Name: 脂肪酸鉴定蜡状芽孢杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习利用气相色谱质谱联用技术鉴定蜡状芽孢杆菌脂肪酸组成，无需纯化即可分析甲基支链和双键位置。该方法适用于多种细菌分类学研究。

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作者感谢 Thomas Mison 提供的技术支持，以及 Rachel Kopec 对稿件的修改。

1. 细菌培养
<ol>
	<li>通过将100 µl在LB（Luria-Bertani培养基）中于30 °C培养过夜的细菌（Bacillus cereus菌株ATCC 14579）培养物均匀涂布于LB琼脂平板表面，制备细菌菌苔。将平板在30 °C下过夜培养。</li>
</ol>
2. ECL：等效碳链长度
<ol>
	<li>按如下公式计算 ECL：<img alt="精确质量计算公式，ECLi=n+(Rt-Rtn)/(Rt(n+1)-Rtn)，化学方程式。" src="/files/ftp_upload/54960/54960eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程">，其中： 
	i，为目标溶质； 
	n，为在目标溶质 i 之前洗脱的直链饱和脂肪酸甲酯的碳原子数； 
	n+1，为在目标溶质 i 之后洗脱的直链饱和脂肪酸甲酯的碳原子数； 
	Rti、Rtn、Rt(n+1)，分别为上述脂肪酸甲酯（FAME）峰的保留时间。 
	​注意：通过进样直链饱和脂肪酸甲酯标准品混合物（BAME）获得其保留时间。</li>
</ol>
3. 脂肪酸甲酯的制备与分析
<ol>
	<li>为获取脂质脂肪酸，用刮刀从琼脂平板上刮取菌落，收集40 mg（鲜重，相当于109个活菌细胞）细菌样品，转移至带有螺口盖和聚四氟乙烯（PTFE）密封垫的10 ml玻璃试管中。</li>
	<li>采用如下所述的酯键法进行转酯化反应14,15。
	<ol>
		<li>向新鲜细菌细胞中加入5 ml含0.2 M KOH的甲醇溶液，于37 °C孵育1小时。该反应为碱性甲醇解反应，可断裂脂质中的酯键，生成脂肪酸甲酯。</li>
		<li>加入1 ml 1 M乙酸以降低pH至7.0。使用pH试纸检测pH值。</li>
		<li>加入3 ml正己烷以萃取脂肪酸甲酯（FAMEs）。</li>
		<li>将上清液（有机相）转移至洁净试管中，在持续氮气流下室温蒸发浓缩，获得约200 µl提取物。将样品转移至带衬管的气相色谱小瓶中。</li>
		<li>将提取物注入气相色谱-质谱联用（GC-MS）系统中进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 气相色谱/质谱条件
<ol>
	<li>将FAME样品注入配备ZB-WAX毛细管柱（长度30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 µm）的气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）中。</li>
	<li>将进样口设置为不分流模式，温度设为250 °C；以氦气为载气，线性流速为37 cm/sec。程序升温条件如下：柱温初始保持在50 °C，维持1 min，以20 °C/min的速率升至190 °C，再以2 °C/min的速率升至最终温度230 °C。</li>
	<li>质谱检测采用电子轰击电离（EI）模式，电离能量为70 eV，全离子流扫描范围设定为50–400原子质量单位（amu），扫描速率为2次/秒。</li>
	<li>如需分析，将DMOX和吡啶基衍生物在相同条件下进样，仅程序升温条件调整如下： 
	DMOX：50 °C（1 min），以20 °C/min升至210 °C，再以2 °C/min升至240 °C（保持5 min）； 
	吡啶基衍生物：60 °C（1 min），以20 °C/min升至220 °C，再以2 °C/min升至250 °C（保持20 min）。</li>
</ol>
5. 由FAME制备吡啶基酯16
<ol>
	<li>用氮气流将第3部分的FAME提取物蒸发至干（至少含10 mg干物质），溶于1 ml无水二氯甲烷中。</li>
	<li>配制 1.0 M 的氯化钾溶液 ter四氢呋喃中的叔丁醇钾</li>
	<li>将FAME提取物和0.2 ml 3-吡啶甲醇加入0.1 ml步骤5.2中制备的溶液中。</li>
	<li>加热溶液 40 °C 在密闭小瓶中孵育30分钟。</li>
	<li>冷却至室温后，加入纯化去离子水（2 ml，参见 材料表）和正己烷（4 ml）。涡旋混合，静置分相，收集有机相。</li>
	<li>加入无水硫酸钠直至有机相完全澄清，干燥。转移至洁净离心管中，随后蒸发至干。 200 µl将样品转移至带有内插管的气相色谱小瓶中。</li>
</ol>
6. 由脂肪酸甲酯制备DMOX衍生物17
<ol>
	<li>用氮气流将第3节中的脂肪酸甲酯（FAME）提取物蒸发至干（至少含10 mg干物质）。</li>
	<li>向FAME干提取物中加入250 mg的2-氨基-2-甲基-1-丙醇。用氮气吹扫容器，加盖密封后，置于190 °C加热块中过夜。</li>
	<li>冷却至室温后，向试管中加入3 ml二氯甲烷和5 ml纯化去离子水（参见材料表）。</li>
	<li>振荡以实现相分离，然后移除水相。</li>
	<li>用5 ml水洗涤有机相。振荡以实现相分离，然后移除水相。</li>
	<li>加入无水硫酸钠干燥有机相，直至其完全澄清，然后转移至洁净试管中。用氮气流吹干，浓缩至体积为200 µl。将样品转移至带内插管的GC小瓶中。</li>
</ol>

