Name: 使用了大气颗粒物引起的染色体畸变分析体外系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学习利用RAW264.7小鼠巨噬细胞体外检测大气颗粒物诱导的染色体畸变方法。该技术可直接观察颗粒物暴露造成的遗传物质损伤，为评估环境污染物对细胞遗传完整性的影响提供可靠手段。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院生物研究卓越中心 [资助号 1P20GM109005]、美国国家航空航天局阿肯色州空间资助联盟 [资助号 NNX15AK32A] 以及美国国家职业安全与健康研究所（NIOSH）[资助号 2T42OH008436] 的支持。作者谨此感谢 Christopher Fettes 对本文稿的校对与编辑工作。

1. 颗粒物的收集与制备
<ol>
	<li>大流量总悬浮颗粒物采样器的校准
	<ol>
		<li>将采样器电机与质量流量控制器断开，并将电机连接至稳定的交流电源（图1）。 
		注意：本步骤中不使用滤膜。</li>
		<li>将校准用孔口和顶部加载适配板安装到采样器上。牢固拧紧顶部加载适配器的固定螺母，确保无空气泄漏。让采样器电机预热至其正常工作温度（约10–15分钟）。</li>
		<li>用手覆盖孔口顶部的孔洞及孔口上的压力接口，进行漏气测试。仔细听是否有空气逸出产生的高频尖锐啸叫声。若听到该声音，说明存在泄漏，需重新拧紧顶部加载适配器的固定螺母。若声音较低，则泄漏可能位于系统中其他垫圈附近。</li>
		<li>使用橡胶真空管将水压计的一端连接至孔口侧面的压力接口，另一端保持向大气开放。将压差计垂直放置以确保读数准确。轻敲连续流量记录仪背面有助于使记录笔归中，从而获得准确读数。</li>
		<li>重复步骤1.1.2，采用五个代表30至60 ft/min（约每5–6 ft3/min）操作流量的流速。调节可变孔口上的旋钮至五个不同位置，并记录五个不同的读数。</li>
		<li>在校准表上记录环境空气温度、环境大气压、采样器序列号、孔口序列号、孔口斜率与截距及其上次认证日期、校准日期、采样地点以及操作人员姓名首字母。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>总悬浮颗粒物样品采集与重量分析
	<ol>
		<li>将一张8&#34; × 10&#34;石英纤维滤膜用两层铝箔包裹。将包裹好的滤膜放入马弗炉中，设定温度为550 °C，焙烧至少4小时。待炉温冷却后取出滤膜，放入装有CaCO3的干燥器中。</li>
		<li>使用精度为10 µg的微量天平称量滤膜。在一天内重复测量三次，各次测量值之间的差异应不超过25 µg。若未达到该要求，则将包裹好的滤膜重新放回干燥器，次日再次重复称量过程。</li>
		<li>打开采样罩盖（图2）。松开四个蝶形螺母，取下滤膜夹持框，使黄铜螺栓和垫圈向下摆动让开位置。将滤膜从铝箔中展开，使用洁净镊子小心地将滤膜粗糙面向上、居中放置于支撑筛网上，并正确对齐滤膜位置。</li>
		<li>将滤膜夹持框放回筛网上，用黄铜螺栓和垫圈固定，施加足够压力以防止边缘漏气。用干净布擦拭滤膜夹周围积聚的灰尘。小心关闭并固定采样罩盖。</li>
		<li>确保所有电源线已正确插入相应插座，并连接鼓风机电机压力接口与连续流量记录仪之间的管路。</li>
		<li>准备流量记录仪。按下记录笔抬升杆以抬起笔尖，插入新记录图表。将图表的定位标签对准记录仪驱动轴心，用拇指按压使图表中心卡入轴心。顺时针旋转驱动轴心，使图表上的正确时间与时间指示指针对齐，完成时间设定。</li>
		<li>手动开启采样器并开始采样。监测记录仪，确保其正常出墨，并检查经过时间指示器是否正常工作。</li>
		<li>采样结束后，关闭采样器，记录经过时间并取下记录图表。取下滤膜夹持框以暴露滤膜。用镊子轻轻夹住滤膜两端，从支撑筛网上取下已暴露的滤膜。将滤膜沿长度方向对折两次（使样品面接触样品面），然后用原始铝箔包裹。</li>
		<li>将滤膜在装有CaCO3的干燥器中至少存放24小时后再进行称重。重复步骤1.2.2，测量采样后滤膜的重量。将滤膜放入密封塑料袋中，于-80 °C保存，直至分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集的总悬浮颗粒物样品分析
	<ol>
		<li>取出保存的滤膜，展开铝箔，将滤膜转移至洁净的聚四氟乙烯（Teflon）表面。使用镊子和手术刀切除滤膜外侧（白色）部分并弃去。
		<ol>
			<li>随后将滤膜切成0.5&#34; × 0.5&#34;的小片，放入100 ml锥形瓶中。加入50 ml超纯水。将锥形瓶置于超声水浴中，在33±3 kHz条件下超声60分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用0.45 µm聚丙烯注射式滤器将滤液过滤至100 ml圆底烧瓶中。在50 °C条件下，使用旋转蒸发仪在减压下蒸发水分，直至烧瓶中剩余约5 ml提取液。
		<ol>
			<li>将剩余液体转移至已知重量的15 ml梨形烧瓶中，继续蒸发至干。称量含干燥提取物的烧瓶，记录干燥提取物的质量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用400 µl D2O溶解干燥样品，超声15分钟，然后转移至5 mm标准核磁共振（NMR）管中。在室温下以12,000 × g离心5分钟，去除未溶解物质。</li>
		<li>再用300 µl D2O重复洗涤一次。向NMR管中加入10 µl 1.4% NaN3溶液（终浓度：0.02% w/v）。再向NMR管中加入10 µl（32 µg）总悬浮颗粒物-d4（TSP-d4，3.2 mg/ml），使其在D2O中的终浓度为0.258 mM。</li>
		<li>使用600.17 MHz核磁共振波谱仪采集1H NMR谱图。
		<ol>
			<li>将NMR管插入三共振低温探头中。按以下顺序校准仪器：锁场、调谐、匀场、90°脉冲长度校准及接收增益调节。</li>
			<li>在25 °C下，采用数字四通道检测模式，使用包含180个水选择性脉冲的一维激发塑形序列采集谱图。扫描次数为8,192次，预扫描4次，谱宽8012.57 Hz，水信号抑制频率偏移设为4.70 ppm，采集时间1.70秒，时域数据点数32,768（TD），梯度持续时间1 msec（p16），梯度后恢复延迟100 µsec（d16）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对1H NMR谱图进行处理：应用1 Hz线宽展宽，零填充至2倍（共65,536个数据点）。手动校正相位和基线，并进行积分。将TSP-d4峰设定在0.0 ppm处。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 颗粒物暴露
<ol>
	<li>培养设置
	<ol>
		<li>在开始培养前至少30分钟，将含有10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素溶液（100 U/ml）的完全培养基、0.25%胰蛋白酶溶液以及无钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS）置于37 °C水浴中预热。</li>
