Name: 肽衍生的方法在运输跨越植物细胞的基因和蛋白质和细胞器障碍 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解一种基于肽的新型植物转化方法，通过注射器辅助转染技术将基因和蛋白质高效递送至拟南芥细胞。该技术克服了传统方法成本高、适用性有限的缺点，为植物生物技术研究提供了简单高效的替代方案。

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作者感谢日本科学技术振兴机构先驱性研究技术支持项目（JST-ERATO）、新能源产业技术综合开发机构（NEDO）以及日本跨部门战略性创新推进计划（SIP）的资助。

1. 基于多肽的制剂制备
<ol>
	<li>按如下方法制备每种肽的储备液：(KH)9-BP100（1 mg/ml 或 800 nM）、Cytcox-(KH)9（1 mg/ml）、BP100（1 mg/ml）和 (BP100)2K8（70 µM）。在 1.5 ml 微量离心管中称取所需量的每种肽，加入经高压灭菌的超纯水溶解肽。通过反复吹打混匀，直至获得澄清溶液。</li>
	<li>根据标准分子生物学方法扩增并纯化质粒 DNA（pDNA）、双链 DNA（dsDNA）和双链 RNA（dsRNA）。在 1.5 ml 微量离心管中配制浓度为 1 mg/ml（pDNA 和 dsDNA）或 400 nM（dsRNA）的储备液。</li>
	<li>通过将 1 mg 蛋白质粉末（例如，乙醇脱氢酶，ADH）溶解于 1 ml 碳酸钠溶液（0.1 M，pH 9）中，制备浓度为 7 µM 的蛋白质储备液。根据标准方案使用荧光探针（如罗丹明 B，RhB）标记蛋白质，以便在显微镜下观察递送至细胞内的蛋白质。</li>
	<li>在 1.5 ml 微量离心管中混合相应组分。
	<ol>
		<li>对于靶向细胞质的肽-pDNA 制剂，将 6.4 µl (KH)9-BP100（1 mg/ml）加入 20 µl pDNA（1 mg/ml）中，通过吹打充分混匀。在 25 °C 下静置 15 分钟使其稳定。加入 773.6 µl 经高压灭菌的超纯水，将溶液稀释至终体积 800 µl。使用设计用于核表达的 pDNA 构建体（P35S-RLuc-TNOS，表 1）。</li>
		<li>对于靶向线粒体的肽-pDNA 制剂，将 6.6 µl Cytcox-(KH)9（1 mg/ml）加入 20 µl pDNA（1 mg/ml）中，通过吹打充分混匀。在 25 °C 下静置 15 分钟使其稳定，然后加入 2.4 µl BP100（1 mg/ml）。再次在 25 °C 下静置 15 分钟使其稳定。加入 771 µl 经高压灭菌的超纯水，将溶液稀释至终体积 800 µl。使用设计用于线粒体表达的 pDNA 构建体（pDONR-cox2:rluc，表 1）。</li>
		<li>对于肽-dsDNA 制剂，将 5.1 µl (KH)9-BP100（1 mg/ml）加入 8 µl dsDNA（1 mg/ml）中，通过吹打充分混匀。在 25 °C 下静置 15 分钟使其稳定。加入 786.9 µl 经高压灭菌的超纯水，将溶液稀释至终体积 800 µl。</li>
		<li>对于肽-dsRNA 制剂，将 50 µl (KH)9-BP100（800 nM）加入 50 µl dsRNA（400 nM）中，通过吹打充分混匀。在 25 °C 下静置 15 分钟使其稳定。加入 700 µl 无 RNase 水，将溶液稀释至终体积 800 µl。</li>
		<li>对于肽-蛋白质制剂，将 16 µl (BP100)2K8（70 µM）加入 16 µl ADH（7 µM）中，通过吹打充分混匀。在 25 °C 下静置 15 分钟使其稳定。加入 768 µl 经高压灭菌的超纯水，将溶液稀释至终体积 800 µl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将各制剂在 25 °C 下静置 15 分钟使其稳定。</li>
</ol>
2. 基于肽的制剂的表征
<ol>
	<li>将每种溶液（800 µl）转移至比色皿中，用于动态光散射（DLS）分析。使用Zeta纳米粒度仪，在25 °C条件下，采用633 nm的He-Ne激光器及173°背向散射角，测定所形成复合物的流体动力学直径和多分散性指数。</li>
	<li>完成粒径测量后，将每种溶液（800 µl）转移至折叠毛细管池中，在默认介电常数、折射率和25 °C水的黏度参数下进行Zeta电位测量。</li>
