诱导LAP标记的稳定细胞系用于研究蛋白质功能，时空定位与蛋白质相互作用网络

该程序的总体目标是生成诱导型定位和亲和纯化，或 LAP 标记的稳定细胞系，用于研究蛋白质功能、时空定位和蛋白质相互作用网络。该方法可以帮助回答分子和细胞生物学中与蛋白质功能、蛋白质细胞周期零下定位和蛋白质相互作用相关的关键问题。该方法的主要优点是它适用于蛋白质组的高通量分析，可用于剖析生物途径的蛋白质成分。

要开始此过程，请将目的基因的开放阅读框克隆到 LAP 标记的载体中，并按照文本方案中的说明将其转染到 HEK293 细胞中。转染后 1 天，用新鲜培养基替换 minus Tet DMEM/F12 培养基。转染后 2 天，将细胞分流至 25% 汇合。

让细胞贴壁大约 5 小时。然后，添加预定浓度的含潮霉素的负 Tet DMEM/F12 培养基。对于 HEK293 细胞，使用每毫升 100 微克潮霉素。

根据需要更换培养基，直到出现不同的细胞焦点，这些细胞焦点类似于透明板上的不透明斑点。在每个细胞集歇的顶部加入 20 微升胰蛋白酶，并用 200 微升移液器吸头上下吸管两次。将细胞转移到 24 孔板中，并通过在含潮霉素的 minus Tet DMEM/F12 培养基中持续生长来扩增细胞。

扩增经验证的 LAP 标记细胞系，用于蛋白质复合物的串联亲和纯化或 TAP 分离。为此，将所有 HEK293 细胞连续传代到更大的板和/或滚瓶中，并在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下去除 Tet DMEM/F12 培养基。对于 Tet/Dox 诱导型细胞系，当细胞达到约 70% 汇合度时，添加 0.2 μg/mL Tet/Dox 浓度，诱导细胞 10 至 15 小时。

通过搅拌或胰蛋白酶消化收获细胞。然后，以 875 倍 g 的浓度沉淀 5 至 10 分钟。要将抗 GFP 抗体与蛋白 A 珠偶联，请在 1.5 mL 试管中平衡 160 μL 填充体积的蛋白 A 珠与 PBST。

用 1 毫升 PBST 洗涤珠子 3 次。在整个过程中的每个洗涤步骤之后，将珠子以 5000 次 g 离心 10 秒，并去除上清液。将微珠重悬于 500 μL PBST 中后，向每管中加入 80 μg 亲和纯化的快速抗 GFP 抗体，其中包含 160 μL 微珠。

在室温下混合 1 小时。用 1 毫升 PBST 洗涤珠子两次，然后用 1 毫升 0.2 摩尔硼酸钠洗涤珠子两次，pH 值最后一次洗涤后，加入 900 微升硼酸钠缓冲液，使最终体积达到 1 毫升。然后，向微珠悬浮液中加入 100 微升 220 摩尔 DMP，最终浓度为 20 毫摩尔。

在室温下轻轻旋转试管 30 分钟。与 DMP 孵育后，用 1 毫升 0.2 摩尔乙醇胺、0.2 摩尔氯化钠 pH 8.5 洗涤磁珠一次，以灭活残留的交联剂。然后，将微珠重悬于 1 mL 的相同缓冲液中，并在室温下旋转 1 小时。

沉淀珠子后，将它们重新悬浮在另外 500 μL 的缓冲液中。制备的珠子在 4 摄氏度下可稳定数月。为了制备细胞裂解物，将 500 微升的浓缩细胞体积重悬到 2.5 毫升 LAP 300 中，其中含有 0.5 毫摩尔的 DTT 和蛋白酶抑制剂。

加入 90 微升 10% 壬基苯氧基聚乙氧基乙醇，倒置混合。将混合物放在冰上 10 分钟。以 21， 000 倍 g 离心 10 分钟。

离心后，收集这种低速上清液，并留出 10 μL 样品用于凝胶分析。将低速上清液转移到 TLA 100.3 管中后，在 4 摄氏度下以 100， 000 倍 g 旋转 1 小时。将这种高速上清液收集在试管中并置于冰上，保留 10 μL 样品用于凝胶分析。