<ol><li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristie%2C+WW+%22Lipid+Analysis+4th+Edition%22">Lipid Analysis 4th Edition</a>. , Oily press. (2010).</li>
<li>HÜbschmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%9Cbschmann%2C+H-J+%22Handbook+of+GC-MS%3A+fundamental+and+application.+Third+edition%22">Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition</a>. , Wiley-vch. (2015).</li>
<li>Sasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacteria+by+Gas+Chromatography+of+Cellular+Fatty+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22MIDI+Technical+note%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids.</a> MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).</li>
<li>Spitzer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+analysis+of+fatty+acids+by+gas+chromatography+-+Low+resolution+electron+impact+mass+spectrometry+of+their+4%2C4-dimethyloxazoline+derivatives+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review.</a> Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarvey%2C+DJ+%22Advances+in+lipid+methodology.+Volume+1%22">Advances in lipid methodology. Volume 1</a>. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).</li>
<li>Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+fatty+acids+in+Bacillus+environmental+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation.</a> Front Microbiol. 6, (2015).</li>
<li>Brillard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacillus+cereus+Genes+Specifically+Expressed+during+Growth+at+Low+Temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).</li>
<li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Anaerobiosis+and+Low+Temperature+on+Bacillus+cereus+Growth%2C+Metabolism%2C+and+Membrane+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).</li>
<li>Diomandé, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+CasK%2FR+two-component+system+in+optimal+unsaturation+of+the+Bacillus+cereus+fatty+acids+during+low-temperature+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth.</a> Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).</li>
<li>Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerkeley%2C+RCW+%22Applications+and+Systematics+of+Bacillus+and+Relatives%22">Applications and Systematics of Bacillus and Relatives</a>. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).</li>
<li>Kämpfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+and+Possibilities+of+Total+Fatty+Acid+Analysis+for+Classification+and+Identification+of+Bacillus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22System.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species.</a> System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).</li>
<li>Kaneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty-acids+of+genus+bacillus+-+example+of+branched-chain+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference.</a> Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).</li>
<li>Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+Biosynthesis+of+Unsaturated+Fatty+Acids+in+Bacillus+cereus+ATCC+14579+and+Functional+Characterization+of+Novel+Acyl-Lipid+Desaturases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).</li>
<li>Sasser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Bacillus+anthracis+from+culture+using+gas+chromatographic+analysis+of+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters.</a> J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).</li>
<li>Schutter, M. E., Dick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fatty+acid+methyl+ester+%28FAME%29+methods+for+characterizing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci+Soc+Am+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities.</a> Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).</li>
<li>Destaillats, F., Angers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+methodology+for+the+synthesis+of+FA+picolinyl+esters+from+intact+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Oil+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids.</a> J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).</li>
<li>Fay, L., Richli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+double-bonds+in+polyunsaturated+fatty-acids+by+gas-chromatography+mass-spectrometry+after+4%2C4-dimethyloxazoline+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization.</a> J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).</li>
<li>Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+in+mass+spectrometry+IV-2-alkenyl-4%2C4-dimethyloxazolines+as+derivatives+for+the+double+bond+location+of+long-chain+olefinic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Mass+Spect%22%5BJournal%5D)">Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids.</a> Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).</li>
<li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsaturated+fatty+acids+from+food+and+in+the+growth+medium+improve+growth+of+Bacillus+cereus+under+cold+and+anaerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).</li>
<li>Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic+characterization+of+fatty+acids.Identification+constants+for+mono-+and+dicarboxylic+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters.</a> Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).</li>
<li>van Den Dool, H., Kratz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalization+of+the+retention+index+system+including+linear+temperature+programmed+gas-liquid+partition+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography.</a> J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).</li>
<li>Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+equivalent+chain+length+values+of+monoenic+and+polyenic+%28methylene+interrupted%29+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+High+Res+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids.</a> J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