	<li>利用原子力显微镜（AFM）观察用于DLS分析的一小部分复合物溶液。取10 µl复合物溶液滴加到云母片表面新解理出的洁净表面上，将云母片置于加盖的塑料培养皿中，室温下静置过夜自然干燥。</li>
	<li>在25 °C空气中，采用弹簧常数为1.3 N/m的硅悬臂梁，以轻敲模式27,28获取复合物的图像。</li>
</ol>
3. 植物叶片的侵染
<ol>
	<li>使用3周龄的土培植物（Arabidopsis thaliana24、Nicotiana benthamiana24 或杨树26）。至少转染3片叶片，作为基因表达或蛋白递送定量分析的三个重复样本。</li>
	<li>用1 ml无针塑料注射器吸取100 µl复合溶液，用于单片叶片的转染。将注射器尖端置于叶片的远轴面。</li>
	<li>轻轻将注射器尖端压在叶片上，同时用戴乳胶手套的手指从叶片另一侧施加反向压力，并缓慢推动注射器活塞。成功渗入时可在叶片上观察到湿润区域的扩散。对已渗入的叶片进行标记，以便识别。</li>
	<li>转染后，在以下条件下，根据不同的肽-pDNA（12小时）、肽-dsDNA（12小时）、肽-dsRNA（9–48小时）和肽-蛋白（6小时）制剂，将转染叶片孵育适当时间：对于A. thaliana和杨树，采用16小时光照/8小时黑暗、22 °C；对于N. benthamiana，采用24小时连续光照、29 °C。</li>
</ol>
4. 转染效率的评估
<ol>
	<li>切除小型植株的整个转染叶片（例如., 拟南芥）或 1 cm2 较大植株的侵染区域切片例如., N. benthamiana).</li>
	<li>转染实验使用 海肾 使用海肾荧光素酶（Rluc）报告载体，利用Rluc检测试剂盒定量测定转染效率。
	<ol>
		<li>将每片切除的叶片或叶片部分放入一个1.5 ml微量离心管中。每管加入100 µl 1× Rluc检测裂解缓冲液。以相同方式制备未转染对照叶片的裂解液（设三个重复）。</li>
		<li>使用匀浆杵研磨叶片，并将所得裂解物在25 °C孵育6 - 10小时。</li>
		<li>在微量离心机中以12,470 × g离心裂解液1分钟。取20 µl澄清裂解液加入96孔微孔板中的一个孔，剩余体积用于根据BCA蛋白定量检测试剂盒的制造商说明书测定总蛋白浓度。</li>
		<li>向孔中加入100 µl 1× Rluc检测底物（使用Rluc检测缓冲液稀释），通过缓慢移液混匀。将微孔板放入多功能微孔板读数仪中并开始检测。</li>
		<li>从每个实验样本的发光值中减去背景发光值（未转染组三个复孔的平均值）。计算光致发光值（相对光单位，RLU）与蛋白量（mg）的比值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于使用绿色荧光蛋白（GFP）报告载体或荧光标记蛋白的转染实验（例如使用共聚焦激光扫描显微镜观察荧光（如 ADH-RhB）。
	<ol>
		<li>将整片叶片的边缘剪去（以利于去除气室），而分割好的叶片可直接使用。从10 ml注射器中取出活塞，将每片切除的叶片或叶段放入注射器中。</li>
		<li>更换针芯，轻轻将其推至注射器底部，注意不要压碎叶片。将水吸入注射器，直至注射器约一半充满。</li>
		<li>将注射器针头朝上，推动活塞，通过针头排出注射器内的空气。用手指堵住注射器前端，缓慢下拉活塞，以排出叶片中的空气。重复此操作数次，直至叶片呈现半透明状。</li>
		<li>用胶带覆盖载玻片表面。使用刀片在胶带上切割出一个足够容纳叶片样品的方形区域，然后用镊子将该方形胶带揭下，形成一个样本室。胶带将作为载玻片与盖玻片之间的间隔物。</li>
		<li>将叶片放入样品室中，使其远轴面朝上，并用水填充样品室的剩余空间。用玻璃盖玻片密封样品室中的叶片，并用胶带固定盖玻片边缘。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜，以40倍物镜或63倍水浸物镜观察叶片样品。GFP或RhB荧光分别在488 nm或555 nm激发波长下进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379(2014).</li>
<li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li>
<li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoeb%2C+TA+%22Transgenic+Crops+I%22">Transgenic Crops I</a>. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

