阿尔茨海默病啮齿类动物模型中脑内淀粉样蛋白-β吞噬作用的定量三维in silico建模（q3DISM）

定量三维计算机模拟（q3DISM）技术的总体目标是量化单核吞噬细胞在阿尔茨海默病啮齿类动物模型脑内对β-淀粉样蛋白的摄取。该方法解决了阿尔茨海默病研究领域中迫切需要量化沉积于患者脑内形成老年斑的β-淀粉样蛋白清除程度的问题。该技术首次实现了在体内对巨噬细胞摄取β-淀粉样蛋白的真实三维重建与定量分析。我们开始采用cued 3-Dism技术研究β-淀粉样蛋白沉积，是因为需要一种可靠的工具来可视化并量化体内小胶质细胞的吞噬作用。

该技术可能在测试实验性阿尔茨海默病治疗药物时具有重要价值，可用于评估哪些药物能够刺激巨噬细胞以有效清除β-淀粉样蛋白。当组织样本准备进行免疫染色时，在疏水屏障笔圈定的组织区域内加入封闭缓冲液，在湿盒中室温孵育1小时。孵育结束后，将封闭缓冲液替换为所需的第一种一抗，在湿盒中4摄氏度下过夜孵育。

次日早晨，在室温下用 PBS 轻轻振荡洗涤样本，每次五分钟，共洗涤三次。第三次洗涤后，在避光条件下于室温孵育载玻片与相应的荧光标记二抗。一小时后，在避光条件下用 PBS 再次洗涤切片三次。

接下来两到四天内，按照刚刚展示的方法，使用其他适合该组织的感兴趣的一抗和二抗对细胞进行标记。为了高效地染色细胞及亚细胞结构以及淀粉样β沉积物，必须每次仅使用一种一抗进行标记，随后加入相应的二抗。这一过程虽然耗时，但有助于优化实验结果。

在完成二抗染色的最后一次洗涤后，将切片置于避光环境中，室温下彻底干燥过夜。随后，用含DAPI的荧光封片剂将干燥的样本封片。使用共聚焦显微镜观察样品时，选择60倍物镜，并在镜头上滴加浸油。

将样本置于显微镜载物台的玻片夹持器上，升起物镜直至镜油与玻片接触。采用落射荧光照明，调节焦平面以定位海马体或大脑皮层中的淀粉样斑块。随后，采集围绕海马体或皮层中淀粉样沉积物的活化单核吞噬细胞的共聚焦图像。

对于定性的3-D体外模拟，首先使用科学的3-D图像处理软件中的共定位分析模块，同时分析所有Z平面中活化巨噬细胞标志物染色的空间邻近性。创建与活化的单核吞噬细胞内吞噬溶酶体染色相对应的共定位通道。选择TRITC作为通道A，FITC作为通道B。在模式选择窗口中，选择阈值。

对于共定位强度，选择“源通道”。单击“编辑”以选择共定位颜色，然后独立调整每个通道的阈值，以包含特异性染色信号，并排除背景和非特异性信号。

共定位的体素将在所有z层堆栈中同时以选定的共定位颜色显示。接下来，单击“构建共定位通道”。生成的共定位通道将出现在显示调整窗口中。

单击共定位通道以打开通道统计信息。“高于阈值的A物质体积的共定位百分比”表示吞噬溶酶体所占据的单核细胞体积。使用共定位模块，分析共定位通道与淀粉样蛋白β信号的空间邻近性，以定量测定被吞噬溶酶体包裹的淀粉样蛋白β。

选择通道 A 的共定位数据集，并为通道 B 选择 Cy5，然后按照刚刚演示的方法构建共定位通道。单击共定位通道以再次打开通道统计窗口。“高于阈值的物质 A 体积百分比共定位”表示淀粉样蛋白-β所占据的吞噬溶酶体体积。

使用 Surpass 模块重建共聚焦图像堆栈，并对单核细胞吞噬溶酶体中包裹的淀粉样蛋白 β 生成三维模型。在显示调整窗口中，选择 TRITC 以仅显示巨噬细胞染色，然后在体积属性中点击“添加新表面”。在设置中的五步流程的第一步“算法”中，选择“表面”。

在颜色选项中，选择感兴趣的颜色类型，并根据需要调整透明度。然后勾选“选择感兴趣区域”复选框，点击下一步。在五步中的第二步“感兴趣区域”中，调整 X、Y 和 Z 坐标，在目标细胞周围绘制一个窗口，然后点击下一步。

在五步中的第三步“源通道”中，选择 TRITC 源通道并勾选“平滑”选项。将表面面积细节级别设置为 0.4 微米，然后单击下一步。在五步中的第四步“阈值”中，调整阈值，使生成的体积与 TRITC 通道信号完全重叠，然后单击下一步。

最后，在五个步骤中的第五步，在“滤除类型”部分，根据对象的大小对其进行分类，以确定是否将其包含或排除在待创建的体积之外。重复上述相同步骤，使用FITC通道为吞噬溶酶体、Cy5通道为淀粉样蛋白β创建三维表面。在完成如上所述的定性三维计算机建模后，可分析转基因小鼠和大鼠脑内单核细胞吞噬溶酶体对淀粉样蛋白β的摄取情况。

有趣的是，在小鼠和大鼠中，与远离斑块的区域相比，位于斑块附近的 Iba1 阳性单核吞噬细胞内 CD68 阳性吞噬溶酶体所占体积显著增加，表明靠近斑块的单核吞噬细胞处于易于进行吞噬的状态，而远离斑块的细胞则不然。值得注意的是，在转基因小鼠中，与远离斑块的细胞相比，斑块相关的单核吞噬细胞表现出更高的淀粉样蛋白-β 摄取水平；而在转基因大鼠中，总体上仅观察到极轻微的淀粉样蛋白-β 纤维摄取，且其吞噬作用在距斑块不同距离之间无明显变化。在进行该实验操作时，需牢记共聚焦图像的质量至关重要，并且在进行共定位分析时，所有通道应采用相似的阈值设置。

自该技术问世以来，为神经炎症领域的研究人员探索阿尔茨海默病啮齿类动物模型脑内吞噬事件提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对啮齿类动物脑组织切片中的单核吞噬细胞、吞噬溶酶体以及淀粉样蛋白β进行标记。以实现对大脑内淀粉样蛋白β在三维空间中活体吞噬过程的定量分析。