Name: 可追踪记者乳腺癌患者来源的移植瘤贴标肿瘤生长和转移的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学习使用慢病毒颗粒稳定标记患者来源异种移植瘤（PDX）的方法，通过绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因实现肿瘤生长与转移的实时活体成像追踪。该技术可减少死后组织学分析需求，适用于多种癌症类型的转移研究。

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作者感谢波士顿大学的 Darrel Kotton 博士提供本研究中用于高滴度慢病毒生产的 pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W 载体及相关实验方案。本研究由美国国防部乳腺癌研究计划（DOD BCRP）W81XWH-11-1-0101（DMC）、美国癌症学会独立研究者奖（ACS IRG）#57-001-53（DMC）、美国国家癌症研究所 K22CA181250（DMC）和 R01 CA140985（CAS）资助。NCI P30CA046934 中心资助项目亦提供了支持。 体内 科罗拉多大学安舒茨医学校区的成像与组织培养中心

本方案中所有涉及动物使用的步骤均遵循科罗拉多大学动物研究伦理委员会（IACUC）的指导原则。
1. 仪器、培养基及其他试剂的准备
<ol>
	<li>在无菌条件下配制 100 ml 乳腺球培养基，包含 DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基与 Ham's F-12 培养基，1:1 混合）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20 ng/ml）、表皮生长因子（EGF，10 ng/ml）、肝素（4 µg/ml）、1× B27 添加剂、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 µg/ml）。在无菌条件下配制，4 °C 保存，最长可使用 3 个月。</li>
	<li>配制上皮细胞富集缓冲液（EEB），包含 pH 7.2 的 PBS、0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA。过滤除菌后，4 °C 保存，最长可使用 6 个月。</li>
	<li>将消化缓冲液以 5 ml 分装至无菌 15 ml 锥形管中，-20 °C 保存数月。在肿瘤消化前一晚，将消化缓冲液（每 500 mg 肿瘤使用 5 ml）置于冰上或 4 °C 冰箱中解冻。使用前加入 1× 抗生素-抗真菌素混合液。</li>
	<li>将至少两把镊子、手术刀和剪刀在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟，用于 PDX 组织的解剖。</li>
	<li>配制 500 ml 洗涤缓冲液，包含 DMEM:F12 培养基和 5% 胎牛血清（FBS）。4 °C 保存数月。在肿瘤解剖当天，按每份肿瘤 10 ml 分装。</li>
	<li>用无菌水配制聚凝素（polybrene）储存液，浓度为 4 µg/µl。过滤后分装至 1.5 ml 微量离心管中，每管 100 µl，-20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 携带可追踪标记的高滴度慢病毒颗粒的制备
<ol>
	<li>购买或制备携带报告基因的高滴度慢病毒颗粒（即GFP 和 Luc 体内 肿瘤生长的追踪 18,19. 
	注意：慢病毒滴度为 &#62; 108 建议使用转导单位/毫升（TU/ml）以实现PDX的有效转导。慢病毒颗粒应使用水疱性口炎病毒（VSV-G）的包膜G糖蛋白进行假型化，从而可转导多种哺乳动物细胞。 
	注意：此处用于生成和滴定高滴度慢病毒颗粒的实验方案可参见 <a href="http://www.kottonlab.com">www.kottonlab.com</a>本方案中使用的载体为pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro和双启动子pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W。后者是通过在pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W载体中，将EF1aL启动子下游的dsRed替换为荧光素酶基因而构建的，该载体由波士顿大学Darrell Kotton惠赠。</li>