讨论了通过实验确定的方案中的关键步骤。通过注射器浸润法，基于肽的制剂经由气孔被引入植物叶片内部的气室中。为确保溶液最大程度地被吸收，浸润过程应在植物处于有利于气孔开放的条件下进行。 即，提供充足的水分，并在光照期间进行。关于转染复合物的制备，对于包含两种肽组合（用于线粒体靶向DNA递送）的配方，各组分的添加顺序至关重要，不得颠倒。
该实验步骤存在多种可行的修改方案。另一种植物细胞渗透方法是采用真空渗透法，该方法可将复合溶液导入整株植物和/或包括顶端分生组织在内的部分组织。在此替代方案中，将幼苗浸入转染溶液中，利用真空产生的压力迫使肽-货物复合物通过气孔进入植物细胞（Yoshizumi, T.，未发表数据）。
基于动物细胞研究的瞬时基因表达已被证明随着DNA浓度的升高而增加29-31。需要注意的是，多肽与DNA的比例会影响复合物的理化性质（如粒径、表面电荷）（图4），从而影响转染效率；因此，即使增加DNA浓度，也需维持最佳的多肽与DNA比例。
使用多肽作为基因/蛋白递送载体的一个主要优势在于其序列易于改造以实现特定功能。例如，本研究中所述载体多肽的线粒体靶向结构域可替换为叶绿体或过氧化物酶体靶向序列，从而实现向这些细胞器的定位。尽管利用基因枪法已在多种植物中实现了叶绿体转化32-34，既不是 农杆菌 也不论基因枪法能否将基因导入线粒体或其他细胞器而非细胞核表 2).
与具有严格宿主范围限制的转染方法不同，基于肽的转染不存在刚性的宿主范围限制 农杆菌-为基础的方法（表 2）。迄今为止，用于转染的配方 A. thaliana, N. benthamiana 和杨树的培养条件已得到优化（表1），但该方法也可应用于 Nicotiana tabacum, 番茄品种Micro-Tom、水稻（基于初步实验）及其他单子叶和双子叶植物。
目前，当使用肽类作为转染载体时，尚未发现对转基因大小存在已知限制。相比之下，较大的DNA分子已被发现会降低转化效率 农杆菌介导的方法35,36，且已有报道称转基因的上尺寸限约为200 kb37-39另一方面，使用基因枪法时，大片段DNA在制备或递送至植物过程中可能发生剪切38尽管目前尚未确定基因枪转化的上限，但已发现物理限制会制约可转移DNA的大小，使其远小于150 kb40与现有采用非病毒或病毒载体的基因转递方法相比，使用基于肽的基因转递系统的主要优势在于 农杆菌 或上述的微弹轰击法，总结于 表2.
该方法目前仍存在一些局限性。首先，尽管已通过简单的DNA结合、细胞穿透和细胞器转运序列组合实现将质粒DNA（pDNA）靶向递送至特定细胞器（如线粒体），但其效率较低。通过共聚焦显微镜仅能在细胞内少数线粒体中检测到外源基因的表达。因此，仍需进一步改进：（i）增强更多复合物跨细胞膜/细胞器膜的转位能力；（ii）提高pDNA从载体肽向靶细胞器的解离与转移效率，以实现有效表达。其次，利用该DNA递送系统，已在细胞的胞质和线粒体区室中成功实现外源报告基因的瞬时表达。然而，由于缺乏合适的筛选策略，外源基因在植物细胞核基因组或细胞器基因组中的稳定整合与长期表达尚未实现。
尽管承认该方法尚有需要改进或进一步发展的方面，但本文所述的多肽衍生策略仍是一种简单且用途广泛的技術，為將各種貨物遞送至多種植物類型開闢了道路。

