利用环境颗粒物诱导染色体畸变的分析方法 体外 系统

本实验的总体目标是检测细胞暴露于从环境空气中提取的颗粒物后所引发的染色体损伤。该方法有助于回答颗粒物研究领域中的一个关键问题：颗粒物暴露是否会引起染色体损伤？该技术的主要优势在于，能够直接观察遗传物质中所诱导的损伤。

根据文本方案收集和分析颗粒后，开始培养前，将完全培养基、0.25%胰蛋白酶和PBS置于37摄氏度水浴中预热至少30分钟，以进行颗粒暴露实验。清洗RAW 264.7细胞后，向培养皿中加入1毫升预热的胰蛋白酶溶液，通过刮擦使细胞从组织培养容器底部脱落。随后收集细胞，并通过反复吹打制成单细胞悬液。

用台盼蓝计数细胞数量，然后用预热的完全培养基将细胞以每平方厘米8000个的密度接种至100毫米组织培养皿中。再用完全培养基调整体积至10毫升，使最终浓度为每毫升50,000个细胞。将细胞置于37摄氏度、5%CO2条件下培养24小时，使其贴壁。

在生物安全柜中，使用无菌 PBS 将过滤后的颗粒稀释至 0.5 毫克/毫升的浓度，用于 5 微克/毫升的处理剂量；或将颗粒稀释至 5 毫克/毫升的浓度，用于 50 微克/毫升的处理剂量。对细胞进行颗粒物处理时，需在显微镜下以 10 倍物镜观察培养细胞的细胞生长、细胞形态、培养状态及污染情况。此时细胞融合度应至少达到 30%。

使用无菌移液管，无菌吸取培养基，并用 2 毫升 37 摄氏度的 PBS 将培养容器洗涤两次。加入预定剂量的颗粒物与新鲜培养基，于 37 摄氏度和 5%CO2 条件下培养，以平行进行同期的遗传毒性和表观遗传毒性分析。为将细胞阻滞在中期，洗涤细胞后，向培养物中加入含有 5 微升/毫升秋水仙胺溶液的 2 毫升预温培养基，在 37 摄氏度和 5%CO2 条件下继续孵育 2 小时。

孵育结束后，彻底移除培养基，用预热的 PBS 洗涤细胞两次。然后加入胰蛋白酶溶液，于 37 摄氏度孵育 1 分钟。使用细胞刮刀刮下细胞，并加入 10 毫升 PBS 以灭活胰蛋白酶。

然后将细胞上下吹打至少十次，以形成单细胞悬液，并将细胞转移至一个15毫升的圆锥形离心管中。将离心管放入摆动式离心机中，在室温下以400 × g离心5分钟。进行低渗处理时，小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀，保留约0.5毫升PBS。

轻轻打碎细胞沉淀，用P200移液器制备单细胞悬液。然后逐滴加入4毫升预热的氯化钾溶液，同时轻轻振荡。将细胞悬液置于37°C水浴中孵育20分钟。

低渗处理后，向离心管中加入等体积的固定液，轻轻颠倒混匀。在室温下以400 × g离心5分钟，然后移除上清液。此阶段，细胞沉淀的体积会增大，颜色变为灰白色，且更易观察。

弃去上清液。加入4 mL新鲜固定剂，将试管在室温下孵育30分钟。然后离心试管，弃去上清液，并用4 mL固定剂再洗涤细胞两次。

将载玻片完全浸入10%液体洗涤剂中30分钟。然后用流动的冷水彻底冲洗载玻片30分钟。用蒸馏水冲洗载玻片三次，以完全去除洗涤剂。

然后将载玻片浸入蒸馏水中，并在冰箱中过夜保存。取10 µL细胞悬液滴加到预冷的湿载玻片上，在室温下静置过夜使其自然干燥。为染色并封片，取一份吉姆萨染色液与一份PBS混合，配制50 mL吉姆萨染色工作液，倒入考普林瓶中。

将切片浸入染色液中染色20分钟，然后用蒸馏水冲洗切片以去除多余的染料，并立即使用吹风机将切片吹干。将切片在室温下放置过夜。次日早晨，在切片上滴加一滴封片介质。

轻轻将盖玻片置于其上，使封片介质缓慢扩散至整个载玻片，然后用纸巾吸去多余的介质。最后，在100倍放大倍数下使用明场显微镜检查中期展片中的染色体结构畸变。

此图像显示，正常小鼠中期分裂相具有40条无着丝粒染色体。颗粒物处理可诱导多种染色体畸变，例如染色单体断裂、无着丝粒片段、环状染色体、双着丝粒染色体、双微小体、罗伯逊易位以及内复制。在进行该实验操作时，需牢记仅应使用正在增殖的细胞。

完成此操作后，可采用其他方法（如M-FISH和SKY）回答更多问题，例如是否存在染色体间稳定畸变。进行此操作时，切勿忽视潜在的危险物质和致癌物，应始终采取预防措施，例如佩戴手套。