		<li>从5% CO2培养箱中取出培养有RAW264.7细胞的T75培养瓶，用2 ml预热的PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>使用1 ml预热的胰蛋白酶溶液处理，随后轻轻刮擦，使贴壁的RAW264.7细胞从培养容器底部脱落。</li>
		<li>收集培养容器中的细胞，通过反复吹打制成单细胞悬液。用台盼蓝计数细胞，并以8,000/cm2的密度（总计500,000个细胞）接种于100 mm培养皿中，加入预热的完全培养基。调整培养基体积至10 ml，使最终细胞浓度为每毫升50,000个细胞。 
		注：若同时进行DNA甲基化分析，需将培养皿数量加倍。</li>
		<li>将新接种的RAW264.7细胞放回37 °C、5% CO2培养箱中，静置培养24小时使其贴壁。</li>
		<li>同时在生物安全柜中重悬过滤后的颗粒物。例如，将颗粒物用无菌PBS稀释至0.5 mg/ml以获得5 µg/ml的处理剂量，或稀释至5 mg/ml以获得50 µg/ml的处理剂量。稀释液可提前一个月配制，储存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颗粒物处理
	<ol>
		<li>从5% CO2培养箱中取出细胞，在倒置显微镜下以10倍物镜观察细胞生长状态、形态、培养条件及是否存在污染。此时细胞融合度应至少达到30%。</li>
		<li>在无菌条件下，使用无菌移液管吸除培养基，并用2 ml 37 °C的PBS洗涤培养容器两次，彻底去除残留培养基以及悬浮或死亡的细胞。</li>
		<li>在培养容器中加入预先确定剂量的颗粒物和新鲜培养基，于37 °C、5% CO2培养箱中孵育指定时间。本研究中，对RAW264.7细胞进行72小时PM处理，以与同步进行的基因毒性和表观遗传毒性分析暴露时间保持一致。 
		注：细胞毒性可能对染色体畸变分析的质量产生负面影响。因此，通常需对处理后的细胞额外开展细胞毒性、DNA甲基化、Western blot或基因表达分析等实验。按照上述方法处理细胞后，进行所需的特定检测。经验不足的操作者还可考虑设置阳性对照（如甲基磺酸甲酯），以验证其检测染色体畸变的能力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 染色体畸变分析实验
<ol>
	<li>使细胞停滞于中期的处理
	<ol>
		<li>将秋水仙胺溶液（10 µg/ml）在37 °C水浴中预热30分钟。在生物安全柜中用70%酒精擦拭瓶盖，以尽量减少污染风险。</li>
		<li>无菌条件下完全移除培养基，并用2 ml预热的PBS洗涤培养容器两次。</li>
		<li>向培养容器中加入含秋水仙胺溶液（5 µl/ml）的预热新鲜培养基（2 ml培养基/106个细胞），孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞收获
	<ol>
		<li>将胰蛋白酶溶液和PBS置于37 °C水浴中预热30分钟。从本步骤开始，无需维持无菌条件。</li>
		<li>完全移除培养基，用2 ml 37 °C的PBS洗涤培养容器两次，加入所需体积的预热胰蛋白酶溶液（通常60 mm培养皿或T25培养瓶加2 ml，100 mm培养皿或T75培养瓶加4 ml），将培养容器放回37 °C、5% CO2培养箱中孵育1分钟。</li>
		<li>取出培养容器，用细胞刮轻轻刮下细胞，并加入10 ml PBS以终止胰蛋白酶作用。</li>
		<li>用移液器反复吹打至少十次以制成单细胞悬液，并将细胞转移至15 ml锥底离心管中。</li>
		<li>在室温下，以400 × g离心5分钟（使用摆动转子离心机）。</li>
		<li>移除上清液，轻敲管壁使细胞沉淀松散，加入10 ml PBS，再次离心5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>低渗处理与固定
	<ol>
		<li>将0.075 M氯化钾溶液在37 °C水浴中预热至少30分钟。</li>
		<li>小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀，保留约0.5 ml PBS。</li>
		<li>轻轻吹打使细胞沉淀重悬，使用P200移液器制成单细胞悬液。</li>
		<li>逐滴加入4 ml预热的氯化钾溶液，同时轻轻摇动。</li>
		<li>将细胞在37 °C水浴中于低渗氯化钾溶液中孵育20分钟。</li>
		<li>按3份甲醇与1份冰醋酸的比例新鲜配制甲醇-冰醋酸固定液（acetomethanol溶液），并将新配制的固定液置于室温备用。</li>
		<li>低渗处理后，向管中加入等体积（4 ml）固定液，通过轻轻颠倒混匀。</li>
		<li>在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。此时细胞沉淀体积增大，呈白色且更易观察。</li>
		<li>弃去上清液，加入4 ml新鲜固定液，室温放置30分钟。</li>
		<li>以400 × g离心5分钟，弃去上清液，并用4 ml固定液再洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载玻片清洗与中期染色体铺展制备
	<ol>
		<li>将玻璃载玻片完全浸入10%液体洗涤剂中30分钟。</li>
		<li>用流动的冷水彻底冲洗载玻片30分钟。</li>
		<li>用蒸馏水冲洗载玻片三次，以彻底去除洗涤剂残留，然后将其浸入蒸馏水中，并存放于冰箱中以备后续使用。 
		注意：使用前清洗载玻片有助于获得均匀的染色体铺展，并提高中期分裂相的质量。</li>
		<li>取10 µl细胞悬液滴加于预冷的湿载玻片上，室温下静置过夜使其自然干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色与封片
	<ol>
		<li>将一份吉姆萨染液与一份PBS混合，配制50 ml吉姆萨染色液，倒入考普林染缸中。</li>
		<li>将载玻片浸入染色液中染色20分钟。</li>
		<li>用蒸馏水冲洗载玻片以去除多余染料，并立即使用吹风机将载玻片吹干。</li>
		<li>将载玻片在室温下放置过夜。</li>
		<li>在载玻片上滴加一滴封片介质，轻轻将盖玻片覆盖其上，让介质缓慢扩散至整个载玻片区域，用纸巾吸除多余介质。封片后的载玻片需静置至少1小时，方可移动或在显微镜下观察，以防盖玻片移位。 
		注意：此步骤中应小心放置盖玻片，避免产生气泡。不建议使用过热方式去除气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜观察与染色体畸变类型分析
	<ol>
		<li>使用高质量的明场显微镜，在100倍放大倍数下观察中期染色体铺展中的结构染色体畸变（CAs）。</li>
		<li>对于诱导大量染色体畸变的处理组，应至少分析50至100个中期分裂相。若效应较小，建议分析多达300个中期分裂相。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