</ol>
3. 患者来源异种移植瘤的建立
<ol>
	<li>通过将原发性或转移性乳腺肿瘤植入免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪垫中，建立来源于患者的乳腺癌异种移植模型（PDX）3,4。肿瘤最大体积建议不超过1 cm直径，因为更大的肿瘤可能含有坏死核心。 
	注：建立和移植异种移植模型的详细方法见DeRose et al. 18。已建立的、可传代的PDX在免疫缺陷型NOD/SCID/IL2rg−/−（NSG）小鼠体内生长至直径&#62;1 cm的肿瘤所需时间在植入后4至24周之间，具体取决于肿瘤固有的生长速度。虽然本方案描述的是乳腺癌PDX的转导，但该方法也可用于任何适合短期体外培养的肿瘤的病毒转导。PDX对短期（24–96小时）体外存活的敏感性因肿瘤而异，需通过实验确定。</li>
</ol>
4. 来自PDX的肿瘤细胞的解剖与解离
<ol>
	<li>使用 CO 对携带 PDX 的小鼠实施安乐死2 吸入麻醉后行颈椎脱位处死（遵循机构动物研究伦理委员会的指导原则）。将小鼠浸入0.2%氯己定溶液中1分钟。将小鼠仰卧置于解剖板上，用解剖针固定其伸展的四肢。</li>
	<li>使用无菌技术，用手术刀在肿瘤周围切割皮肤。用镊子夹住皮肤，并用干净的手术刀将其与肿瘤分离，直至肿瘤完全暴露。使用干净的镊子和手术刀切除肿瘤，并将其置于冰上预冷的5 ml洗涤培养基中。</li>
	<li>将解剖后的肿瘤组织放入生物安全二级柜中进行后续处理。去除培养基，并用 10 ml 含 10 mM Hepes 的改良汉克斯平衡盐溶液（HBSS/Hepes）冲洗肿瘤组织，重复两次。</li>
	<li>将肿瘤放入无菌的预称重60 cm组织培养皿中。称量含有肿瘤的培养皿以估算肿瘤质量。</li>
	<li>使用手术刀将肿瘤切成两半，然后从其中一半切下直径为3 mm的组织圆片，放入含10%福尔马林的容器中固定24小时。该组织用于验证肿瘤样本（亲代PDX）的异质性。加入200 µl HBSS/Hepes（足以防止组织干燥），用镊子和洁净的手术刀将剩余肿瘤切割成尽可能小的碎片。</li>
	<li>将剪碎的肿瘤组织转移至无菌的50 ml锥形管中。每100 mg肿瘤组织加入至少1 ml含有1x抗真菌-抗生素的消化缓冲液。 
	注意：添加抗生素/抗真菌剂可防止肿瘤细胞污染 体外.</li>
	<li>在30 °C下振荡消化肿瘤3小时，转速为125 - 200 rpm。 
	注意：将温度升高至37 °C可提高消化效率（随时间推移获得的单细胞更多），但通常伴随细胞死亡增加。对于大多数肿瘤，在30 °C下消化3小时即可获得足够数量的活细胞，用于后续标记步骤。</li>
	<li>加入35 ml洗涤培养基（DMEM/F12含5% FBS）以终止消化。通过70 µm尼龙滤网过滤至洁净的50 ml锥形管中，以去除未消化的组织。将含有消化后细胞的滤液在400 x g离心5 min。</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀重悬于1 ml红细胞裂解缓冲液中，室温孵育5分钟。</li>
	<li>加入10 ml洗涤缓冲液（DMEM:F12，5% FBS）以终止裂解。将细胞通过40 µM尼龙滤网过滤，去除细胞团块。以400 × g离心5分钟，弃上清液，将沉淀置于冰上。</li>
	<li>将消化后的细胞重悬于5 ml洗涤缓冲液中，使用台盼蓝排斥法计数活细胞和死细胞。简言之，取50 µl细胞悬液与50 µl台盼蓝混合，用血细胞计数板计数排除台盼蓝的细胞。 
	注意：该粗提消化产物将包含来源于PDX的人类肿瘤细胞以及小鼠间质细胞（成纤维细胞、血细胞， 等等消化后的细胞现在可用于标记（步骤6），或可使用参考文献5中描述的方法之一富集人癌细胞。</li>
</ol>
5. 人上皮癌细胞的富集
<ol>
	<li>使用谱系（Lin+）细胞耗竭试剂盒耗竭小鼠基质细胞20。 
	注意：适用于高度血管化的肿瘤和/或基质含量较高且EpCAM表达未知或丢失的肿瘤。
	<ol>
		<li>取最多107个活细胞置于洁净的5 ml聚丙烯管中，加入2 ml EEB，以300 × g离心5分钟。彻底吸除上清液。</li>
		<li>每107个细胞用40 µl预冷的EEB重悬细胞沉淀。</li>
		<li>每107个细胞加入10 µl生物素标记抗体混合物，轻轻吹打混匀，在4 °C孵育10分钟（混合物包含针对Lin+小鼠细胞的抗体）。</li>