表1中所示的脂肪酸（FAs）色谱图谱对应于在琼脂平板表面培养的B. cereus ATCC 14579。当该细菌在相同温度下于通气的液体培养基中培养时，也获得了相似的图谱8。对于在液体培养基中培养的细菌，可通过离心收集菌体生物量，并可根据既定的实验方案，依据不同的培养条件进行洗涤8,19。对B. cereus产生的各类脂肪酸进行鉴定，使得在某些对低温生长至关重要的基因发生突变的菌株中，脂肪酸比例的细微变化得以被检测到7,9。
通常，ECL 是根据在固定温度下（使用恒温控制的色谱柱 oven）测得的校正保留时间的对数值来计算的20。此处由于采用了非恒温 oven 以实现目标脂肪酸甲酯（FAME）的优化分离，所采用的计算方法为先前报道的线性保留指数计算方法3,21。
本研究的目的并非将计算得到的ECL值与文献中描述的数值进行比较，而是基于这些保留数据和光...

脂肪酸甲酯（FAME）气相色谱法（GC）是脂质表征的关键方法。在经过短暂提取步骤后，该方法可快速分离并定量样品中的各种脂肪酸（FA）。甲酯衍生物具有高挥发性、稳定性，并且对色谱柱呈惰性，从而避免了拖尾峰的出现。当样品由已知脂肪酸组成时，其鉴定过程较为直接，因为色谱图谱已有发表或可与标准品进行比对。此外，由于各类脂肪酸对火焰离子化检测器（FID）的响应几乎恒定，因此无需重复进样校准标准品即可实现定量1。
除了火焰离子化检测（FID）外，质谱（MS）检测可提供一组互补信息以确认脂肪酸甲酯（FAMEs）。然而，当采用电子轰击电离（EI）对FAMEs进行电离时，所得质谱图并不总能用于鉴定脂肪酸的精细结构。例如，支链位置（即， 支链甲基难以预测，因为诊断离子难以检测1 且目标离子丰度的特征变化依赖于仪器，导致无法使用质谱库2另一个挑战在于确定双键的位置，因为电子轰击电离（EI）会导致双键迁移。因此，双键位置不同的脂肪酸异构体无法通过其质谱图加以区分。幸运的是，目前已开发出其他用于脂肪酸鉴定的工具。例如，可通过计算等效碳链长度（ECL）来推断脂肪酸中支链或双键的存在及其位置。3.
其他衍生化方法会产生不同的质谱图，具体取决于双键或支链甲基的位置。4,4-二甲基噁唑啉衍生物（DMOX）4 可用于简便地确定单不饱和脂肪酸双键的位置。3-吡啶基甲醇酯（吡啶甲酯）衍生物则可明确鉴定甲基支链脂肪酸的位置5。结合色谱保留值（ECL）与质谱（DMOX 和吡啶甲酯）信息，可鉴定大多数脂肪酸，而无需采用核磁共振（NMR）谱所需的复杂纯化方法；核磁共振是结构表征的无可争议的方法1。
属于细菌属的 芽孢杆菌属，其中包含一些人类和动物病原体，能够定植于高度多样的生态位，因此在环境中广泛分布6. 其中包括 芽孢杆菌属 属，脂肪酸组成受物种生态位的影响，通过脂肪酸模式的调整以适应广泛的环境变化（例如培养基、温度、pH 等等。)7-9由于属内各物种的脂肪酸模式具有相对的一致性 芽孢杆菌属 在标准化条件下生长期间，脂肪酸组成测定是用于定义的若干关键标准之一 芽孢杆菌属 物种。一个独特的属性是 芽孢杆菌属 属的特征是含有12-17个碳的支链脂肪酸丰度较高10-12 其中异构体与反异构体的比例是适应环境条件的关键决定因素。 芽孢杆菌属 物种还通过改变不饱和脂肪酸的比例来适应环境波动。在某些物种中，例如 蜡样芽孢杆菌， 两种脂肪酸去饱和酶在烷基链的不同位置形成双键13 在适应过程中具有不同作用9示例 芽孢杆菌属 属的分析凸显了准确定位双键位置和脂肪酸支链结构的重要性。综上所述，脂肪酸的鉴定 芽孢杆菌属 FA 模式具有多种实用应用。本文中，我们提出一种新型的 GC-MS 方法用于 芽孢杆菌属 克服经典气相色谱-质谱分析固有局限性的脂肪酸图谱鉴定方法
这种创新方法可直接用于原始生物材料，结合了现有技术：不同脂肪酸衍生物（FAME、DMOX和吡啶基酯）的保留时间（ECL）信息和质谱数据。
我们采用以下脂肪酸命名法。i、a 和 n 分别表示异支链、前异支链和直链脂肪酸。不饱和脂肪酸以 C:d 表示，其中 C 代表脂肪酸中的碳原子数，d 代表双键数目。Δx 表示双键的位置，即从羧基端开始计数，位于第 x 个碳-碳键处。

