扩大奈米基材使用缝合技术的细胞行为Nanotopographical调制

该程序的总体目标是通过使用简单且经济实惠但用途广泛的缝合技术，从小型纳米图案模具中生产大面积的纳米图案基板。该方法可以帮助研究底物纳米拓扑结构在细胞和分子水平上对细胞表型和功能的调节，例如黏着斑蛋白的表达。这种技术的主要优点是简单且具有成本效益。

首先，在 PDMS 预聚物中准备硅烷化硅模具，如文本协议中所述。将硅烷化硅模具放入 60 毫米培养皿中。将 PDMS 预聚物倒在培养皿中的硅模具上。

将培养皿放入塑料干燥器中，脱气约 10 分钟，直到所有气泡消失。将培养皿转移到热板上，并在 70 摄氏度下固化 PDMS 预聚物 4 小时。使用镊子小心地将 PDMS 模具从硅模具上剥离。

在光学显微镜下确定各向异性 PDMS 纳米图案（例如纳米光栅）的方向，并用记号笔在 PDMS 模具的背面标记。在通风橱中用乙醇清洁硅衬底，然后用压缩空气干燥。用刀片修剪每个 PDMS 模具的无图案区域。

PDMS 模具应尽可能靠近对齐，但不要接触周围的模具，以最大限度地减少未图案区域，并避免在施加压缩力时接触纳米图案变形。将修剪过的 PDMS 模具与纳米图案面朝下放在硅衬底的镜子侧，然后将其他模具靠近但不接触周围的模具对齐。尝试在基底层固化 PDMS 至关重要，因为未固化的 PDMS 可能会流过多个模具之间的间隙并损坏纳米图案。

然而，完全固化的 PDMS 无法将多个模具粘合在一起。要制备 PDMS 粘合剂层，请将 1 克脱气的 PDMS 预聚物浇铸在干净的载玻片上，形成 0.5 毫米厚的层。将 PDMS 层在 100 摄氏度的热板上烘烤 3 到 5 分钟。

用针接触该层，并确保该层部分固化，但未完全固化。将 PDMS 层放在对齐的 PDMS 模具的背面，快速反转此组件，并将其转移到热板上。在组件顶部使用金属块施加压缩力，以确保 PDMS 粘合剂层与 PDMS 模具背面之间具有良好的接触。

在 100 摄氏度下固化 PDMS 胶粘剂层 1 小时。关闭热板，取下金属块，然后从硅衬底上撕下单缝合 PDMS 模具。要将缝合的 PDMS 模具纳米压印到 PS 板中，请将 PS 板放入 3 英寸硅片上的铝垫片中。

将 PS 板放在热板上以 250 摄氏度加热 30 分钟。然后，将缝合的 PDMS 模具（纳米图案面朝下）放在熔融的 PS 板上。接下来，将铝板放在缝合的 PDMS 模具的载玻片上。

在铝板上使用金属块施加压缩压力，然后等待三分钟。从铝板上提起并更换金属块，并将压缩压力增加到 25 千帕。然后，重复此步骤，将压力增加到 50 千帕。

将热板的温度保持在 240 到 250 摄氏度之间，并持续 50 千帕斯卡 15 分钟。关闭热板，并冷却整个设置。温度低于 50 摄氏度后取下金属块，小心地从 PS 板上剥离缝合的 PDMS 模具。

要将 PDMS 模具纳米压印在 PS 薄膜上，请将具有纳米拓扑结构的缝合 PDMS 模具面朝下放置在热板上的 PS 薄膜上。通过在 PDMS 模具的玻璃载玻片上使用金属块，在 PDMS 模具上施加 12 千帕的压缩压力。将热板的温度提高到 180 摄氏度，并保持 15 分钟。

关闭热板，并冷却整个设置。温度降至 50 摄氏度以下后，取下金属块，然后小心地从 PS 薄膜上撕下缝合的 PDMS 模具。使用空心钢拱形冲头，将纳米图案化的 PDMS 衬底切割成圆盘，以适应特定多孔板的配置。

然后，使用镊子将 PDMS 圆盘放入多孔板的孔中。使用 70% 乙醇对 PDMS 底物消毒 30 分钟。然后，吸出乙醇，然后用紫外线照射 30 分钟。

用 1X 无菌磷酸盐缓冲盐水洗涤 PDMS 底物 3 次。接下来，在室温下用细胞外基质蛋白包被 PDMS 底物 30 分钟。用无菌 PBS 冲洗 PDMS 底物 3 次，每次 5 分钟。

将人 A549 肺癌细胞悬浮在含 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。以每平方厘米 2， 000 个细胞的接种密度将细胞接种在 PDMS 底物上。将细胞在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的潮湿环境中培养一天，然后观察它们。

此处显示了 PS 板上生成的纳米图案和薄膜。箭头表示缝合的 PDMS 模具缝隙中的聚合物凸起。这些 SEM 图像表明，通过应用拼接技术，PDMS 工作基板是从电子束光刻写入的纳米图案中忠实地转移的。

此处显示了在纳米格栅和纳米柱上生长的 A549 细胞的代表性 SEM 图像。细胞在纳米格栅上显示对齐的细胞形态，而细胞在纳米柱上随机分布。看完这个视频后，你应该对如何通过缝合多个小的、定义的纳米图案模具来生成大面积的纳米图案基板有很好的了解。

不要忘记，与甲苯和多聚甲醛一起工作可能非常危险，并且在执行程序时请始终佩戴适当的个人防护设备。