		<li>每107个细胞加入30 µl预冷的EEB，轻轻吹打混匀。</li>
		<li>每107个细胞加入20 µl抗生物素磁珠，轻轻吹打混匀，在4 °C孵育15分钟。</li>
		<li>用3 ml预冷的EEB洗涤细胞，在4 °C以300 × g离心5分钟。小心吸除上清液。将沉淀重悬于500 µl EEB中，置于冰上。</li>
		<li>将柱子置于磁性分离器的磁场中。用0.5 ml上皮细胞富集缓冲液冲洗柱子，使其自然滴落。切勿让柱子干燥。</li>
		<li>在柱子下方放置一个新的聚丙烯收集管。缓慢将含有标记细胞的500 µl溶液加至柱子上（Lin+标记细胞将被磁性柱保留）。收集流出液作为未标记细胞组分，即富集的谱系阴性（肿瘤）细胞组分。</li>
		<li>用500 µl EBB冲洗柱子3次，将流出液收集至与步骤5.1.8相同的收集管中。保持流出液在冰上，并进入下一步标记操作（第6步）。</li>
		<li>可选：将柱子移出磁场。在下方放置一个新的聚丙烯管，通过加入500 µl EEB并使用提供的推杆，重复三次洗脱LIN+组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>富集人EpCAM+上皮癌细胞（推荐用于已知表达CD326+且含有较高小鼠基质成分的肿瘤）。
	<ol>
		<li>取最多107个活细胞置于洁净的5 ml聚丙烯管中，加入2 ml预冷的EEB，以300 × g离心5分钟。彻底吸除上清液。</li>
		<li>每107个细胞用60 µl预冷的EBB重悬细胞沉淀。</li>
		<li>每107个细胞加入20 µl EpCAM磁珠，轻轻吹打混匀，在4 °C孵育30分钟。</li>
		<li>用3 ml预冷的EEB洗涤细胞，在4 °C以300 × g离心5分钟。小心吸除上清液。将沉淀重悬于500 µl EEB中，置于冰上。</li>
		<li>将柱子置于微型分离器的磁场中。用0.5 ml EEB冲洗柱子，使其自然滴落。切勿让柱子干燥。</li>
		<li>在柱子下方放置一个新的聚丙烯收集管。缓慢将含有标记细胞的500 µl溶液加至柱子上（EpCAM+标记细胞将被磁性柱保留）。收集流出液作为未标记细胞组分，代表小鼠基质细胞。</li>
		<li>用500 µl ME缓冲液冲洗柱子4次，将流出液收集至与步骤5.1.8相同的收集管中。</li>
		<li>将柱子移出磁场。在下方放置一个新的聚丙烯管，通过加入500 µl ME缓冲液，重复三次洗脱EpCAM+组分。用力将推杆插入柱子，以冲洗出磁性标记的细胞。收集含有富集的EpCAM+肿瘤细胞组分的流出液，置于冰上。进入第6步。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 患者来源异种移植肿瘤细胞的转导
<ol>
	<li>将解离的肿瘤细胞在300 g下离心5分钟，重悬于2 ml乳腺球培养基中。使用台盼蓝染色排除法计数活细胞，方法同4.11。</li>
	<li>配制10 ml含有8 µg/ml多聚素（每毫升培养基加入2 µl多聚素储存液）的乳腺球培养基。</li>
	<li>确定含有2 × 105个活肿瘤细胞所需的体积。在300 × g下离心细胞5分钟，将沉淀重悬于2 ml含多聚素的培养基中。每孔接种2 × 105个活肿瘤细胞至6孔超低黏附组织培养板中。 
	注意：此为使用一种慢病毒载体进行转导所需的最适细胞数量。 
	警告！ 慢病毒颗粒及所有接触慢病毒颗粒的耗材均应按照机构关于重组DNA生物危害物的操作规程进行处理。 
	注意：原代乳腺细胞的慢病毒转导显著偏向肌上皮细胞，可能导致腔面细胞标记效率低，并在标记过程中选择性富集某些肿瘤细胞亚群21。</li>
	<li>转导前，将病毒与200 mU/ml神经氨酸酶在37 °C孵育1小时，以增强病毒颗粒与不同原代细胞亚群的结合，校正这一潜在偏差21。</li>
	<li>若PDX来源的解离细胞已去除Lin+小鼠细胞或富集了EpCam+细胞，则以10 MOI（2 × 105个活细胞加入2 × 106 TU慢病毒颗粒）加入慢病毒颗粒；若使用未经富集的PDX解离细胞，则以30 MOI（2 × 105个活细胞加入6 × 106 TU慢病毒颗粒）加入慢病毒颗粒。 
	注意：提高MOI可在粗提物中含有大量碎片和死细胞的情况下仍实现高效转导。保留一孔未标记细胞作为细胞活力和转导效率的对照。</li>
	<li>轻轻摇动混匀病毒与细胞。在37 °C、5% CO2条件下孵育最多96小时。转导后24小时加入500 µl新鲜乳腺球培养基。细胞不会贴壁，切勿吸除培养基。</li>
