞中LANA阳性细胞核的数量，计算KSHV感染率。使用重组KSHV-Bac16感染时，也可通过观察GFP表达情况来监测感染效果。</li>
</ol>

肿瘤发生是一个多步骤过程，可规避机体内的关键保护机制36由于卡波西肉瘤（KS）病变存在于从慢性炎症到真正肉瘤的连续谱系中，阐明由KSHV介导的某些病理生理过程需要在支持转化的细胞培养模型中开展部分研究。9需要注意的是，接触抑制丧失和锚定依赖性生长能力的缺失（表明细胞转化的表型）在感染原代内皮细胞或通过外源性表达端粒酶而永生化的内皮细胞后，并不会轻易出现。因此，尽管 体外 此处描述的卡波西肉瘤（KS）模型虽不能完全重现KS肿瘤微环境的全部特征或离体KS细胞的行为，但特别适用于研究KSHV感染所诱导的宿主细胞基因表达变化，这些变化参与了KS的肿瘤发生过程。
首个采用本文所述培养系统进行的基因表达谱研究发现，受体酪氨酸激酶c-Kit参与了KSHV感染细胞转化表型的形成25。通过siRNA敲低c-Kit表达，或使用显性负性构建体或酪氨酸激酶抑制剂STI 571（伊马替尼）抑制c-Kit信号通路，均可干扰KSHV的转化能力，表现为感...

卡波西肉瘤（KS）是一种多灶性血管增殖性肿瘤，常累及皮肤、黏膜及内脏部位，多发生于严重免疫抑制的情况下1。目前已描述四种流行病学类型：经典型，一种惰性类型，通常影响地中海和中东血统的老年人；医源性型，由器官移植后使用免疫抑制药物引起；流行性型，即定义艾滋病的癌症类型；以及地方性型，为非洲流行地区儿童中常见的、与HIV无关的类型。随着高效联合抗逆转录病毒药物治疗方案的出现，流行性KS在发展中国家的诊断率已显著降低。然而，临床表现具有侵袭性的地方性型和流行性型仍然是许多非洲国家最常见的癌症之一2,3,4。因此，识别针对KS发病机制的有效药物已成为一项重要的研究优先方向。
从组织学上看，卡波西肉瘤（KS）病灶的特征是广泛但异常的新生血管形成，即来源于内皮细胞（EC）的梭形细胞形成不连续的血管网络5。这些异常血管（&#34;血管裂隙&#34;）可导致红细胞外渗，从而使病灶呈现其特有的颜色。此外，病灶中含有大量表征慢性炎症的白细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞）。已有研究报道，在免疫重建后KS病灶可发生消退，提示KS兼具过度增生性病灶和真正肿瘤的特征6,7,8,9。
卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），即卡波西肉瘤的致病因子，于1994年被发现10此后，许多 体外 已开发出细胞培养模型以支持发病机制研究，包括从肿瘤活检组织中分离的细胞，以及被KSHV感染的原代或表达端粒酶的EC细胞 体外11,12,13,14,15,16,17,18目前尚无任何可用的模型能够完全重现卡波西肉瘤的肿瘤微环境，但所有这些模型均已为我们理解KSHV感染的病理生物学提供了宝贵的知识。与另一种已知的致瘤性人疱疹病毒——EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）不同，KSHV在体外培养中难以直接转化细胞。 从头合成 感染19,20,21,22然而，这一局限性已通过在感染KSHV之前，将人乳头瘤病毒16型的E6和E7基因转导至混合微血管或淋巴管来源的原代人内皮细胞中而得以克服。23,24这些外源性癌基因的表达显著增强了KSHV的转化潜能 体外 部分通过进一步抑制视网膜母细胞瘤蛋白和p53实现23,24该内皮细胞转导方法已使多个实验室能够鉴定出由KSHV感染诱导的宿主细胞基因表达的关键改变，这些改变似乎有助于卡波西肉瘤细胞的存活与增殖。25,26,27,28,29,30,31,32本文所述方案简明且高度可重复，可获得与传代次数相匹配的KSHV感染内皮细胞及模拟感染对照细胞。这些细胞的培养寿命远长于原代细胞，可用于研究KSHV所采用的致癌机制。尽管本方案包含从原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1中产生野生型KSHV的方法，但E6/E7永生化的内皮细胞对重组BACmid来源的KSHV-BAC16也具有高度感染敏感性。30BAC16的制备方案在其他文献中有详细描述33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 细胞</td><td>NIH 艾滋病试剂项目</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>新生儿真皮微血管内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>抗 KSHV LANA/ORF 73 抗体</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;Express，无酚红</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含钙和镁的 PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一个 体外 研究卡波西肉瘤相关疱疹病毒诱导细胞转化的模型