植物基因工程传统上用于将有益性状转移至植物中。近年来，该技术已被应用于将植物转化为生物工厂，以生产具有重要药用价值和商业价值的蛋白质，其中许多蛋白质无法通过化学方法合成，且利用动物或微生物系统生产成本极高1。通过导入新基因，可调控植物自身的代谢途径，用于生产各类生物制药，如抗体、代谢酶、激素、抗原或疫苗2。
已建立的植物基因转移技术包括 农杆菌介导的递送3，用DNA包被的微弹进行轰击（基因枪法）4，以及电穿孔5 或聚乙二醇6 原生质体处理。由于原生质体制备相关技术通常耗时较长、操作繁琐且结果重复性差，因此一般尽量避免使用这类方法。7因此，目前几乎所有的植物改良工作都采用以下两种方法之一 农杆菌 或用于基因转移的微弹。 农杆菌 该方法应用更为广泛，但不适用于许多具有重要经济价值的植物物种。相比之下，微弹轰击法因适用于多种易感植物而更具通用性，但需要专用设备，且常导致严重的组织损伤。此外，这些方法要么具有随机性（基因枪法），要么过程复杂（农杆菌）递送机制，且转化效率存在差异8因此，需要一种简单有效且适用于多种植物类型的新型植物转化技术。
目前，植物的遗传改造主要通过导入编码目标性状的外源DNA来实现，而非直接递送目标蛋白。相较于蛋白质，DNA具有更高的稳定性，这是其主要优势；然而，DNA递送可能带来一些潜在问题，例如外源DNA随机插入植物基因组，以及通过水平基因转移将抗生素抗性基因意外传递给致病菌via水平基因转移9。在基因组编辑方面，若能实现不向细胞内引入外源DNA即可对植物基因组进行编辑，将有望规避与转基因植物相关的监管问题。因此，通过直接递送蛋白实现植物改良的无DNA替代策略，将能够满足上述需求。
在此，我们介绍一种基于多肽的系统，该系统最初为人类基因治疗而开发10-14，用于在完整植株中实现外源基因或蛋白质的靶向递送。多肽能够保护DNA免受核酸酶降解，并可介导基因跨越细胞膜以及细胞器膜的转移15-17它们除了无细胞毒性外，还具有多样且可调控的特性18-20更重要的是，利用肽类分子可将基因精确靶向至线粒体等细胞内细胞器21 或质体（叶绿体）22 用于表达——这是基因枪法或 农杆菌介导的转化。根据载体类型，这种新型植物修饰技术可用于递送蛋白质23 并表达（质粒21,24 或双链DNA25）或下调（双链RNA26植物细胞质空间内的特定基因24-26 或在特定的细胞器区室内21设计的载体肽由阳离子结构域组成，该结构域以多聚赖氨酸（K8）或多聚赖氨酸-co-histidine（KH）9 用于结合和/或压缩带负电荷的货物分子，并与细胞穿透肽（BP100 肽）或线粒体转运肽（Cytcox 肽）序列偶联。

<table><tbody><tr><td>(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;-BP100 肽</td><td>由理化学研究所脑科学中心定制合成</td><td>N/A</td><td>序列：KHKHKHKHKHKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-K&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt; 肽</td><td>由理化学研究所脑科学中心定制合成</td><td>N/A</td><td>序列：KKLFKKILKYLKKLFKKIL-&lt;br/&gt; KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 肽</td><td>由理化学研究所脑科学中心定制合成</td><td>N/A</td><td>序列：KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt; 肽</td><td>由理化学研究所脑科学中心定制合成</td><td>N/A</td><td>序列：MLSLRQSIRFFKKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS 和 P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>分别编码绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶基因，受 CaMV 35S 组成型启动子调控（参考文献：Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Biomacromolecules 2013, 14, 10）</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp 和 pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>分别编码绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶基因，受线粒体特异性 cox2 启动子调控（参考文献：Chuah &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Sci Rep 2015, 5, 7751）</td></tr><tr><td>dsDNA（从 pBI221-P35S-Rluc-TNOS 中 PCR 扩增）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>分别编码绿色荧光蛋白和海肾荧光素酶基因，受 CaMV 35S 组成型启动子调控（参考文献：Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol 2015, 32, 39）</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于 RNA 干扰介导的绿色荧光蛋白沉默（参考文献：Numata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027）</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于 RNA 干扰介导的查尔酮合酶沉默（参考文献：Numata &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027）</td></tr><tr><td>1 ml 和 10 ml 塑料注射器</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>旭硝子株式会社（Asahi Glass Co., Ltd.）</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>积水化学工业株式会社（Sekisui Chemical Co., Ltd.）</td><td>No. 835</td><td></td></tr><tr><td>乙醇脱氢酶</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜</td><td>精工仪器株式会社（Seiko Instruments Inc.）</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜</td><td>日立高新技术科学株式会社（Hitachi High-Tech Science Corporation）</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific Inc.）</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>悬臂梁</td><td>日立高新技术科学株式会社（Hitachi High-Tech Science Corporation）</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>卡尔·蔡司公司（Carl Zeiss）</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>打孔器</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>用于将叶片切割成直径 1 cm 的圆片</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>正兴玻璃工业株式会社（Matsunami Glass Ind., Ltd.）</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>折叠毛细管池</td><td>马尔文仪器有限公司（Malvern Instruments, Ltd.）</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>清水明株式会社（Shimizu Akira Inc.）</td><td>不锈钢镊子 150</td><td></td></tr><tr><td>匀浆杵</td><td>家田贸易公司（Ieda Trading Corp.）</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>云母</td><td>日新电子株式会社（Nisshin EM Co., Ltd.）</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter）</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读数仪</td><td>分子器件公司（Molecular Devices Corporation）</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>正兴玻璃工业株式会社（Matsunami Glass Ind., Ltd.）</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf Research&amp;reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>海肾荧光素酶检测试剂盒</td><td>Promega 公司（Promega corporation）</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明 B 异硫氰酸酯</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 水</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>和光纯药工业株式会社（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片及刀柄</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>不锈钢 No. 14（刀片），No. 3L（刀柄）</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头帽</td><td>武藏工程株式会社（Musashi Engineering Inc.）</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta 电位仪</td><td>马尔文仪器有限公司（Malvern Instruments, Ltd.）</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