对于通过与抗 GFP 微珠结合进行第一次亲和捕获，用 1 mL 洗脱缓冲液洗涤抗体偶联的微珠 3 次，以去除未偶联的抗体并降低背景。快速执行此作。不要将珠子长时间置于高盐中。

然后，用 1 毫升 LAP 200 N 洗涤珠子 3 次，接下来，在 4 摄氏度下将高速上清液提取物与抗体珠混合 1 小时。将提取物以 21， 000 次 g 离心 10 分钟后，保留 10 μL 上清液样品用于凝胶分析。用 1 mL LAP 200 N（含有 0.5 毫摩尔 DTT 和蛋白酶抑制剂）对磁珠进行 3 次快速洗涤。

使用相同的缓冲液再洗涤珠子两次，每次洗涤的孵育时间为 5 分钟。然后，在添加烟草蚀刻病毒 （TEV） 蛋白酶之前，用 1 毫升含有 0.5 毫摩尔 DTT 且不含蛋白酶抑制剂的 LAP 200 N 快速洗涤珠子两次。在微珠中加入 10 μg TEV 蛋白酶，溶于 1 毫升 LAP 200 N 中，并在 4 摄氏度下旋转试管过夜。

第二天，沉淀珠子并将上清液转移到新试管中。用 160 微升 LAP 200 N（含有 0.5 毫摩尔 DTT 和蛋白酶抑制剂）冲洗珠子两次，以去除任何残留蛋白。对于通过与 S 蛋白琼脂糖结合的第二次亲和捕获，用 1 毫升 LAP 200 N 洗涤一管 80 μL S 蛋白琼脂糖浆液 3 次，将 TEV 洗脱的上清液添加到 S 蛋白珠中，并在 4 摄氏度下摇动 3 小时。

沉淀珠子后，用 1 毫升含有 0.5 毫摩尔 DTT 和蛋白酶抑制剂的 LAP 200 N 洗涤 3 次。然后，用 1 毫升 LAP 100 洗涤珠子两次。加入 50 μL 4x Laemmli 样品缓冲液，并在 97 °C 下加热 10 分钟，洗脱 S 蛋白琼脂糖上的蛋白质。

为了通过质谱分析鉴定相互作用的蛋白质，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析收集的样品来测试纯化质量。对所得凝胶进行银染。此外，对洗脱液进行免疫印迹，并用抗 GFP 抗体探测，以确保 LAP 标记的纯化有效。

为了鉴定化学计量和亚化学计量共纯化物种，取最终洗脱样品并通过 SDS-PAGE 分离。用质谱兼容的蛋白质染料对凝胶进行染色。切除凝胶中最突出的条带及其之间的空间，以分别处理条带以进行质谱分析。

此处显示的是来自非诱导和 Dox 诱导的 LAP-Tau HEK293 细胞的蛋白质样品的代表性蛋白质印迹分析。用抗微管蛋白抗体探测细胞以检测微管蛋白上样对照，并用抗 GFP 探测以检测 LAP 标记的 Tau 蛋白。请注意，LAP-Tau 仅在用 Dox 诱导细胞时表达。

固定表达 LAP-Tau 的丝丝分裂细胞，并用抗微管蛋白抗体对 DNA 和微管蛋白进行共染色，并通过荧光显微镜分析 LAP-Tau 的亚细胞定位。请注意，在有丝分裂过程中，LAP-Tau 定位于有丝分裂纺锤体和纺锤体极。此处显示的是 LAP-Tau 纯化的代表性银染凝胶。

泳道代表分子量、澄清的裂解物和最终的洗脱液。样品在 4-20% SDS-PAGE 凝胶上运行，凝胶进行银染以观察纯化的蛋白质。请注意，对应于 LAP-Tau 的条带标有星号，可以看到对应于共纯化蛋白的其他几个条带。

看完这个视频，您应该对如何生成可诱导型 LAP 标记的稳定细胞系，以及如何对 LAP 标记的蛋白质进行生化纯化以进行蛋白质组学分析和蛋白质相互作用网络的鉴定有了很好的了解。