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

卡波西肉瘤（KS）是一种罕见的肿瘤，由增殖的梭形细胞构成，由KSHV感染内皮细胞（EC）引发，最常在免疫抑制状态下发生。尽管已有数十年的研究，KS的最佳治疗方案仍不明确，且在资源有限的环境中临床预后尤其不良。KS病灶的发生由病理性血管生成、慢性炎症及肿瘤发生共同驱动，且涉及多种因素 体外 已开发出细胞培养模型以研究这些过程。卡波西肉瘤（KS）起源于感染KSHV的内皮来源细胞，因此内皮细胞系（EC-lineage cells）提供了最合适的模型 体外 纺锤形细胞前体的替代物。然而，由于EC具有有限的 体外 寿命，由于KSHV所采用的致癌机制相较于其他致瘤病毒效率较低，因此在原代或端粒酶永生化的内皮细胞（EC）中评估转化过程一直存在困难。因此，研究人员开发了一种新型的基于EC的培养模型，该模型可有效支持KSHV感染后的细胞转化。通过异位表达人乳头瘤病毒16型（HPV-16）的E6和E7基因，能够实现年龄和传代次数相匹配的模拟感染与KSHV感染EC的长期培养，并支持感染细胞培养物中真正转化表型（即致瘤性表型）的形成。这一易于操作且高度可重复的卡波西肉瘤（KS）模型，已促进多个关键信号通路的发现，具有较高的临床转化潜力。

原代内皮细胞（EC）的形态通常被描述为“铺路石样”，而乳头瘤病毒E6和E7基因的表达并不会改变这种形态（图1A）。单独表达E6和E7基因不会诱导转化表型；因此，细胞仍对接触抑制敏感，在培养中达到汇合时会停止增殖。然而，当细胞经胰蛋白酶消化并以较低密度重新接种后，仍可继续增殖并再次生长至汇合，从而可维持与实验组年龄和传代次数相匹配的培养体系，作为模拟感染的对照组使用。
用 KSHV 感染经 E6/E7 转导的内皮细胞（EC），可在体外培养中引起显著的形态学改变，类似于卡波西肉瘤（KS）病灶中观察到的“梭形细胞”表型（图 1B）。KSHV 感染还可诱导细胞出现转化表型，部分表现为细胞在达到汇合后失去接触抑制（图 1C），并在软琼脂中表现出锚定非依赖性生长（图 2）。在肿瘤发生过程中，失去接触抑制以及对细胞外基质相互作用（锚定）的依赖性，是细胞转化的两个典型...

卡波西肉瘤（KS）是一种由致癌病毒人类疱疹病毒8型/卡波西肉瘤相关疱疹病毒（HHV-8/KSHV）感染引起的肿瘤。此处描述的内皮细胞培养模型特别适用于研究KSHV转化宿主细胞的机制。