源自肽的方法实现基因和蛋白质在植物细胞及细胞器屏障间的转运

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

将外源蛋白导入植物并表达（或下调）特定基因的能力，为植物生物学基础研究以及植物生物技术领域的新应用提供了强有力的工具。目前存在的将蛋白或基因转入植物细胞的可行方法，即 农杆菌 以及微弹轰击法存在转化频率低、宿主范围有限或设备与微载体成本高昂等缺点。以下方案介绍了一种简单且用途广泛的递送方法，该方法利用理性设计的多肽作为递送载体，将多种基于核酸和蛋白质的货物分子导入植物细胞。选择多肽作为系统开发工具，是由于其具备可生物降解性、分子尺寸小、性质多样且可调控，以及能够进入细胞内或细胞器内的优势。本文描述了针对多种递送货物（质粒DNA、双链DNA或RNA以及蛋白质）的优化制剂的制备、表征与应用。同时讨论了方案中的关键步骤、可能的改进方法以及该技术目前存在的局限性。

利用设计的多肽作为递送载体，成功将多种核酸和蛋白质货物导入了各类植物中。阳离子多肽与带负电荷的货物之间通过静电相互作用形成转染复合物，可直接使用无针注射器渗入植物叶片（图1）。表1列出了植物细胞转染的优化配方（在本研究中经验确定21,23-26），其中涵盖了所递送的多种类型货物（pDNA、dsDNA、dsRNA 和蛋白质）。所有基于多肽的制剂的平均直径范围约为 150 – 300 nm。基于动态光散射（DLS）分析，所有制剂均表现出相对较低的粒径多分散性，表明形成的多肽-货物聚集体具有均匀的粒径分布。在云母表面，通过原子力显微镜（AFM）观察了多肽与 pDNA（图2A）或蛋白质（图2B）形成的复合物的形态。多肽-pDNA 和多肽-蛋白质组合均呈现出均一的球状复合物，与DLS测量结果一致。就复合物的Zeta电位而言（表1），pDNA和dsDNA来源的复合物具有净负表面电荷，而基于dsRNA的复合物表面电荷接近中性。相反，多肽-蛋白质复合物则带正电荷。
采用模式植物系统 A. thaliana 和 N. benthamiana，对肽-pDNA 及肽-dsDNA 制剂介导转染的效率进行了定量与定性评估。通过 RLuc 基因表达检测法对基因表达水平进行定量（表 1），因此本实验中必须使用编码 RLuc 基因的 pDNA 或 dsDNA 与相应载体肽形成复合物。使用 (KH)9-BP100/pDNA 制剂，在 12 小时孵育后可实现 pDNA 的核靶向递送与表达，其 RLU/mg 值约为 1 × 105。对于线粒体靶向的 pDNA 递送与表达，需联合使用 Cytcox-(KH)9 与 BP100 两种肽以形成复合物；在相同的优化孵育时间（12 小时）下，转染水平显著较低，约为 1 × 103 RLU/mg。同时，基于 dsDNA 的复合物（同样采用 (KH)9-BP100 肽制备）在相同孵育时间（12 小时）下也记录到相似的基因表达水平（约 1 × 103 RLU/mg）。通过显微镜直接观察经编码 GFP 报告基因的 pDNA 或 dsDNA 复合物处理的叶片，对基因表达进行定性评估。在转染非靶向肽-pDNA 复合物的细胞中，可清晰观察到弥散的绿色荧光，对应于 GFP 的表达，并定位于细胞质中（图 3A）。而在经线粒体靶向肽-pDNA 复合物浸润的细胞中，GFP 荧光的定位模式表现出明显差异：可见点状绿色荧光与线粒体染料共定位，证实基因表达特异性地局限于细胞的线粒体区室（图 3B）。
对于多肽-蛋白质制剂，将蛋白质货物（ADH）与荧光染料（RhB）偶联，可实现对递送蛋白质在细胞内区室中分布的可视化观察。在短短6小时的孵育后，ADH-RhB蛋白（蓝色）即已在浸润细胞的细胞质和液泡中广泛分布（图3C）。与此同时，利用多肽-dsRNA制剂可在多种植物中实现快速且高效的基因表达下调。在第一项实验中，将多肽-dsRNA复合物浸润至A. thaliana叶片中，以沉默查尔酮合成酶基因（CHS），该基因在干旱条件下负责花青素（红色色素）的生物合成。在正常条件（图3D，a）和干旱条件（图3D，b）下，A. thaliana叶片表型的差异为评估优化后的多肽-dsRNA制剂对CHS基因的沉默效果提供了简便手段（箭头1指示浸润区域）。在第二项实验中，将多肽-dsRNA复合物浸润至表达黄色荧光蛋白（YFP）的转基因A. thaliana叶片中。转染后9小时，表皮细胞中YFP表达出现明显降低（图3E, F）。该制剂在另一种植物系统（杨树）中下调基因表达的有效性也得到了验证（转染后12小时，图3G, H）。
<img alt="生物活性分子-肽缀合物示意图；通过细胞穿透与靶向实现质粒DNA递送" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 基于肽的制剂用于将核酸和蛋白质货物递送至活体植物 