</ol>
7. 免疫缺陷小鼠中标记细胞转导效率的评估与再植入
<ol>
	<li>每24小时使用荧光显微镜在10倍放大倍数下监测可追踪标记（GFP）的表达情况。 
	注意：感染后24小时即可观察到GFP表达，但在大多数PDX模型中，72小时后GFP表达更为明显。图1).</li>
	<li>通过评估整个孔中GFP+细胞占总细胞的百分比来估计转导效率。 
	注意：由于培养物中含有肿瘤细胞、残留的基质细胞以及不同程度的死细胞，因此即使孔中GFP+细胞比例低至10%，也可将其移植至宿主小鼠体内。</li>
	<li>将转导的细胞从6孔板转移至15 ml锥形管中。向孔中加入1 ml乳腺球培养基，以收集残留的所有细胞。置于冰上。</li>
	<li>加入10 ml HBSS/hepes至转导细胞中，于4 °C下以300 x g离心5 min。小心吸除上清液，将细胞沉淀于冰上重悬于50 µl基底膜提取物（BME）中。 
	注意：使用前1-2小时需将BME分装样品置于冰上解冻。BME在室温下会凝固，因此必须始终保存在冰上。</li>
	<li>将BME包埋的细胞加载到0.5 ml胰岛素注射器中，置于冰上保存，并送至动物实验中心用于重新移植到NSG小鼠体内。</li>
	<li>使用5%异氟烷/95%氧气麻醉4至8周龄雌性NSG小鼠5分钟，随后使用2%异氟烷/98%氧气维持麻醉，或根据批准的动物研究伦理协议进行操作。</li>
	<li>当动物对疼痛刺激（如夹趾）无反应时，先用聚维酮碘清洁注射部位，再用乙醇棉片擦拭，随后将50 µl细胞悬液注入4th 乳腺脂肪垫。根据已批准的实验方案，为小鼠提供镇痛以减轻注射不适。</li>
	<li>让细胞形成肿瘤（2 - 12 周），并使用可调光系统监测 GFP 和/或荧光素酶活性 体内 荧光素酶成像系统（图2). 
	注意：遵循机构动物研究伦理委员会批准的麻醉、镇痛、肿瘤负荷测量及安乐死标准操作规范。</li>
</ol>
8. 标记PDX的质量控制
<ol>
	<li>通过评估标记肿瘤中荧光素酶和GFP的表达来确定标记效率。 
	注意：遵循机构动物研究伦理委员会批准的程序 体内 生物发光成像（图2、图3).
	<ol>
		<li>当肿瘤直径达到1.0–1.5 cm（或根据已批准的实验方案在更早时间，如步骤4所述）时，从安乐死的小鼠中分离肿瘤。解剖应在可调节光源系统（或可评估GFP荧光的等效系统）下进行。</li>
		<li>在显微镜下定性估计每个肿瘤中GFP+肿瘤所占的百分比。若低于100%，仅分离GFP+部分。切取一个3 mm的组织圆片，用10%福尔马林固定，用于石蜡包埋和组织学分析；保留一小块组织用于RNA或其他所需分析；并将尽可能多的肿瘤组织保存于含90% FBS/10% DMSO的独立1.5 ml冻存管中，用于冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将标记的肿瘤组织块重新植入新的受体NSG小鼠18 用于扩展并开展实验性转移研究。</li>
	<li>对转导前及之后每一代获取的肿瘤来源石蜡包埋组织进行标准免疫组织化学染色，以验证标记的PDX模型在组织学上是否与原始PDX模型保持一致。 
	注意：用于质量控制的标志物随每例PDX的不同而变化。对于乳腺癌PDX模型，建议在初步筛选中检测雌激素受体、孕激素受体、表皮生长因子受体2（HER2）、表皮生长因子受体1（HER1或EGFR）以及广谱细胞角蛋白（pan-CK）的表达。</li>
</ol>
9. 带有标记的PDX的实验性转移模型
<ol>
	<li>按照第4节所述步骤，从标记的PDX中解离肿瘤细胞。如果肿瘤血管化程度较高或富含小鼠间质成分，请按照4.5或4.6节所述进行癌细胞富集。</li>
	<li>使用台盼蓝排斥法计数活细胞，并将250,000个细胞用100 µl PBS（无Ca2+、Mg2+）重悬，供每只小鼠使用。细胞置于冰上保存。若需注射多只小鼠，请相应调整细胞数量（并额外准备至少一次注射量的富余，以弥补移液误差）。</li>
	<li>将冰上保存的细胞带至相应的动物实验操作室，并根据批准的IACUC方案进行心内注射。 
	注意：心内注射癌细胞的详细操作方案已在其他文献中描述22,23。</li>
	<li>通过生物发光成像随时间追踪并定量转移灶的扩散情况。在动物解剖时，利用生物发光和/或GFP成像技术对不同器官进行成像，以观察大体可见的转移灶24（图6）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

