Name: 乙型肝炎病毒记者系统的开发监控复制周期的早期阶段 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 了解乙型肝炎病毒报告系统的开发与应用，用于监测HBV复制周期的早期阶段。该方法利用HepG2细胞系实现高通量筛选抗HBV药物，为病毒学研究和抗病毒治疗开发提供高效工具。

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本工作部分由日本医疗研究开发机构（AMED）的肝炎研究计划以及日本文部科学省（MEXT）的科学研究费补助金资助。

1. 编码报告蛋白的重组乙型肝炎病毒的制备
<ol>
	<li>HepG2 细胞的准备
	<ol>
		<li>准备细胞培养基（DMEM 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 100 U/ml 非必需氨基酸）。</li>
		<li>转染前一天，将 4 × 106 个 HepG2 细胞接种于含 10 ml 培养基的 10 cm 胶原包被培养皿中。将 HepG2 细胞在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育。 
		注意：当在 10 cm 胶原包被培养皿中接种约 4 × 106 个 HepG2 细胞并加入 10 ml 培养基时，次日细胞融合度可达 70–90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染
	<ol>
		<li>使用转染试剂，按照制造商说明书，将 5 µg pUC1.2HBV delta epsilon15 和 5 µg pUC1.2HBV/NL15 转染至 HepG2 细胞中。</li>
		<li>次日，移除培养基，并加入 10 ml 新鲜培养基。</li>
		<li>转染一周后，将含有重组 HBV 的培养基转移至 50 ml 离心管中，并进行步骤 1.3.1。向转染细胞的培养皿中加入 10 ml 新鲜培养基。 
		注意：重组 HBV 的产生可持续 4 周。含有重组 HBV 的培养基可在 4 °C 下保存 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重组 HBV 的纯化
	<ol>
		<li>通过离心（2,300 × g，4 °C，5 分钟）去除含重组 HBV 的培养基中的细胞碎片。</li>
		<li>将上清液通过 0.45 µm 膜滤器过滤。</li>
		<li>向含重组 HBV 的培养基中加入等体积的 26% PEG/1.5 M NaCl 溶液（聚乙二醇 6000：130 g，NaCl：49 g，0.5 M EDTA pH 8.0 1 ml，1 M HEPES pH 7.6 5 ml，加水至 500 ml），轻轻混匀。4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>在 4 °C 下以 2,300 × g 离心 20 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀溶解于 0.5 ml TNE 缓冲液（10 mM Tris，50 mM NaCl，1 mM EDTA）中。</li>
		<li>以 2,300 × g 离心 5 分钟，去除残留碎片。</li>
		<li>将含重组 HBV 的 0.5 ml TNE 溶液加至 0.8 ml 20% 蔗糖（溶于 TNE）上层。</li>
		<li>在 15 °C 下以 100,000 × g 离心 3 小时。</li>
		<li>尽可能弃去上清液，保留沉淀。每 40 ml 初始培养基所得样品，用 1 ml 无血清 DMEM 重悬沉淀。</li>
		<li>4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>通过 0.45 µm 滤器过滤。分装为 0.5 ml 每份，于 -80 °C 保存。 
		注意：若原始病毒样品中存在报告蛋白污染，可通过在 TNE 中进行 5–30% 蔗糖密度梯度超速离心（100,000 × g，2 小时）或 CsCl 密度平衡离心（密度 1.1–1.6 g/ml，150,000 × g，50 小时）进一步纯化病毒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 重组HBV的感染
<ol>
	<li>在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、250 µg/ml G-418和100 U/ml非必需氨基酸的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养可被乙型肝炎病毒（HBV）感染的稳定表达NTCP的HepG2细胞（HepG2/NTCP）15。</li>
	<li>感染前一天，将约5 × 104个HepG2/NTCP细胞14接种至96孔胶原包被板中，每孔加入0.1 ml培养基。</li>
	<li>将重组HBV置于37 °C水浴中解冻，直至管内仅剩少量冰晶。</li>
	<li>按以下组分配制每孔感染用培养基：10 µl 40% PEG8000溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，2 µl二甲基亚砜（DMSO），10 µl重组HBV，以及78 µl新鲜培养基。</li>
	<li>向96孔板的某一孔中加入100 µl重组HBV溶液。</li>
	<li>感染后一天，用每孔300 µl PBS洗涤感染细胞3次，以去除病毒组分中污染的报告蛋白。</li>
	<li>将感染后的细胞在含有2% DMSO的200 µl培养基中孵育一周或更短时间。</li>
</ol>
3. 分析
<ol>
	<li>感染后一周，用 PBS 清洗感染的细胞 3 次。</li>
	<li>向感染的细胞中加入 50 µl 裂解缓冲液。</li>
	<li>将培养板轻轻摇动 5 分钟，然后在 2,000 × g 下离心 5 分钟。</li>
	<li>向发光检测仪板中加入 50 µl 报告分子底物。</li>
	<li>将 20 µl 细胞裂解液加入含有报告分子底物的发光检测仪板中，短暂涡旋混匀。</li>
	<li>将板放入发光检测仪中并开始读数15。</li>
</ol>