设计的载体肽由多聚阳离子与细胞穿透序列或细胞器转运序列偶联而成。多聚阳离子能够结合和/或压缩带负电荷的货物分子，并在进入细胞后实现从早期内体区室的逃逸。细胞穿透序列和细胞器转运序列分别介导货物分子进入细胞以及随后靶向特定细胞器。已成功递送至植物体内的多种货物包括核酸类物质，如质粒DNA（pDNA）、双链DNA（dsDNA）和双链RNA（dsRNA），以及模型蛋白如牛血清白蛋白（BSA）、乙醇脱氢酶（ADH）和柑橘荧光蛋白（citrine，黄色荧光蛋白的一种变体）。生物活性分子能够与肽偶联物形成转染复合物。 通过 通过注射渗透将静电相互作用引入植物叶片。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="AFM图像比较表面形貌；纳米尺度；A：光滑基底；B：颗粒沉积。" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： 基于肽的制剂的形貌特征。 
(A) N/P比为0.5时，(KH)9-BP100/pDNA制剂的AFM振幅图像。(B) 摩尔比为10时，(BP100)2K8/ADH制剂的AFM高度图像。经许可转载自已发表文献23,24。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="叶片组织的荧光显微镜观察；叶绿素分布；细胞间相互作用；细胞壁。" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 使用优化的肽基制剂进行转染效率的显微评估。 
(A) 在用 (KH)9-BP100/pDNA 制剂（N/P 0.5；12 小时）浸润的 A. thaliana 叶片的海绵状叶肉细胞中，观察到细胞质内的 GFP 表达（绿色），可明显区别于叶绿体自发荧光（红色）。(B) 在用 Cytcox-(KH)9/BP100/pDNA 制剂（每种肽的 N/P 为 0.5；12 小时）浸润的 A. thaliana 叶片表皮细胞中，检测到线粒体（红色）内的 GFP 表达（绿色）。最右侧图展示了表达 GFP 的线粒体的放大图像。(C) 利用 (BP100)2K8 在肽/蛋白摩尔比为 10 的条件下，将 ADH-RhB（蓝色）递送至 A. thaliana 叶片的海绵状叶肉细胞中，浸润后 6 小时进行可视化观察。(D) A. thaliana 叶片在使用 (KH)9-BP100/dsRNA 制剂（摩尔比 2；48 小时）处理前 (a) 与处理后 (b) 的图像，该处理导致花青素生物合成途径受到抑制。作为阴性对照，将含有 GFP5 dsRNA 的类似制剂浸润至叶片中 (c)。箭头 1 和 3 指示浸润区域，箭头 2 和 4 指示叶片内未浸润的区域。(E) 表达黄色荧光蛋白（YFP）的 A. thaliana 叶片，以及 (F) 使用 (KH)9-BP100/dsRNA 制剂（摩尔比 2；9 小时）浸润后 YFP 荧光减弱的情况。(G) 表达黄色荧光蛋白（YFP）的转基因杨树叶片，以及 (H) 使用 (KH)9-BP100/dsRNA 制剂（摩尔比 2；12 小时）浸润后 YFP 荧光减弱的情况。经许可转载自已发表文献21,23,24,26。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="多肽-DNA 偶联示意图：纳米颗粒特性、N/P 比值、ζ 电位、直径。" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4： 多肽与 DNA 比例（N/P 比）的变化及其对复合物理化性质的影响。 
随着多肽与 DNA 比例的增加，基于多肽的制剂粒径减小，其ζ电位值由负变正。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多肽-DNA制剂的动态光散射分析表；流体动力学尺寸、泽塔电位。" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1：多种多肽类制剂的表征与评价。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>
<img alt="基因转移技术表格；DNA构建体大小、宿主植物范围、效率、成本、细胞器靶向。" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 2"> 
表 2：基于肽的与其他现有完整植株DNA递送技术的比较。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>