卡波西肉瘤（KS）是一种由增殖的梭形细胞构成的罕见肿瘤，由内皮细胞（EC）感染KSHV后引发，且……

本实验的总体目标是制备与卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染的内皮细胞在年龄和传代次数上相匹配的模拟感染对照细胞，从而能够在适当的对照条件下研究KSHV感染引起的宿主细胞基因表达变化，包括驱动恶性转化的相关改变。该方法有助于明确KSHV相关癌症发生过程中宿主细胞生物学的关键病理生理变化，进而发现可用于疾病预防或治疗的新型治疗靶点。该体系的主要优势在于，KSHV感染后内皮细胞的恶性转化过程发生迅速且可重复，因此可利用在年龄和传代次数上相匹配的对照细胞，对肿瘤发生早期事件进行研究。尽管这种病毒致癌模型有助于深入了解卡波西肉瘤的发展，但它也可应用于其他类型的癌症研究。由于卡波西肉瘤是一种血管性肿瘤，该细胞培养模型的意义还可延伸至对其他由病理性血管生成驱动的疾病过程的理解。首先，按照文本方案中的描述制备并过滤灭菌的TNE缓冲液。然后将溶液保存在4°C。在装有60毫升RPMI培养基的T150培养瓶中培养KSHV阳性、EBV阴性的原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1。在37°C、5%二氧化碳条件下维持细胞培养，以获得浓度约为1至1.2 × 10⁶个细胞/毫升的细胞悬液。当细胞达到适当密度后，用新鲜培养基按1:2比例传代，并加入PMA至终浓度为20纳克/毫升，以诱导KSHV病毒的产生。随后将培养物在37℃孵育5天。孵育5天后，通过在室温下以300 × g离心5分钟收集病毒颗粒。然后将上清液转移至新离心管中。在4°C条件下，以2,500 × g离心上清液10分钟，以去除细胞碎片。澄清后，在6支超速离心管中，将约30毫升上清液缓慢铺加到5毫升25%蔗糖溶液（溶于TNE缓冲液）之上。将平衡好的离心管在4°C、真空条件下以75,000 × g离心两小时。离心完成后，倾倒上清液，并用吸水纸擦拭每个离心管的管口边缘，尽可能去除残留液体。随后，将沉淀的病毒颗粒重悬于150 µL TNE缓冲液中，并合并所有样品。充分混匀混合后的悬液，并将其分装为每份25 µL。将病毒原液于-80 °C保存。在T75培养瓶中，使用EGM培养基培养原代人皮肤微血管或淋巴管内皮细胞。将细胞培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞融合度达到约50%。在内皮细胞转导前，将PA317 LXSN 16E6E7细胞接种于T150细胞培养瓶中，加入20毫升DMEM，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。当细胞融合度达到约90%时，弃去PA317细胞培养液，更换为16毫升新鲜培养基，继续孵育过夜。在过夜孵育后，收集PA317细胞培养的培养基，并在室温下以300 × g离心5分钟以澄清。将50%汇合度的内皮细胞培养中的EGM培养基更换为12毫升澄清后的PA317培养基。将细胞孵育4小时。然后将 PA317 培养基中的 6 毫升更换为 6 毫升新鲜的 EGM 培养基，并将细胞在其中过夜培养。随后，移除内皮细胞培

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种用于研究卡波西肉瘤细胞转化的体外模型

宿主细胞因子在卡波西肉瘤（KS）的发生和维持过程中起着关键作用。我们概述了鉴定在KSHV感染的DMVEC细胞及KS肿瘤组织中发生改变的宿主细胞因子的方法。病毒所改变的细胞基因可作为新型治疗手段的潜在靶点。...

鉴定卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）诱导的失调基因

我们描述了一种用于鉴定宿主信号分子在模式疱疹病毒——γ疱疹病毒68（γHV68）裂解性复制中关键作用的实验方案。通过利用基因修饰小鼠品系和胚胎成纤维细胞进行γHV68的裂解性复制，该方案可同时实现对病毒-宿主相互作用的表型特征分析和分子水平研究。...

解析模型疱疹病毒裂解复制中的宿主-病毒相互作用

本文描述了一种在活细胞中观察单个DNA分子的方法。该技术基于荧光标记的lac阻遏蛋白与已构建到目的DNA上的结合位点之间的结合。此方法可被用于在活细胞中随时间追踪多种重组DNA。...

通过荧光显微镜在活体哺乳动物细胞中监测质粒在多个世代中的复制

来源：McAllister, S. C., Hanson, R. S., 等．一种用于研究卡波西肉瘤相关疱疹病毒诱导细胞转化的体外模型．J. Vis. Exp.(2017)本视频展示了利用HPV16...

通过逆转录病毒转导病毒癌基因使内皮细胞永生化

我们描述了一种用于检测感染了模型疱疹病毒——小鼠γ疱疹病毒68（murine gammaherpesvirus 68, MHV-68）的小鼠体内抗病毒细胞因子产生的实验方案。γHV68），该病毒与人类卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和EB病毒（EBV）密切相关。利用基因修饰的小鼠品系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），我们评估了抗病毒细胞因子的产生情况 体内 和...

解析病毒逃逸细胞因子产生过程中的天然免疫信号传导

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。...

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

我们介绍一种利用荧光原位杂交（FISH）技术在裂解感染的人类细胞中可视化多种疱疹病毒RNA的实验方案，适用于悬浮或贴壁细胞。该方案包含荧光信号的定量分析，以生成核质比，并可扩展用于通过免疫荧光（IF）同时可视化宿主和病毒蛋白。...

KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

本方案描述了建立荷瘤小鼠模型，通过双荧光素酶成像实时监测肿瘤进展和血管生成的方法。...

双生物发光成像监测肿瘤进展与血管生成

本方案提供了用于评估人乳腺细胞转化的体外实验工具。文中详细描述了检测细胞增殖速率、非贴壁依赖性生长能力，以及在含有基底膜基质的三维培养中细胞谱系分布的实验步骤。...

人乳腺上皮细胞中癌基因转化的体外评估

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