<ol><li>Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+in+cirrhosis%3A+incidence+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors.</a> Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).</li>
<li>Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+strategies+are+required+to+cure+and+eliminate+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).</li>
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<li>Stuyver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+for+antiviral-resistant+human+hepatitis+B+virus+mutations+in+the+polymerase+region%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region.</a> Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).</li>
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<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+infectious+hepatitis+B+virus+vectors+carrying+substantially+sized+transgenes+by+redesigned+viral+polymerase+translation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation.</a> PLoS. One. 8, 60306(2013).</li>
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<li>Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+elements+of+hepatitis+B+virus+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Viral.+Hepat%22%5BJournal%5D)">Regulatory elements of hepatitis B virus transcription.</a> J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

乙型肝炎病毒（HBV）基因组包含四个主要的开放阅读框（ORF），分别为核心（core）、聚合酶（pol）、表面（surface）和X基因的开放阅读框（图1）。这四个HBV ORF的转录受到四个启动子的严格调控：包含增强子II的前核心/核心启动子、S1启动子、S2启动子以及包含增强子I的X启动子18。3.5 kb和3.4 kb的mRNA分别翻译生成前核心（PreCore）和核心（Core）蛋白。大包膜蛋白（L）由最长的亚基因组mRNA（2.5 kb）编码，中等（M）和小表面蛋白（S）则由较短的转录本（2.1 kb）翻译而来。0.8 kb的转录本是X蛋白翻译的模板19,20。前基因组RNA的5ʹ端和3ʹ端含有多个功能性的顺式作用元件，包括直接重复序列1（DR1）、DR2以及包装信号21,22。这些功能元件限制了报告基因或标记基因...