染色体的细胞遗传学研究或显微分析，主要针对中期分裂相中的染色体数目或结构，可为多种疾病的预后评估、风险判断和治疗方案提供关键信息。目前已有充分证据表明，细胞遗传学异常与多种疾病（包括癌症）的发生和发展密切相关。迄今为止，在所有主要肿瘤类型中均已发现染色体异常（CAs）。这些异常可自发产生，也可由外部或内部刺激引发，例如电离辐射（IR）——这是可诱导多种类型细胞遗传学改变的主要外部风险因素之一16。对染色体异常的分析有助于评估机体吸收的辐射剂量（称为细胞遗传学辐射生物剂量测定）。此外，特定类型染色体畸变的发生频率和类型分析，还能提供有关吸收辐射质量的重要信息17, 18。细胞遗传学研究能够直接呈现损伤因子对DNA的影响，这与彗星实验等间接检测技术形成对比。然而，由于该技术涉及大量手动操作步骤，细胞遗传学研究在辐射以外领域的应用仍显不足。
尽管已知颗粒物（PM）中有机碳的暴露会对人体健康产生不利影响，但报告其生物学效应的研究中很少包含对有机碳组成成分的分析9。这主要是由于常用的色谱分析方法成本高昂且操作繁琐，需要耗费大量...