方案中的关键步骤：
高滴度慢病毒颗粒的使用（&#62;108 TU/ml）是本方案成功的关键步骤，因为它能够在培养过程中精确控制培养基的成分 体外 转导。尽管已有多种高滴度病毒颗粒的制备方法被详细描述18,19；本方案使用按以下详细方法制备的慢病毒颗粒 <a href="http://www.kottonlab.com">www.kottonlab.com</a>一种温和的肿瘤消化和癌细胞解离方法对于成功标记肿瘤及培养标记后的肿瘤至关重要。&#160; 延长消化时间超过三小时或将消化温度提高至37 °C可增加解离细胞数量，但会降低大多数肿瘤细胞的存活率及标记成功率。
修改与故障排除：
该方案应视为动态流程，需针对不同的患者来源异种移植瘤（PDX）在每一步骤中进行仔细监测并加以调整。尽管该标准方案对大多数异种移植肿瘤效果良好，但仍可能需要进行细微...

患者来源的肿瘤异种移植模型（PDX）是将手术切除的肿瘤样本直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的，相较于传统的细胞系异种移植模型具有多项优势，代表了癌症研究领域的重要进展1,2。PDX模型可通过连续传代进行维持和扩增，且在首代移植后肿瘤的遗传和生物学特性发生极少改变；与来源于人癌细胞系的异种移植模型相比，能更准确地反映肿瘤异质性3-8。目前，这些模型被广泛用作癌症个体化治疗的研究平台9,10、药物开发的临床前研究平台6,11，以及癌症生物学研究的实验工具4,12。
大多数PDX模型通过皮下植入和传代，可方便地使用游标卡尺随时间测量肿瘤的生长情况。然而，利用PDX模型模拟转移性疾病更具挑战性。对于乳腺癌而言，已有研究报道了能够向不同器官发生转移的异种移植模型。3,5,13，但其自发扩散至转移部位的频率极低。在已有报道中，转移负荷的鉴定与定量依赖于死后对靶器官进行费时费力的组织学检查。在实验性乳腺癌脑、肺、骨和肝转移模型中，通常采用表达生物发光（荧光素酶，Luc）或荧光（绿色荧光蛋白，GFP）基因报告系统的癌细胞系，通过心内、尾静脉、股骨内或脾脏注射方式进行研究。14-16尽管这些模型避开了原发性肿瘤的扩散过程，但它们对于研究器官趋向性和转移性定植机制具有重要价值。然而，源自患者原发肿瘤和PDX模型的细胞在使用标准方法时，转染或转导效率可能较低。一种替代策略是建立PDX来源的细胞系。 体外17，随后可使用常规的组织培养方案进行标记。然而，该方法并不适用于大多数PDX模型，因为这些模型难以建立细胞系，且建系过程可能导致细胞表型改变。本文介绍一种利用慢病毒载体对PDX解离肿瘤细胞进行转导的方案，适用于 体内 成像。此外，我们描述了通过将解离的、荧光素酶-GFP标记的PDX细胞经心内注射至免疫缺陷小鼠体内，以建立实验性转移模型的方法。
一种利用表达基因报告系统的慢病毒转导PDX来源解离类器官的基本实验方案此前已有描述 18在本方案中，我们描述了进一步富集人肿瘤细胞并实现接近100%转导效率的附加方法，以及使用标记的PDX模型检测实验性乳腺癌转移的技术。该方案可适用于多种PDX来源的癌症类型，使用不同的发光和荧光标记物进行标记，并可用于基因表达的调控即，shRNA 基因敲低）