乙型肝炎病毒（HBV）的慢性感染是导致慢性肝病的主要风险因素1。尽管目前的治疗策略主要基于使用抑制HBV聚合酶功能的核苷类似物，和/或使用I型干扰素来激活感染者体内的免疫反应，并通过干扰素刺激基因的功能间接抑制HBV增殖2，但这些治疗方法无法彻底清除HBV DNA3。此外，出现对抗聚合酶药物耐药的HBV毒株也令人担忧4。联合使用直接靶向人类免疫缺陷病毒（HIV）或丙型肝炎病毒（HCV）生命周期不同阶段的抗病毒药物已被证明可成功抑制甚至根除病毒。借鉴这一思路，开发能够直接作用于HBV生命周期各个阶段的抗HBV药物，对于建立未来的HBV治疗方案具有重要意义。
通常，建立目标病毒的简单体外培养系统有助于抗病毒药物的研发。然而，在建立用于筛选抗乙型肝炎病毒（HBV）药物的体外培养系统方面至少存在两个障碍。第一个障碍是缺乏便捷的体外细胞培养系统用于HBV感染与增殖。与其他可在已建立的细胞系中传代的病毒（如HIV和HCV）不同，由于宿主范围狭窄等实验限制，HBV在体外培养较为困难。为克服这些问题，已开发出特定的细胞培养系统，例如可被HBV感染的人肝癌细胞系HepaRG5,6,7。此外，从接种了人原代肝细胞（PHH）的尿激酶型纤溶酶原激活物转基因/重症联合免疫缺陷（uPA-SCID）小鼠中分离得到的PXB细胞也被证实可被HBV感染并支持其复制8。然而，HepaRG细胞中的HBV复制水平依赖于细胞培养后的分化状态，可能导致HBV感染/复制水平的结果不一致且不可重复。PXB细胞虽常用于HBV感染实验，但其可获得性有限。四环素诱导型HBV表达细胞系HepAD38也被广泛用于研究HBV复制，但该系统仅可用于转录后的评估，无法检测HBV感染的进入阶段9。最近，钠-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）被确认为HBV的功能性受体，从而推动了多种HBV培养系统的建立10。事实上，在原本不易感的肝癌细胞（如Huh7和HepG2）中表达NTCP可使其支持HBV感染10，因此可选用的HBV易感细胞系范围得以扩大，解决了许多实验上的限制。第二个问题是缺乏简单有效的检测系统来评估HBV感染与复制。通常通过检测HBV DNA、RNA和蛋白来评估HBV感染情况。然而，这些病毒标志物的定量检测往往耗时、成本较高且操作复杂。因此，开发一种简单的检测系统（例如使用报告基因）可能有助于克服现有HBV检测系统存在的问题。
然而，由于HBV衣壳可包装的基因组大小有限——小于3.7 kb11，报告基因的长度应尽可能短。此外，病毒基因组中分散分布的多个顺式作用元件对病毒复制至关重要，这限制了报告基因插入基因组的可用位置。已有数项研究尝试将外源基因（包括HIV-1 Tat、绿色荧光蛋白和DsRed）插入HBV基因组11,12,13。然而，这些重组HBV无法用于筛选HBV感染/复制过程，或用于影响HBV感染/复制因素的高通量筛选。这主要是由于重组病毒产量较低，以及病毒产生效率低下导致报告基因表达强度减弱所致。
为解决这些问题，我们构建了一种病毒产量高的报告型乙型肝炎病毒（HBV）。该病毒对监测HBV复制周期的早期阶段（从病毒进入至转录）具有高度敏感性。为此，我们选用NanoLuc（NL）作为标记基因，因其是一种经过工程改造的小型发光报告基因（171个氨基酸）14。此外，NL的发光强度约为萤火虫或海肾荧光素酶的150倍，且其发光反应不依赖ATP，表明在高通量筛选中假阳性率将较低。重组HBV的产生效率约为亲本HBV的1/5，与既往报道的重组HBV病毒水平相似；然而，NL的高亮度弥补了病毒产量的不足，因此可用于抗HBV药物的大规模筛选。
使用原代肝细胞、HepaRG、HepAD38 和 NTCP 转导的肝细胞筛选抗 HBV 药物可能适用于通过常规方法进行抗 HBV 药物的筛选。然而，本文所述系统具有多种优势，例如操作简便、灵敏度高以及筛选成本低。这些优势使其适用于高通量筛选，以开发和鉴定具有治疗用途的新型 HBV 药物。

