源自肽的方法实现基因和蛋白质在植物细胞及细胞器屏障间的转运

该多肽衍生方法的总体目标是将基因和蛋白质运送到植物的细胞和细胞器屏障内。该方法可通过合理设计的多肽偶联物对植物进行改造，递送多种基因和蛋白质以介导特定基因的表达，从而帮助回答关键科学问题。该技术的直接优势在于采用基于多肽的简单注射器辅助转染程序处理植物叶片，这些多肽能够跨越细胞和细胞器边界。

我们开发了这种简单、高效且新颖的植物转化方法，因为传统方法成本高昂，不适用于某些植物类型，并且无法靶向细胞内细胞器。Jo-Ann Church 将与我实验室的技术员 Yoko Horii 一起演示该操作流程。按照文本方案中所述制备肽等离子体 DNA 配方。

当将多肽加入血浆DNA中时，溶液会变得浑浊。用超纯水稀释至文本方案中指定的最终体积后，混合物变为澄清。取800微升稀释后的溶液转移至比色皿中，用于动态光散射分析。

使用泽塔纳米粒度仪测定所形成复合物的流体动力学直径和多分散性指数。采用633纳米氦氖激光，在25摄氏度下以173度的背向散射角进行检测。完成粒径测量后，将溶液转移至折叠毛细管池中，在默认参数下（即25摄氏度时水的介电常数、折射率和黏度）进行泽塔电位测定。

为通过原子力显微镜观察复合物溶液，取10微升样品滴加到新剥离的云母片表面，并将云母片置于加盖的塑料培养皿中，室温下静置过夜使其自然干燥。在25摄氏度空气中，采用弹簧常数为1.3牛顿/米的硅悬臂，在轻敲模式下采集复合物的图像。实验所用拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株生长三周，培养条件为16小时光照、8小时黑暗，温度22摄氏度。

选择至少三片叶片进行透化处理，以作为基因表达定量分析的三个重复。用100微升复合溶液装填一支1毫升无针塑料注射器，用于一片叶片的转染。然后，将注射器尖端置于叶片的远轴面。

将注射器针头轻轻抵住叶片，并用戴有乳胶手套的手指从叶片另一侧施加反向压力，同时缓慢推动注射器活塞。成功渗入的表现为叶片上出现湿润区域并逐渐扩散。对已渗入的叶片进行标记，以便识别。

将转染了肽-质粒DNA的植物在培养室中孵育12小时。为评估转染效率，首先切下整个转染的叶片。对于使用海肾荧光素酶报告载体的转染实验，使用海肾荧光素酶检测试剂盒定量测定转染效率。

首先，将每片切除的叶片放入一个 1.5 毫升微量离心管中。每管加入 100 微升 1X 裂解缓冲液。以相同方式，制备未转染对照叶片的裂解液，设三个重复。

使用匀浆杵研磨叶片，并将所得裂解液在25摄氏度下孵育6至10小时。孵育结束后，在微量离心机中以12,470 × g离心1分钟。取20 µL澄清裂解液转移至96孔微孔板中的一个孔内。

按照生产商说明书，使用BCA蛋白检测试剂盒对剩余体积的样品进行总蛋白浓度定量。随后，向孔中加入100 µL一倍浓度的Renilla荧光素酶检测试剂底物，通过缓慢移液混匀。将微孔板放入多功能微孔板读板仪中，并启动检测。

使用绿色荧光蛋白报告载体进行转染实验时，采用共聚焦激光扫描显微镜观察荧光。首先，修剪整片叶片的边缘，以利于去除气室。然后，从10毫升注射器中取出活塞，将每片切除的叶片或叶片片段放入注射器中。

将柱塞重新插入，并轻轻推至注射器底部，注意不要压碎叶片。将水吸入注射器，直至注射器约一半充满。将注射器朝上，推动柱塞，使空气从注射器尖端排出。

然后，盖住注射器的尖端，缓慢下拉活塞，以排出叶片中的空气。重复此过程数次，直至叶片呈现半透明状。接着，用胶带覆盖载玻片的表面。

使用刀片在胶带上切割出一个足够容纳叶片样品的方形区域，然后用镊子将这块方形胶带剥离，以形成一个样品室。该胶带将作为载玻片与盖玻片之间的间隔物。将叶片放入样品室中，使其远轴面朝上，并用水填充样品室的剩余空间。

用玻璃盖玻片将叶片密封于样品室中，并用胶带固定盖玻片边缘。使用共聚焦激光扫描显微镜，以40倍物镜或63倍水浸物镜观察叶片样品。在488纳米激发波长下可观察到GFP荧光。

在肽与DNA比例为0.5的条件下，制备最优的肽-质粒DNA复合物应具有约290纳米的平均直径和约0.3的低多分散指数，表明其粒径分布均匀。此外，该复合物应表现出约30毫伏的Zeta电位。此处展示了一张具有代表性的原子力显微镜图像，显示肽-质粒DNA复合物的形态。

观察到均一的球形复合物。利用肽-质粒DNA制剂，可在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中实现质粒DNA的核靶向递送与表达，其每毫克雷尼拉荧光素酶活性值估计约为100,000。通过显微观察经编码GFP报告基因的质粒DNA所制备复合物处理的叶片，以评估基因表达情况。

图像显示，在转染了非靶向肽-质粒DNA复合物的细胞中，可清晰观察到与GFP表达相对应的弥散性绿色荧光，且其定位于细胞质中。该技术发展后，为植物生物技术领域的研究人员将多种基于蛋白质和核酸的货物递送至活体植物体内铺平了道路。在观看本视频并阅读文字版实验方案后，您应能够充分理解如何制备、表征并应用针对每种类型货物（包括质粒DNA、双链DNA或RNA以及蛋白质）的多种优化配方。