现有的植物修饰方法适用范围有限。本文提出的一种新型肽衍生技术，有望以简单高效的方式将外源蛋白或基因导入完整植物的特定细胞内区室。

将外源蛋白导入植物并表达（或下调）特定基因的能力为植物基础研究提供了强有力的工具，可用于……

该多肽衍生方法的总体目标是将基因和蛋白质运送到植物的细胞和细胞器屏障内。该方法可通过合理设计的多肽偶联物对植物进行改造，递送多种基因和蛋白质以介导特定基因的表达，从而帮助回答关键科学问题。该技术的直接优势在于采用基于多肽的简单注射器辅助转染程序处理植物叶片，这些多肽能够跨越细胞和细胞器边界。我们开发了这种简单、高效且新颖的植物转化方法，因为传统方法成本高昂，不适用于某些植物类型，并且无法靶向细胞内细胞器。Jo-Ann Church 将与我实验室的技术员 Yoko Horii 一起演示该操作流程。按照文本方案中所述制备肽等离子体 DNA 配方。当将多肽加入血浆DNA中时，溶液会变得浑浊。用超纯水稀释至文本方案中指定的最终体积后，混合物变为澄清。取800微升稀释后的溶液转移至比色皿中，用于动态光散射分析。使用泽塔纳米粒度仪测定所形成复合物的流体动力学直径和多分散性指数。采用633纳米氦氖激光，在25摄氏度下以173度的背向散射角进行检测。完成粒径测量后，将溶液转移至折叠毛细管池中，在默认参数下（即25摄氏度时水的介电常数、折射率和黏度）进行泽塔电位测定。为通过原子力显微镜观察复合物溶液，取10微升样品滴加到新剥离的云母片表面，并将云母片置于加盖的塑料培养皿中，室温下静置过夜使其自然干燥。在25摄氏度空气中，采用弹簧常数为1.3牛顿/米的硅悬臂，在轻敲模式下采集复合物的图像。实验所用拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株生长三周，培养条件为16小时光照、8小时黑暗，温度22摄氏度。选择至少三片叶片进行透化处理，以作为基因表达定量分析的三个重复。用100微升复合溶液装填一支1毫升无针塑料注射器，用于一片叶片的转染。然后，将注射器尖端置于叶片的远轴面。将注射器针头轻轻抵住叶片，并用戴有乳胶手套的手指从叶片另一侧施加反向压力，同时缓慢推动注射器活塞。成功渗入的表现为叶片上出现湿润区域并逐渐扩散。对已渗入的叶片进行标记，以便识别。将转染了肽-质粒DNA的植物在培养室中孵育12小时。为评估转染效率，首先切下整个转染的叶片。对于使用海肾荧光素酶报告载体的转染实验，使用海肾荧光素酶检测试剂盒定量测定转染效率。首先，将每片切除的叶片放入一个 1.5 毫升微量离心管中。每管加入 100 微升 1X 裂解缓冲液。以相同方式，制备未转染对照叶片的裂解液，设三个重复。使用匀浆杵研磨叶片，并将所得裂解液在25摄氏度下孵育6至10小时。孵育结束后，在微量离心机中以12,470 × g离心1分钟。取20 µL澄清裂解液转移至96孔微孔板中的一个孔内。按照生产商说明书，使用BCA蛋白检测试剂盒对剩余体积的样品进行总蛋白浓度定量。随后，向孔中加入100 µL一倍浓度的Renilla荧光素酶检测试剂底物，通过缓慢移液混匀。将微孔板放入多功能微孔板读板仪中，并启动检测。使用绿色荧光蛋白报告载体进行转染实验时，采用共聚焦激光扫描显微镜观察荧光。首先，修剪整片叶片的边缘，以利于去除气室。然后，从10毫升注射器中取出活塞，将每片切除的叶片或叶片片段放入注射器中。将柱塞重新插入，并轻轻推至注射器底部，注意不要压碎叶片。将水吸入注射器，直至注射器约一半充满。将注射器朝上，推动柱塞，使空气从注射器尖端排出。然后，盖住注射器的尖端，缓慢下拉活塞，以排出叶片中的空气。重复此过程数次，直至叶片呈现半透明状。接着，用胶带覆盖载玻片的表面。使用刀片在胶带上切割出一个足够容纳叶片样品的方形区域，然后用镊子将这块方形胶带剥离，以形成一个样品室。该胶带将作为载玻片与盖玻片之间的间隔物。将叶片放入样品室中，使其远轴面朝上，并用水填充样品室的剩余空间。用玻璃盖玻片将叶片密封于样品室中，并用胶带固定盖玻片边缘。使用共聚焦激光扫描显微镜，以40倍物镜或63倍水浸物镜观察叶片样品。在488纳米激发波长下可观察到GFP荧光。在肽与DNA比例为0.5的条件下，制备最优的肽-质粒DNA复合物应具有约290纳米的平均直径和约0.3的低多分散指数，表明其粒径分布均匀。此外，该复合物应表现出约30毫伏的Zeta电位。此处展示了一张具有代表性的原子力显微镜图像，显示肽-质粒DNA复合物的形态。观察到均一的球形复合物。利用肽-质粒DNA制剂，可在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中实现质粒DNA的核靶向递送与表达，其每毫克雷尼拉荧光素酶活性值估计约为100,000。通过显微观察经编码GFP报告基因的质粒DNA所制备复合物处理的叶片，以评估基因表达情况。图像显示，在转染了非靶向肽-质粒DNA复合物的细胞中，可清晰观察到与GFP表达相对应的弥散性绿色荧光，且其定位于细胞质中。该技术发展后，为植物生物技术领域的研究人员将多种基于蛋白质和核酸的货物递送至活体植物体内铺平了道路。在观看本视频并阅读文字版实验方案后，您应能够充分理解如何制备、表征并应用针对每种类型货物（包括质粒DNA、双链DNA或RNA以及蛋白质）的多种优化配方。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

