修改MicroSecure玻璃化:一种安全，简便，高效的冷冻程序人胚泡

MicroSecure 胚胎玻璃化法的总体目标是为人类胚胎提供一种安全、可靠、简单而有效的无菌封闭玻璃化手术。开发该方法是为了最大限度地减少人类胚胎玻璃化过程中的质量控制变量，从而确保可靠和可重复的成功。该技术的主要优点是它努力消除生物学家和实验室之间的技术差异。

我们的技术执行起来非常简单，以至于我们发现学员面临的最大挑战是学习如何在不丢失胚胎的情况下移液。我们方法背后的想法是通过调整两种常用的 FDA 批准的项目来消除对专用设备的需求。内部标记的离聚物储存吸管和无菌 flexipet。

该技术的视觉演示非常有用，因为它突出了确保其成功应用的基本技巧。在开始该程序之前，将无菌的 0.3 毫升精液吸管放在基本台式脉冲封口机电极的特氟龙表面上，就在塞子前面，以形成内部密封。按下手柄以激活加热，当红灯熄灭并听到哔哔声时松开手柄。

然后在完成设置之前将棉塞向前推到内部密封件上。对于样品的冷冻稀释和囊胚加载，从培养箱中取出患者培养皿，并使用辅助来源确认所有样品鉴定。在立体显微镜下，使用玻璃化柔性体（称为 vit 尖端）将囊胚移动到相应冷冻皿顶行的单个容纳液滴中。

接下来，用 3 微升 V1 溶液预填充 flexipet，并将一半的内容物分配到第一个胚胎上。吸出胚胎并将其转移到第一个 V1 洗涤液滴中。然后用移液管绕液滴周边吸取胚胎两到三次，并将液滴外残留的移液器内容物清除到培养皿表面。

然后将囊胚移动到单独的 V1 固定液滴中，并在用下一个 V2 溶液预装 vit 尖端，然后再用新的 vit 尖端移液额外的胚胎。如刚才所示，清洗 V2 和 V3 液滴中的所有囊胚后，清除 V3 固定液滴外的 vit 尖端的残留溶液和气泡，并用来自第一个胚胎周围的干净 V3 溶液完全填充尖端。排出大约 1 微升的体积，并将囊胚和剩余的 V3 溶液完全吸出到 vit 尖端中。

现在，从移液器中取出吸头，并使用无菌纱布垫擦干 vit 吸头外表面残留的 V3 溶液。干燥尖端的外表面至关重要，并且不会产生任何额外的胚胎损失风险。然后先将吸头端插入预密封吸管的开口端，并将吸管倒置，标签端朝下。

观察内部插头处的尖端。在开口端留出 1 cm 的空隙，然后安全地焊接密封。当所有吸管都密封后，将它们直接浸入不锈钢杜瓦瓶中的液氮中，并将吸管存放在连接在患者手杖上的敞开的高脚杯中。

对于冷冻溶液洗脱和稀释，将相应的六孔稀释皿放在立体显微镜载物台的中心，并将含有 37 摄氏度蔗糖加热浴的 60 mm 培养皿放在显微镜的一侧。接下来，分离要加热的吸管，并将上吸管密封保持在液面以上，以确认样品的身份。使用蛋黄酱剪刀将吸管固定在内部塞子下方，以保持 vit 尖端浸没在液氮中。

作为质量控制预防措施，将剪刀用剪刀在杜瓦瓶上用力敲击数次，以将吸管尖端从吸管内侧壁上脱落，然后将吸管以水平方向在立体镜表面旁边或下方提起到环境空气中。抓住吸管未标记的一端，在内塞处剪断吸管。然后将吸管抬到温暖的浴盘上方，将吸管尖端以 60 度角倒入浴缸中，直到尖端完全挤出。

flexipet 的底座应位于培养皿侧壁上方。5 到 10 秒后，将移液器底座转移到微量盖移液装置中。启动一个 5 分钟的计时器。

观察显微镜时，用食指盖住球孔，轻轻挤压球，将玻璃化的囊胚从 vit 尖端释放到 T1 洗涤液中。确认囊胚释放后，通过正压清除残留的 V3 溶液和气泡，将内容物排空到未使用的丢弃井的中心。将 vit 吸头转移到 sterber 移液器上，在剩余的 4 分钟内将胚胎移入油中的第二个 T1 液滴中。

在孵育过程中，用下一种溶液预填充 flexipet，然后每隔 3 分钟稀释 T2、3 和 4 液滴中的囊胚。最后，在 37 摄氏度的表面上平衡 T5 液滴中的囊胚 5 分钟，然后将它们放回培养箱中。改良加德纳囊胚分级系统认为全囊胚的滋养外胚层细胞疝出小于 10%，而脑疝高达 50% 的囊胚被归类为扩大。

表现出大于 50% 疝的囊胚被认为是孵化。使用经过验证的冷冻保存和加热方法，无论是否进行植入前基因检测，每个周期开始的活产率始终达到高水平。尽管这些成功率明显更高，但使用预先选择的整倍体囊胚。

事实上，仅评估冷冻保存周期的良好预后患者群体，这些冷冻胚胎移植数据表明植入率和活产率都优于全国平均水平 30% 以上通过移植主要经过基因测试的单倍体玻化囊胚，一些在美国的植入率和活产率中名列前茅， 与疾病控制中心最近报告的另外两家备受尊敬的生育诊所的全国统计数据以及辅助生殖技术协会发布的数据相比，已经实现了与年龄无关的指标。MicroSecure 玻璃化冷冻是一种新型无菌程序，旨在实现技术简便性、可靠性和冷冻安全性。这种简单的非商业玻璃化系统为玻璃化设备提供了一种高效、低成本的替代方案。

自开发以来，MicroSecure 方法已确保超过 99.9% 的胚胎恢复和超过 95% 的囊胚完整存活。这使得我们的临床实践在过去三年中转变为几乎所有冷冻保存的 embyro 转移周期。我们有效地修改了我们的程序，在离聚物精液吸管的棉塞前面包括一个内部密封，以仍然产生可靠的焊接密封和出色的加热后结果。

当今辅助生殖技术行业使用了许多不同的设备系统，但没有其他设备能像 MicroSecure 玻璃化术那样提供从根本上消除用户差异并提供优化安全性的简单性和技术可重复性。