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12（1:1）</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>BD 生物科学</td><td>354060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD 生物科学</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>抗真菌抗生素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>创新细胞技术</td><td>AM-105-500</td><td>消化缓冲液</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 红色钙液&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/毫克&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 自由</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex</td><td>Cultrex</td><td>3433-005-01</td><td>基底膜提取物（BME）</td></tr><tr><td>30 &amp;#176;C 摇床</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>Series 25 恒温振荡培养箱</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;#956;m 滤光片</td><td>Falcon</td><td>7352350</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Fisher</td><td>22079690</td><td></td></tr><tr><td>氯己定消毒剂</td><td>Durvet&amp;nbsp;</td><td>NDC# 30798-624-35</td><td></td></tr><tr><td>红细胞&amp;nbsp; 细胞裂解试剂</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>神经氨酸酶</td><td>Sigma</td><td>N7885-1UN</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM（CD326+）微珠*</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-061-101</td><td></td></tr><tr><td>小鼠谱系细胞耗竭试剂盒*</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mini MACS 磁力架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MS色谱柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>可使用 MS 或 LS 型柱，根据细胞数量进行调整。</td></tr><tr><td>Illumatool 可调光系统</td><td>Lightools 研究</td><td>各种</td><td>活体荧光成像</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS200 成像设备</td><td>Xenogen</td><td>各种</td><td>活体生物发光成像</td></tr><tr><td>人细胞角蛋白克隆MNF116单克隆抗体</td><td>DAKO</td><td>M0821</td><td>广谱细胞角蛋白&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>表皮生长因子受体抗体</td><td>细胞信号转导</td><td>4267S</td><td>EGFR</td></tr></tbody></table>