<table><tbody><tr><td>纳米荧光素酶检测试剂</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素混合溶液</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09367-34&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm/胶原蛋白包被培养皿</td><td>Iwaki</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 (PEG) 6000&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81255</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 (PEG) 8000&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31319-45&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mol/L EDTA 溶液</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP，0.45 &amp;mu;m，聚醚砜滤膜</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白包被 96 孔板</td><td>Corning</td><td>NO3585</td><td></td></tr><tr><td>5 倍被动裂解缓冲液</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 微孔板发光检测仪</td><td>Promega</td><td>E6501</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30403-55</td><td></td></tr><tr><td>发光检测仪用微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>HepG2-NTCP1-myc-clone22</td><td>-</td><td>-</td><td>参考文献 15</td></tr><tr><td>pUC1.2HBV delta epsilon</td><td>-</td><td>-</td><td>参考文献 15</td></tr><tr><td>pUC1.2HBV/NL</td><td>-</td><td>-</td><td>参考文献 15</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Violamo</td><td>1-3500-02</td><td></td></tr><tr><td>抗 Myc 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3956</td><td></td></tr><tr><td>HBIG</td><td>日本血液制品机构</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;beta;</td><td>Mochida 制药</td><td>14987224005413</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr></tbody></table>

开发乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

目前，已可构建携带外源基因（如报告基因或标记蛋白）的多种病毒的重组形式，例如人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和丙型肝炎病毒（HCV）。这些重组病毒通常能忠实地模拟原始病毒在感染细胞中的生命周期，并表现出相同的宿主范围依赖性。重组病毒的开发使得高效筛选抑制剂和鉴定特定宿主因子成为可能。然而，迄今为止，由于存在多种实验限制，乙型肝炎病毒（HBV）的重组病毒构建一直较为困难。主要限制在于HBV基因组尺寸紧凑，且必须被包装进病毒颗粒的基因组大小较为严格，通常不超过1.3倍基因组长度。因此，若不对基因组DNA进行删除，则插入的外源基因大小应小于0.4 kb。为克服这一尺寸限制，有必要删除部分HBV DNA序列。本文报道了一种重组HBV的构建方法：通过删除部分HBV聚合酶（pol）编码区，并用报告基因替换部分HBV核心蛋白编码区，从而实现报告基因的表达，用于监测HBV复制周期的早期阶段。通过报告基因活性来检测重组HBV感染，其灵敏度高且成本低于目前可用的传统HBV感染检测方法。该系统将适用于多种应用，包括高通量筛选抗HBV抑制剂、宿主因子以及易感病毒的细胞。

图1展示了乙型肝炎病毒（HBV）基因组、转录的RNA、病毒蛋白及其在基因组上的编码区域的示意图。报告基因及其在基因组中的位置也已标出。图2展示了含有报告基因的HBV报告质粒和辅助质粒。pUC1.2HBV/NL报告质粒是通过从pUC1.2HBV16的preCore mRNA转录起始位点删除第223至811位核苷酸，然后插入报告基因构建而成。pUC1.2HBVdelta质粒是通过定点诱变PCR在衣壳化信号序列中引入点突变而获得。报告质粒（pUC1.2HBV/NL）和辅助质粒（pUC1.2HBVdelta）用HindIII和EcoRI进行酶切，随后进行凝胶电泳。预期条带大小分别为：pUC质粒3.0 kb，1.2HBV/NL或1.2HBVdelta为3.5 kb，结果如图2B所示。图3展示了表达NTCP的HepG2细胞被重组HBV感染的情况。为建立稳定表达NTCP...

在此，我们介绍一种新开发的乙型肝炎病毒（HBV）报告系统，用于监测HBV生命周期的早期阶段。该系统经过简化 体外 该系统将有助于采用高通量策略筛选抗HBV药物。

目前，可以构建多种病毒的重组形式，例如人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和丙型肝炎病毒（HCV），……