<table><tbody><tr><td>气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）</td><td>Shimadzu</td><td>QP2010</td><td></td></tr><tr><td>毛细管色谱柱 ZB WAX</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25&amp;nbsp;&amp;micro;m</td></tr><tr><td>色谱纯甲醇（Methanol Lichrosolv）</td><td>VWR</td><td>1.06018.2500</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃（THF）</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>28559.320</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>23373.320</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Hipersolv Chromanorm</td><td>24575.320</td><td></td></tr><tr><td>3-吡啶甲醇（3-pyridinemethanol）</td><td>Aldrich</td><td>P6-680-7</td><td></td></tr><tr><td>叔丁醇钾</td><td>Aldrich</td><td>156671</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基-2-甲基-1-丙醇</td><td></td><td>A-9879</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Academic 超纯水系统</td><td>Millipore</td><td>ZMQS50001</td><td></td></tr><tr><td>细菌脂肪酸甲酯（BAME）混合标准品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td></td></tr></tbody></table>

bacillus cereus 中脂肪酸的鉴定

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Bacillus 属细菌含有支链和不饱和脂肪酸（FAs），其甲基支链（异构或前异构）及双键位置具有多样性。脂肪酸组成的变化在细菌适应环境过程中起着关键作用。这些修饰涉及异构与前异构支链脂肪酸比例的改变，以及不饱和脂肪酸相对于饱和脂肪酸比例的变化，且双键在特定位置形成。精确鉴定脂肪酸谱对于理解 Bacillus 属物种的适应机制至关重要。
许多来自芽孢杆菌属（Bacillus）的脂肪酸（FAs）尚未商业化供应。本文提出的方法通过结合保留时间信息（通过计算等效碳链长度（ECL））与三类脂肪酸衍生物的质谱数据，实现对脂肪酸的鉴定：脂肪酸甲酯（FAMEs）、4,4-二甲基恶唑啉衍生物（DMOX）以及3-吡啶基甲醇酯（picolinyl）。该方法无需对未知脂肪酸进行纯化即可完成鉴定。
将枯草芽孢杆菌（Bacillus cereus）制备的脂肪酸甲酯（FAME）色谱图谱与商业标准品混合物进行比较，可实现对直链饱和脂肪酸的鉴定、等效碳数（ECL）的计算，并对其他脂肪酸的种类作出推断。支链饱和脂肪酸（如异构或反异构型）的FAME相较于具有相同碳原子数的直链饱和脂肪酸，在ECL上表现出恒定的负向偏移。不饱和脂肪酸的FAME可通过其分子离子质量进行检测，其ECL相对于对应的饱和脂肪酸则呈现正向偏移。
通过分别分析吡啶基和DMOX衍生物的电子轰击电离质谱图，可以确定脂肪酸的支链位置以及不饱和脂肪酸双键的位置。该方法可鉴定出B. cereus提取物中所有未知的饱和支链脂肪酸、不饱和直链脂肪酸和不饱和支链脂肪酸。