肽衍生的方法在运输跨越植物细胞的基因和蛋白质和细胞器障碍

通过瞬时表达带有荧光标记的目标蛋白质，并利用共聚焦显微镜分析其在细胞内和细胞间的分布，可以评估大分子在植物细胞间的转运情况。...

一种细胞间大分子转运检测方法 在活体植物中 利用基因枪轰击技术

植物提供了一种新颖的系统，可用于大规模商业化生产药用蛋白，相较于现有的表达模式，该系统更具可扩展性、成本效益更高且更安全。在本研究中，我们报道了一种简单便捷且可扩展的方法，将含有目的基因的根癌农杆菌（Agrobacterium...

高效农杆菌浸润法实现植物中重组蛋白的高水平瞬时表达

本研究介绍了一种利用BioRad基因枪检测的植物亚细胞器选择性靶向新方法。...

利用Gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达

关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术

锌指结构域具有内在的细胞通透性，能够介导蛋白质递送至多种哺乳动物细胞类型。本文提供了一种利用锌指技术实现细胞内蛋白质递送的详细逐步操作方案。...

利用可穿透细胞的Cys2-His2锌指结构域向哺乳动物细胞直接递送蛋白质

植物细胞间的连接结构——胞间连丝（Pd），在植物生理过程及植物与病毒的相互作用中发挥着核心作用。决定蛋白质向胞间连丝运输的关键因素是引导蛋白质定位至胞间连丝的分选信号。然而，目前对这类信号序列的认识仍处于初级阶段。本文介绍一种用于鉴定靶向胞间连丝蛋白中胞间连丝定位信号的策略。...

鉴定蛋白质中的胞间连丝定位序列 活体植株中

我们开发了一种简单高效的方案，用于制备大量大豆原生质体，以研究活细胞中复杂的调控和信号传导机制。...

一种简易的大豆原生质体分离方法及其在瞬时基因表达分析中的应用

我们开发了一种在植物中共同表达多种嵌合型荧光融合蛋白的新方法，以克服传统方法的困难。该方法利用含有多个功能上相互独立的蛋白表达盒的单个表达质粒，实现蛋白的共表达。...

高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

我们描述了一种方法，用于表征通过在大肠杆菌（E.

通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 E. coli 膜泡的制备与生产

本文描述了一种新型的直接植物输注装置，用于筛选分子对细菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）或其昆虫媒介（Diaphorina citri,...

用于植物分子递送的直接灌注装置

本方案描述了在病毒与胞间连丝相互作用或胞间连丝运输过程中，针对蛋白质靶向胞间连丝的共聚焦显微镜分析，如何选择最优的胞间连丝标记物。...

共聚焦显微镜分析蛋白质向胞间连丝的分选 Nicotiana benthamiana

了解一种基于肽的新型植物转化方法，通过注射器辅助转染技术将基因和蛋白质高效递送至拟南芥细胞。该技术克服了传统方法成本高、适用性有限的缺点，为植物生物技术研究提供了简单高效的替代方案。

源自肽的方法实现基因和蛋白质在植物细胞及细胞器屏障间的转运

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