用于肿瘤生长与转移研究的乳腺癌患者来源异种移植瘤的可示踪报告标记

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

利用临床前模型研究肿瘤生物学特性及其对治疗的反应是癌症研究的核心。长期以来使用的人类细胞系以及许多转基因小鼠模型往往无法充分模拟人类恶性肿瘤的关键特征。因此，研究人员正在开发能够更好地反映患者肿瘤及其转移灶异质性的替代模型。将手术切除的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内建立的患者来源异种移植（PDX）模型因其可连续多代传代，且比来源于人类癌细胞系的异种移植模型更有效地保留肿瘤异质性，已成为一种具有吸引力的替代方案。PDX模型的一个局限性在于，难以对其进行转染或转导以引入可追踪报告基因或调控基因表达。本实验方案描述了高效转导PDX来源解离肿瘤细胞的方法，以及利用标记后的PDX模型开展乳腺癌转移实验研究的应用。该方案还展示了在实验性转移模型中使用标记PDX模型研究转移级联过程中器官定植的能力。通过活体动物的生物发光成像，或在解剖及离体器官中检测GFP表达，可方便地对不同器官中的转移灶进行可视化观察和定量分析。这些方法为拓展多种类型PDX模型在转移研究中的应用提供了有力工具。

本方法描述了使用高滴度慢病毒载体pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro和pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W对PDX来源的解离乳腺癌细胞进行转导。这些载体表达荧光标记物，可用于评估转导效率 体外，早在感染后24小时即可观察到（图1a）。对于大多数PDX模型，感染后GFP的表达会延迟长达72小时（图1b），此时通常可观察到细胞聚集体的形成。在富集人源癌细胞后，可实现转导（即， 使用 Lin+ 细胞耗竭法， 图1a）或在粗制PDX解离细胞中（图1b）。对于血管丰富的肿瘤，建议富集肿瘤上皮细胞，因为小鼠的血细胞在活细胞总数中占比较大。
一旦转导效率得到验证 体外，标记的细胞被收集并悬浮于细胞外基质中，重新植入NSG小鼠体内。标记的肿瘤...

我们描述了一种利用表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的慢病毒颗粒对患者来源的异种移植瘤（PDXs）进行稳定标记的方法。该方法可用于追踪PDXs在原发部位的生长情况，并能够通过活体成像检测自发性及实验性转移灶。 体内 成像系统

使用临床前模型研究肿瘤生物学特性及其对治疗的反应是癌症研究的核心。长期建立的人类细胞系以及许多……

本转导方案的总体目标是将报告基因稳定地导入患者来源的异种移植瘤（PDX）中，以促进其在实验性及自发性转移模型中的应用。该方法有助于解答癌症研究中的关键问题，例如患者来源异种移植瘤发生皮肤外转移的程度。该技术的主要优势在于，可通过活体成像对标记后的PDX进行追踪，从而在无需大量死后组织学分析的情况下，实现对有序、特异性转移的评估。演示本方案的将是常规应用该方法标记乳腺癌患者来源异种移植瘤的博士后研究员 Jessica Finlay-Schultz。采用无菌技术操作，首先使用手术刀在肿瘤周围切割皮肤。然后用镊子拉起皮肤，并使用洁净的手术刀将皮肤与肿瘤分离。当肿瘤完全暴露后，使用一套洁净的镊子和手术刀将组织转移至盛有5 mL冰上预冷洗涤液的容器中。随后，弃去洗涤液，并用10 mL含HEPES的HBSS溶液将肿瘤组织清洗两次。将清洗后的肿瘤置于无菌的、预先称重的60 cm²细胞培养皿中，称量培养皿总重以估算肿瘤质量。使用手术刀将肿瘤切成两半。然后从其中一半切取一个三毫米的组织圆片，并将该圆片置于10%福尔马林中固定24小时。向剩余的肿瘤组织中加入200微升含HEPES的HBSS溶液，用镊子和洁净的手术刀将组织切碎至尽可能小的片段。将组织碎片转移至一个无菌的50毫升锥形管中，每100毫克肿瘤组织加入至少1毫升消化缓冲液，并添加抗真菌剂和抗生素。在30摄氏度、125至200转/分钟的条件下孵育3小时后，加入35毫升洗涤培养基以终止消化反应，并将所得组织悬液通过70微米尼龙筛网过滤至新的50毫升锥形管中，以去除未消化的组织。通过离心收集细胞，并将沉淀物重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育5分钟。裂解结束后，加入10毫升洗涤缓冲液以恢复渗透压，并通过40微米滤膜过滤细胞，去除任何团块。再次离心细胞，并将沉淀重悬于5毫升预冷的洗涤缓冲液中，置于冰上。然后通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量。为了通过谱系阳性细胞和黑色素细胞耗竭法富集人上皮癌细胞，将最多1 × 10⁷个细胞转移至一个新的5 mL聚丙烯管中，并向细胞中加入2 mL上皮细胞富集缓冲液。通过离心收集细胞，并用移液器彻底去除上清液。接着，将细胞沉淀重悬于40 µL预冷的上皮细胞富集缓冲液中，并按每1 × 10⁷个细胞加入10 µL生物素标记抗体混合物。通过轻柔吹打混匀，将细胞悬液在4摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，每1 × 10⁷个细胞加入30微升上皮细胞富集缓冲液，混匀。随后加入20微升抗生物素微珠，轻柔混匀。在 4 摄氏度下孵育 15 分钟后，用 3 毫升冷的上皮细胞富集缓冲液洗涤细胞，并小心吸除上清液。将沉淀物重悬于 500 微升冰上预冷的上皮细胞富集缓冲液中，然后将柱置于磁力分离器中。用 0.5 毫升上皮细胞富集缓冲液冲洗柱。在柱子下方放置一个新的聚丙烯收集管。然后将标记的细胞缓慢加至柱子上。收集富集后的未标