细菌细胞中脂肪酸鉴定的策略如图1所示。每个步骤提供互补的光谱信息或色谱保留信息。步骤1使用标准溶液进行脂肪酸的初步鉴定。步骤2通过解析脂肪酸甲酯（FAME）的电子轰击电离（EI）质谱及其等效链长（ECL），对产物进行初步鉴定。步骤3确定支链脂肪酸中支链的确切位置。最后，步骤4确定不饱和脂肪酸中双键的精确位置。
脂肪酸甲酯和电子碰撞电离
BAME混合物使我们能够鉴定出一系列直链饱和脂肪酸（n12至n17）以及一些甲基支链脂肪酸（i15、a15、i16、i17）。然而，在我们的样品中仅检测到极少数B. cereus特异性的脂肪酸，这说明了开发下述鉴定方法的必要性。
无论碳...

我们提出一种无需纯化即可鉴定脂肪酸的方案。该方法结合了三类脂肪酸衍生物的保留时间信息及其质谱数据，这三类衍生物分别为：脂肪酸甲酯（FAMEs）、4,4-二甲基噁唑啉衍生物（DMOX）和3-吡啶基甲醇酯（picolinyl）。

Bacillus cereus 中脂肪酸的鉴定

芽孢杆菌属含有支链和不饱和脂肪酸（FAs），其甲基分支位置（异链或反异链）及双键位置具有多样性……

本实验方案的总体目标是从细菌中鉴定脂肪酸，并确定甲基分支和双键的位置。该方法有助于解答细菌学领域中的一些关键问题，例如脂肪酸在细菌适应环境过程中的作用。该技术的主要优势在于无需对脂肪酸进行增殖。由于脂肪酸组成在细菌分类学中的重要性，该技术的应用前景可延伸至细菌鉴定领域。尽管本方法最初是在蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）上开发的，但它对于研究其他含有支链脂肪酸的物种也具有重要参考价值。在本方法的开发过程中，我们曾面临诸多挑战。由于现有的脂肪酸鉴定方法无法确定甲基支链在双键位置的情况。开始此操作前，取100 µL菌株的过夜培养物，在30 °C下于LB液体培养基中培养，将其均匀涂布于LB琼脂平板表面，制备细菌菌苔。将平板在30 °C下过夜培养。为了获得脂质脂肪酸，用刮取法从琼脂平板上收集细菌菌落，并将约40毫克样品转移至带有螺口盖和聚四氟乙烯（PTFE）密封垫的10毫升玻璃试管中。进行转酯化反应时，向新鲜细菌细胞中加入5毫升甲醇中的0.2摩尔氢氧化钾溶液。涡旋混匀，在37摄氏度下孵育一小时。随后加入1毫升1摩尔的乙酸，将pH值调至7。然后加入3毫升正己烷，涡旋1分钟，以萃取脂肪酸甲酯（FAMEs）。将上层相转移至洁净的离心管中，并在室温下用持续的氮气流吹干浓缩，得到约 200 微升的脂肪酸甲酯（FAME）提取液。随后，将提取液转移至带有内衬管的气相色谱进样瓶中。将提取液注入配备毛细管柱的气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）系统中。将进样口温度设为 250 摄氏度。将色谱柱温箱温度在 50 摄氏度保持 1 分钟，然后以每分钟 20 摄氏度的速率升至 190 摄氏度，再以每分钟 2 摄氏度的速率升至最终温度 230 摄氏度。对于质谱分析，采用70电子伏特的电子轰击电离（EI）方式记录质谱，并将总离子流的采集范围设定在50至400原子质量单位（AMU）之间。将干燥的脂肪酸甲酯（FAME）提取物样品溶解于1毫升无水二氯甲烷中。然后，将该提取液与0.2毫升的3-吡啶甲醇加入到0.1毫升1摩尔的叔丁醇钾四氢呋喃溶液中。将溶液在密闭小瓶中于 40 摄氏度加热 30 分钟。待溶液冷却至室温后，加入 2 毫升纯化去离子水和 4 毫升正己烷。使用涡旋振荡器混合溶液 1 分钟。静置使两相分层后，收集上层有机相。随后，加入无水硫酸钠直至有机相变得澄清。将有机相转移至洁净的离心管中，再在氮气流下蒸发有机相，直至体积约为200微升。向干燥的脂肪酸甲酯（FAME）提取物样品中加入 250 毫克 2-氨基-2-甲基-1-丙醇。用氮气吹扫试管后，用塞子密封。随后，将溶液在 190 摄氏度下加热过夜。待溶液冷却至室温后，加入3毫升二氯甲烷和5毫升纯化的去离子水。涡旋混合溶液，静置分层。随后移除水相。随后，用5毫升水洗涤有机相。加入无水硫酸钠直至有机相澄清。将有机相转移至新的试管后，在氮气流下蒸发至体积约为200微升。I16 吡啶甲酸衍生物的质谱证实了甲基支链结构。质荷比为 304 和 332 的离子之间相差 28 AMU，对应于支链碳前后形成的碎片。此处显示了 DMOX 衍生物的特征诊断离子 113 和 126。分子离子峰307是16:1异构体的特征峰，而196与208之间12 AMU的间隔表明双键位于碳原子上。当双键位于第7位碳之前时，该12 AMU的间隔不再出现。强烈的153离子峰是双键位于第5位碳的特征，结合DMOX衍生物质谱中出现的307分子离子峰，可确定该化合物为n16:1Δ5。DMOX衍生物的307离子和吡啶甲醇衍生物的345离子表明存在一种16:1脂肪酸异构体。28 AMU的质荷比差值指示支链位置，而DMOX的12 AMU和吡啶甲醇酯的26 AMU差值可确定双键位置。此处列出了在蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）中鉴定出的脂肪酸及其相应的特征离子。诊断离子可确定DMOX和吡啶甲酯衍生物在碳链上的甲基支链位置和双键位置。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两天内完成。按照本方案，可通过气相色谱-质谱法（GC-MS）对脂肪酸进行定量，并释放脂肪酸甲酯（FAME）衍生物。该技术发展之后，为细菌学领域的研究人员探索细菌多样性及细菌适应机制提供了新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何研究细菌中的脂肪酸，包括甲基支链脂肪酸和不饱和脂肪酸。请注意，使用试剂可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取相应预防措施，例如在通风橱中操作并佩戴手套。