据估计，暴露于颗粒物（PM）每年导致超过300万人过早死亡，主要死因为心肺疾病和肺癌1。事实上，国际癌症研究机构已将PM列为对人类致癌的物质（1类致癌物），因为已有研究证实，随着PM暴露水平的升高，患肺癌的风险也随之增加2。有趣的是，几乎所有的癌细胞都携带数目和/或结构上的染色体异常。颗粒态有机碳是一种成分复杂且异质的混合物，其组成和粒径分布取决于排放源以及物理和化学转化过程。在城市PM2.5（粒径小于或等于2.5 µm的颗粒物）中，颗粒态有机碳占其质量的35–55%，而在农村及大陆背景区域的PM2.5中则超过60%3,4。其中水溶性组分占有机气溶胶的30–90%。已通过色谱法结合质谱技术鉴定出大量有机化合物，包括脂肪烃、多环芳烃及其含氧、含氮衍生物、脂肪醛和醇类、游离脂肪酸及其盐类、二元羧酸、多功能化合物、蛋白质以及类腐殖质大分子（HULIS）5–8。然而这些已识别的化合物仅占颗粒态有机碳总量的10–20%以下，因此大部分有机碳成分仍未知9。
实验证据表明，细胞毒性、氧化应激和炎症反应参与了颗粒物相关病理状态的发生发展。然而最近研究表明，暴露于颗粒物还会导致多种表观遗传学改变，包括实验条件下重复元件DNA甲基化水平的改变 体外 系统及人体受试者10-12特别值得关注的是颗粒物（PM）对卫星DNA（包括主要卫星和次要卫星）的影响，这些卫星DNA位于染色体着丝粒周围的异染色质区域。研究表明，这些影响可能具有持续性，因为在暴露后至少72小时内仍可检测到。12DNA甲基化（尤其是着丝粒周围的甲基化）的改变可能导致卫星DNA mRNA转录本的积累，在细胞分裂过程中破坏染色体完整性，并进而引发多种病理状态的发生。13.
将细胞遗传学方法应用于分析由颗粒物（PM）引起的表观遗传改变终点——染色体畸变（CAs），具有重要意义。本文报道了环境颗粒物的采集与制备方法， 体外 利用小鼠巨噬细胞RAW264.7模型系统对细胞外囊泡（CAs）进行暴露与分析。巨噬细胞构成抵御吸入性外来物质的第一道防线，因此该细胞系在颗粒物毒理学研究中被广泛用作成熟且最常用的模型。11, 12, 14, 15.