labeling-breast-cancer-patient-derived-xenografts-with-traceable

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

可追踪记者乳腺癌患者来源的移植瘤贴标肿瘤生长和转移的研究

扩散荧光断层成像为临床前研究提供了一种相对低成本且潜在高通量的方法 体内...

小动物中用于癌症生物标志物定位的计算机断层扫描引导时域漫射荧光断层成像

以下视频介绍了一种用于标记患者来源异种移植瘤（PDX）肿瘤细胞的转导技术，该技术通过慢病毒将表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的载体导入肿瘤细胞...

转导标记PDX肿瘤细胞：体外将表达荧光标记的慢病毒导入肿瘤细胞

本论文详细描述了一种利用循环肿瘤细胞（CTCs）建立前列腺癌患者来源的异种移植模型（PDXs）的方法。通过循环肿瘤细胞建立PDX模型，为研究前列腺癌提供了一种替代性实验模型；前列腺癌是男性中最常被诊断出的肿瘤，也是男性因癌症死亡的常见原因。...

从循环肿瘤细胞建立前列腺癌患者来源的异种移植模型

卵巢癌转移的特点是存在大量弥散性腹膜内病灶，因此准确目视量化肿瘤负荷具有挑战性。本文描述了一种方法 原位 和 离体...

腹腔内卵巢癌转移的定量分析

本文介绍了研究肺泡巨噬细胞在癌症转移中功能的模型和方法。为了阐明这些细胞在转移过程中的作用，采用了同源性乳腺癌（4T1）模型，并结合使用氯膦酸盐脂质体耗竭肺泡巨噬细胞。...

研究肺泡巨噬细胞在乳腺癌转移中的作用

我们描述了一种用于临床前体内追踪癌症转移的实验方案。该方法基于一种放射性核素-荧光双模报告系统，结合了可通过无创[18F]四氟硼酸盐-PET检测的钠碘同向转运体以及用于简化体外验证的荧光蛋白。该方法不仅适用于肿瘤生物学研究，还可广泛应用于其他领域的临床前体内细胞示踪。...

放射性核素-荧光报告基因成像技术用于追踪啮齿类动物肿瘤模型中的肿瘤进展

本文介绍了一种利用超声引导将神经母细胞瘤（NB）和尤文肉瘤（ES）细胞（包括已建立的细胞系和患者来源的肿瘤细胞）注射到具有生物学相关性部位的实验方案，以建立可靠的癌症研究临床前模型。...

利用超声引导组织定向细胞植入法建立具有生物学相关性的转移性肿瘤异种移植模型

本研究提出了一种先进的方案，通过检测绿色荧光蛋白和生物发光信号，并结合定量分子检测技术，精确评估肿瘤负荷。...

利用原位乳腺癌模型研究三阴性乳腺癌

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。...

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

该论文描述了一种方法，用于建立原位注射乳腺肿瘤后自发性肺转移模型，并对转移级联各阶段进行纵向生长监测，适用于干预转移过程的各个阶段。...

体内成像检测原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

本方案描述了一种高效、非手术的小鼠原位移植乳腺癌患者来源异种移植瘤的方法。该技术包括酶解法解离肿瘤组织，随后直接注射至乳腺脂肪垫中，可实现高通量移植。通过全面的验证确保模型的可靠性，有助于开展针对多种乳腺癌亚型的严谨研究。...

高通量解离与原位移植乳腺癌患者来源的异种移植瘤

学习使用慢病毒颗粒稳定标记患者来源异种移植瘤（PDX）的方法，通过绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因实现肿瘤生长与转移的实时活体成像追踪。该技术可减少死后组织学分析需求，适用于多种癌症类型的转移研究。

用于肿瘤生长与转移研究的乳腺癌患者来源异种移植瘤的可示踪报告标记

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