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生物化学

脂肪酸鉴定<em&gt;蜡状芽孢杆菌</em

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

来源： Ginies, C., 等 脂肪酸的鉴定 Bacillus cereus. 视频实验杂志...

从细菌生物量制备脂肪酸甲酯（FAMEs）

分离和表征革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的脂质A区域，有助于深入了解基于细胞表面的抗生素耐药机制、细菌存活与适应性，以及化学结构多样的脂质A分子如何差异性地调节宿主先天免疫反应。...

革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

本文描述了一种基于机械细胞破碎、溶剂法脂质提取、转酯化反应以及气相色谱对脂肪酸进行定性和定量分析的方法，用于测定微藻中的脂肪酸含量及组成。采用三棕榈酸甘油酯作为内标物，以校正提取过程中可能发生的损失以及转酯化反应不完全所造成的影响。...

微藻中脂肪酸含量与组成的分析

Caenorhabditis elegans 是研究多不饱和脂肪酸在发育和生理功能中作用的有用模型。本方案描述了一种高效地向 C. elegans...

在 Caenorhabditis elegans 中补充多不饱和脂肪酸的饮食方案

脂肪酸13C同位素异构体分析为研究无脊椎动物消费者营养级碳转移及脂质代谢提供见解

该方法为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是Staphylococcus...

从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

本文介绍了一种提取多种分枝杆菌细胞壁总脂质含量的方案。此外，还展示了不同类型分枝菌酸的提取与分析方案。同时提供了一种薄层色谱法用于监测这些分枝杆菌化合物。...

通过薄层色谱法分析分枝杆菌的脂质组成

本文介绍一种利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自主开发的软件进行自上而下蛋白质组学分析，快速鉴定基因组测序的致病菌所产生蛋白质的实验方案。由于天冬氨酸效应，亚稳态蛋白质离子发生断裂，该特异性被用于蛋白质鉴定。...

抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析

本文介绍了一种利用重水（deuterium oxide）和气相色谱-质谱联用技术（GCMS）分析总脂肪酸的经济型定量方法 从头合成 棕色脂肪组织中的脂质生成 体内.

定量测定 从头合成 利用重水研究棕色脂肪组织中的脂肪酸合成

学习利用气相色谱质谱联用技术鉴定蜡状芽孢杆菌脂肪酸组成，无需纯化即可分析甲基支链和双键位置。该方法适用于多种细菌分类学研究。

Bacillus cereus 中脂肪酸的鉴定

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