<table><tbody><tr><td>总悬浮颗粒物采样器</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 核磁共振波谱仪&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 软件</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor 学术版</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 小鼠巨噬细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>高糖 DMEM GlutaMAX 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid PBS 溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>KaryoMAX 氯化钾溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>甲醇（HPLC 级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 液体洗涤剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright 和 Wright-Giemsa 染色液</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

利用环境颗粒物诱导染色体畸变的分析方法 体外 系统

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

暴露于颗粒物（PM）是全球主要的健康问题之一，可能损害包括细胞核遗传物质在内的多种细胞组分。为评估PM对细胞核遗传完整性的影响，通过分析小鼠RAW264.7巨噬细胞有丝分裂中期 spreads 中的染色体结构畸变来进行评价。PM样品采用大流量总悬浮颗粒物采样器从环境空气中采集获得。采集后的样品经溶解和过滤处理，保留水溶性细颗粒部分。采用核磁共振（NMR）波谱法对颗粒物的化学组成进行表征。将不同浓度的颗粒物悬液加入到 体外 将RAW264.7小鼠巨噬细胞培养72小时，并设置未处理对照组。暴露结束后，用秋水仙胺处理培养物以使细胞停滞于中期。随后收集细胞，经低渗溶液处理后，用乙酸甲醇固定，滴片至载玻片上，最后用吉姆萨染液染色。使用明场显微镜在1000倍放大倍数下观察中期分裂相，评估结构染色体畸变（CAs）。每组处理至少分析50至100个中期分裂相。该技术适用于检测结构染色体畸变（CAs），包括染色单体型断裂、染色单体型交换、无着丝粒片段、双着丝粒染色体和环状染色体、双微体、内复制以及罗伯逊易位 体外 暴露于PM后。该方法可有效将明确的细胞遗传学终点与表观遗传学改变相关联。

选择总悬浮颗粒物（TSP）采样器的位置以及采样进行的季节时应格外谨慎，因为颗粒物的化学组成及其粒径可能显著影响实验结果。所收集的物质在白色滤膜上应清晰可见。正常的小鼠中期分裂相含有40条无着丝粒染色体。该技术的目的是展示经处理细胞与对照细胞之间异常染色体比例的变化（或无变化），并可对这种变化进行定量（异常染色体数量）和定性（异常类型）分析。
正常的小鼠中期分裂相含有40条无着丝粒染色体（图3A）。颗粒物处理可诱导产生多种染色体畸变（CAs），如图3所示，包括染色单体断裂（3B）、无着丝粒片段（3C）、环状染色体（3D）、双着丝粒染色体（3E）、双微小体（3F）、罗伯逊易位（3G）以及内...

