靶向小鼠内耳给药方法的比较研究：鼓泡术 与 经鼓室注射

本研究的总体目标是描述并比较两种用于向内耳局部给药的显微外科方法，在听力参数和耳蜗细胞结构标志物方面的影响。这些手术方法有助于我们回答听觉领域的关键问题，特别是在动物前药化学研究的开发中。这些技术的主要优势在于其微创性。

这使得药物能够以教学示范的方式到达内耳。这些技术的应用延伸至听力损失的治疗，因为其显微外科操作适用于中耳的干式给药。对该方法的清晰演示至关重要，因为鼓室造口术和经鼓膜注射难以掌握，需要具备解剖学知识和外科训练基础。

首先，将耳塞插入麻醉小鼠的对侧耳中，以获得主要的单耳听觉反应。然后，将小鼠俯卧位放置于隔音屏蔽室内的加热垫上。将正极不锈钢皮下针电极置于颅顶两耳之间的头皮上方。

将参考电极置于耳廓下方的腮腺区域。然后将接地电极置于背部、尾部或后肢区域。检查正极和负极电极的电学阻抗。

确保阻抗小于三千欧姆。将预装好的扬声器置于固定距离处，正对选定的耳朵，使扬声器中心与外耳道口对齐。确保扬声器与耳朵之间无任何障碍物，并且耳廓完全打开。

将数字-模拟工作站输出端连接至选定的扬声器。此处使用自由场扬声器。将低噪声、高信噪比的放大器连接至模拟-数字输入端。

然后开始使用预设刺激或通过适当软件设计的新信号，将声刺激传入外耳道。以高强度开始给予刺激，随后以5至10分贝声压级为步长逐步降低刺激强度。记录刺激后前10毫秒内的电生理反应，因为诱发电位ABR反应通常出现在6至8毫秒之间。

按照方案书面部分所述，使用软件确定ABR阈值。根据批准的方案实施麻醉后，通过检查足趾夹捏无反应且呼吸规律，确认已达到外科麻醉水平。使用电推剪去除颈部腹面的毛发，并使用羟丙基甲基纤维素凝胶保护眼睛，防止角膜炎。

将小鼠置于无菌手术区域，呈仰卧位。使用聚维酮碘基消毒液清洁皮肤，并覆盖无菌手术巾。用手术刀从下颌至锁骨处做一条两厘米长的纵向切口后，通过手术显微镜观察，辨认下颌下腺。

用镊子分离两侧下颌下腺，将其牵开，定位面神经处二腹肌的起始位置。接着，用剪刀在二腹肌起始处做切口，并将其向腹侧牵开，暴露其下方的鼓泡腹内侧部分。然后，使用27号针头钻入鼓泡，形成一个开口。

使用可吸收明胶海绵清洁钻孔区域的血液。在圆窗膜内找到紧邻的镫骨动脉。使用34号导管和玻璃微量注射器，通过耳囊造口缓慢地将三到五微升的载体溶液直接注射到圆窗龛内，使其充满。

用一到两滴组织粘合剂封闭气囊造口。将下颌下腺复位至初始位置，并用5-0丝线缝合皮肤切口。在切口周围涂抹聚维酮碘或氯己定类消毒剂，以防止伤口感染。

将小鼠置于加热垫上，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。只有在动物完全恢复后，方可将其放回饲养笼。将小鼠置于侧卧位，并在耳廓外下方的无菌手术区域进行准备，操作方法如前所述。

在耳道外侧垂直部分做一个0.5厘米的纵向切口后，在手术显微镜的辅助下定位鼓膜。识别位于下部紧张部的上部松弛部，该区域由锤骨柄分为前部和后部。然后，在松弛部的尾侧做一个小的鼓膜切口，并在鼓膜紧张部再做一个附加切口，以便在注射过程中排出空气。

使用连接34号导管的玻璃微量注射器，通过松弛部轻轻注入10至15 µL的给药溶剂，靠近圆窗龛处，直至中耳明显充满。用5-0丝线外科缝合线缝合皮肤切口，并按前述方法清洁。该图显示了雄性8周龄C57BL/6J小鼠在手术前以及显微手术后7天、14天和28天对点击刺激的ABR阈值。

鼓室造口数据以橙色表示，经鼓膜注射数据以蓝色表示，未手术动物的数据以灰色表示。该图显示了显微手术后相同时间段内对8至40千赫纯音刺激的听性脑干反应（ABR）阈值。同样，鼓室造口法与经鼓膜注射法之间未观察到显著差异。

形态学研究表明，通过圆窗给药或经鼓膜注射给予溶剂后，蜗管未出现结构改变，表明任一操作本身均不会造成损伤。在进行圆窗给药操作时，需注意回顾啮齿类动物中耳和内耳周围的关键解剖结构。完成这些操作后，可进一步实施其他技术步骤。

例如，柏林采样用于药代动力学研究。这些技术在建立后，为听觉神经科学领域的研究人员探索动物模型（主要为啮齿类动物）中的潜在局部治疗方法铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在中耳给药以及如何评估啮齿类动物的听力。