该重组HBV报告系统的主要目标是便于大规模筛选抗乙型肝炎病毒（HBV）药物。该方法有助于解答HBV研究领域中的关键问题，例如抗HBV药物的筛选以及宿主HBV相关因子的鉴定。该技术的主要优势在于，HBV报告系统能够监测HBV复制周期的早期阶段。配制细胞培养基后，转染前一天，将4 × 10⁶个HepG2细胞接种于含培养基的10 cm胶原包被培养皿中。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育。根据转染试剂说明书，使用转染试剂将5 µg pUC1 2HBV delta epsilon质粒和5 µg pUC1 2HBV/NL质粒共转染至细胞中。第二天，移除培养基并加入 10 mL 新鲜培养基。转染后一周，将含有重组 HBV 的培养基转移至 50 mL 离心管中。接着，向含有转染细胞的培养板中加入 10 mL 新鲜培养基。然后收集培养基并在2,300 × g离心5分钟，以去除含有重组HBV的细胞碎片。将上清液通过0.45 μm膜滤器过滤。向滤液中加入等体积的25% PEG、1.5 mol/L NaCl，并轻轻混匀。将样品在 4°C 下孵育过夜。次日，在 4°C 条件下以 2,300 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，并将沉淀物溶解于 0.5 mL TNE 缓冲液中。再次离心样品以去除细胞碎片，然后将 0.5 mL 含重组 HBV 的 TNE 溶液加至 0.8 mL 20% 蔗糖（溶于 TNE）上。将两者在 100,000 × g、15 °C 条件下离心 3 小时。尽可能弃去上清液，每 40 mL 初始培养物使用 1 mL 无血清 DMEM 重悬沉淀。将悬液在 4 °C 下孵育过夜。次日早晨，将悬液通过 0.45 µm 滤膜过滤。然后制备 0.5 mL 的等份样品，将试管置于 -80 °C 保存。接种稳定表达钠-牛磺胆酸共转运多肽（sodium taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP）的 HepG2 细胞，该细胞可被乙型肝炎病毒（HBV）感染，并在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养。感染前一天，将约5 × 10⁴个HepG2 NTCP细胞接种至96孔胶原蛋白包被板的各孔中，每孔加入0.1 mL培养基。在37°C水浴中解冻重组HBV，直至管中仅剩少量冰晶。通过将78 µL新鲜培养基、2 µL DMSO、10 µL 40% PEG 8000（溶于1×PBS中）和10 µL重组HBV混合，制备感染用培养基。向96孔板的每个孔中加入100 µL重组HBV溶液。感染后一天，用300 µL PBS清洗细胞三次，以去除病毒组分中的污染报告蛋白。向感染的细胞中加入200 µL含有2% DMSO的培养基，并培养一周或更短时间。为进行乙型肝炎病毒（HBV）感染分析，在感染后一周，用 PBS 洗涤感染的细胞三次。向感染

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

乙型肝炎病毒记者系统的开发监控复制周期的早期阶段

来源：Nishitsuji, H., et al. 建立乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段。J. Vis. Exp.

重组乙型肝炎病毒颗粒的制备与纯化

来源：Ren, S., et al. 丙型肝炎病毒复制分析方案. J. Vis. Exp.

检测感染细胞中丙型肝炎病毒复制复合体的免疫荧光实验

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低拷贝数整合病毒DNA的检测方法 体外 乙型肝炎感染

本实验方案的目的是提供一份逐步操作指南，用于进行乙型肝炎病毒感染的3-D"肝脏芯片"实验。...

用于乙型肝炎病毒感染的原代肝细胞与库普弗细胞“肝脏芯片”培养

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在非肝源性293T-NE-3NRs细胞中建立乙型肝炎病毒感染模型

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一种通过钠-牛磺胆酸共转运多肽研究乙型肝炎病毒进入的高效肝细胞模型作为治疗靶点

基于实时聚合酶链式反应（PCR）的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测与定量是一种用于诊断和监测HBV感染的高灵敏度、高准确性方法。本文介绍了一种用于检测HBV...

基于实时聚合酶链式反应的乙型肝炎病毒DNA检测与定量

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开发乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段

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