本方案描述了染色体畸变的定量与表征技术 体外 在经大气颗粒物处理后的 RAW264.7 小鼠巨噬细胞中。

暴露于颗粒物（PM）是全球主要的健康问题之一，可能损害多种细胞组分，包括细胞核内的遗传物质。

本实验的总体目标是检测细胞暴露于从环境空气中提取的颗粒物后所引发的染色体损伤。该方法有助于回答颗粒物研究领域中的一个关键问题：颗粒物暴露是否会引起染色体损伤？该技术的主要优势在于，能够直接观察遗传物质中所诱导的损伤。根据文本方案收集和分析颗粒后，开始培养前，将完全培养基、0.25%胰蛋白酶和PBS置于37摄氏度水浴中预热至少30分钟，以进行颗粒暴露。清洗RAW 264.7细胞后，向培养皿中加入1毫升预热的胰蛋白酶溶液，通过刮擦使细胞从组织培养容器底部脱落。随后收集细胞，并通过反复吹打制成单细胞悬液。用台盼蓝计数细胞数量，然后用预热的完全培养基将细胞以每平方厘米8000个的密度接种至100毫米组织培养皿中。再用完全培养基调整体积至10毫升，使最终浓度为每毫升50,000个细胞。将细胞置于37摄氏度、5% CO2条件下培养24小时，使其贴壁。在生物安全柜中，使用无菌 PBS 将过滤后的颗粒稀释至 0.5 毫克/毫升的浓度，用于 5 微克/毫升的处理剂量；或将颗粒稀释至 5 毫克/毫升的浓度，用于 50 微克/毫升的处理剂量。对细胞进行颗粒物处理时，需在显微镜下以 10 倍放大倍数观察培养细胞的细胞生长、细胞形态、培养状态及污染情况。此时细胞汇合度应至少达到 30%。使用无菌移液管，无菌吸取培养基，并用 2 毫升 37 摄氏度的 PBS 将培养容器洗涤两次。加入预定剂量的颗粒物与新鲜培养基，于 37 摄氏度和 5%CO2 条件下培养，以平行进行同期的遗传毒性和表观遗传毒性分析。为将细胞阻滞在中期，洗涤细胞后，向培养物中加入含有 5 微升/毫升秋水仙胺溶液的预温培养基 2 毫升，在 37 摄氏度和 5%CO2 条件下继续孵育 2 小时。孵育结束后，彻底移除培养基，用预热的 PBS 洗涤细胞两次。然后加入胰蛋白酶溶液，于 37 摄氏度孵育 1 分钟。使用细胞刮刀刮下细胞，并加入 10 毫升 PBS 以灭活胰蛋白酶。然后将细胞上下吹打至少十次，以形成单细胞悬液，并将细胞转移至一个15毫升的圆锥形离心管中。将离心管放入摆动式离心机中，在室温下以400 × g离心5分钟。进行低渗处理时，小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀，管中保留约0.5毫升PBS。轻轻打散细胞沉淀，用P200移液器制成单细胞悬液。然后逐滴加入4毫升预热的氯化钾溶液，同时轻轻振荡。将细胞悬液置于37摄氏度水浴中孵育20分钟。低渗处理后，向离心管中加入等体积的固定液，轻轻颠倒混匀。在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，然后移除上清液。此阶段，细胞沉淀将增大，颜色变为灰白色，且更易观察。弃去上清液。加入4 mL新鲜固定剂，将试管在室温下孵育30分钟。然后离心试管，弃去上清液，并用4 mL固定剂再洗涤细胞两次。将玻璃载玻片完全浸入10%液体洗涤剂中30分钟。随后用流动的冷水彻底冲洗载玻片30分钟。用蒸馏水冲洗载玻片三次，以完全去除洗涤剂。然后将它们浸入蒸馏水中，并将载玻片置于冰箱中过夜保存。在预冷的湿载玻片上滴加10 µL细胞悬液，并在室温下过夜自然干燥。为染色并封片，取一份吉姆萨染色液与一份PBS混合，配制50 mL吉姆萨染色工作液，并倒入考普林瓶中。将载玻片浸入染色液中染色20分钟，然后用蒸馏水冲洗载玻片以去除多余的染料，并立即用吹风机吹干载玻片。将载玻片在室温下放置过夜。次日早晨，在载玻片上加一滴封片剂。轻轻将盖玻片盖在样本上，使封片剂缓慢扩散至整个载玻片。然后用纸巾吸去多余的封片剂。最后，使用100倍放大倍率的明场显微镜观察中期 spreads 中的染色体结构畸变。此图像显示，正常小鼠中期分裂相具有40条无着丝粒染色体。颗粒物处理可诱导多种染色体畸变，例如染色单体断裂、无着丝粒片段、环状染色体、双着丝粒染色体、双微小体、罗伯逊易位以及内复制。在进行该实验操作时，需牢记仅应使用正在增殖的细胞。完成此操作后，可采用其他方法（如M-FISH和SKY）回答更多问题，例如是否存在染色体间稳定畸变。进行此操作时，切勿忽视潜在的危险物质和致癌物，并应始终采取预防措施，例如佩戴手套。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用了大气颗粒物引起的染色体畸变分析<em&gt;体外</em&gt;系统

Xenopus 卵提取物是研究DNA损伤检查点的一个有用模型系统。本方案介绍了Xenopus...

使用Xenopus卵提取物研究DNA损伤检查点

本视频展示了一种高灵敏度的基于免疫荧光的检测方法，通过检测8-OHdG和γH2AX的水平，来评估PM2.5暴露引起的斑马鱼胚胎心脏中的氧化损伤，其中8-OHdG和γH2AX分别指示DNA损伤和DNA双链断裂。...

检测 PM2.5 介导的鱼类胚胎 DNA 损伤的免疫荧光检测法

染色体可从活细胞（如淋巴细胞或皮肤成纤维细胞）以及包括人类和小鼠在内的生物体中分离。这些染色体标本可进一步用于常规G显带及分子细胞遗传学实验，例如荧光原位杂交 原位...

从培养细胞中制备染色体

DNA修复通路对于维持基因组完整性以及防止突变和癌症的发生至关重要。本实验方案的目标是通过直接观察小鼠B细胞有丝分裂中期 spreads 中的染色体畸变，利用荧光方法定量基因组不稳定性。 原位...

小鼠B淋巴细胞染色体畸变的PNA-FISH快速分析

我们描述了在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

利用线虫 Caenorhabditis elegans 对生殖系化学毒性进行综合评估

一种用于评估慢性因素可能诱导的DNA损伤水平及DNA修复能力变化的实验方案 体内 通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标志物），展示小鼠脾淋巴细胞中低剂量辐射的影响。...

测量慢性处理后小鼠脾细胞中的DNA损伤与修复 体内 暴露于极低剂量的β射线和γ射线

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通过多重荧光检测染色体间稳定畸变 原位 辐射小鼠中的多重荧光原位杂交（mFISH）与光谱核型分析（SKY）

体外微核试验是一种评估遗传毒性和细胞毒性的成熟方法，但使用手动显微镜计数该试验费时费力，且存在主观性及不同评分者之间的变异性。本文描述了一种利用多光谱成像流式细胞术实现该试验完全自动化的操作方案。...

一种利用多光谱成像流式细胞术进行体外微核试验的自动化方法

本文描述了对DNA中的损伤产物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo）、1,N6-乙烷-2'-脱氧腺苷（1,N6-dAdo）和1,N2-乙烷-2'-脱氧鸟苷（1,N2-dGuo）进行高灵敏度和准确测定的方法。这些方法已应用于评估暴露于细颗粒物（PM2.5）的A/J小鼠组织（肺、肝和肾）中的损伤效应。...

通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估

该方案旨在用于体外构建先进的三维肝细胞培养模型，可对纳米材料在急性或长期重复剂量暴露条件下相关的遗传毒性危害进行更符合生理状况的评估。...

用于长期纳米材料暴露后体外遗传毒性检测的先进三维肝脏模型

我们开发了一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于检测斑马鱼胚胎内16种多环芳烃的含量水平。...

一种改良的QuEChERS-HPLC方法用于检测暴露于细颗粒物的斑马鱼胚胎中多环芳烃

学习利用RAW264.7小鼠巨噬细胞体外检测大气颗粒物诱导的染色体畸变方法。该技术可直接观察颗粒物暴露造成的遗传物质损伤，为评估环境污染物对细胞遗传完整性的影响提供可靠手段。

利用环境颗粒物诱导染色体畸变的分析方法体外系统

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