的细胞内信号与相邻小区发生细胞凋亡通过互动活细胞诱导活动标识
December 27th, 2016
在这里，我们提出了一种方案，用于确定通过与相邻死亡或垂死细胞的物理相互作用在活细胞中诱导的细胞内信号事件。该方案侧重于受体介导的死细胞识别诱导的信号转导事件，而不是它们吞噬摄取或释放可溶性介质。
该程序的总体目标是在与附近死细胞进行物理相互作用后识别信号事件诱导的活反应细胞。这种方法可以帮助回答细胞生物学、病理学和生理学领域的关键问题，例如死亡或垂死的细胞对其活细胞邻居的影响。该技术的主要优点是简单且成本低廉，并且可用于研究活细胞与正在凋亡的邻近细胞相互作用后诱导的生物效应。
演示这项技术的将是我实验室的技术人员 Lanfei Feng。要将 BUNPT 细胞传递到 100 毫米真空气体等离子体处理的组织培养皿中后开始此过程，请在培养基 A 中培养至汇合，并在 37 摄氏度下加湿 5% 二氧化碳气氛。之后，用培养基 B 冲洗贴壁细胞单层 3 次，然后，将细胞在含有星形孢菌素（一种非选择性蛋白激酶抑制剂）的培养基 B 中在 37 摄氏度下孵育 3 小时，诱导细胞凋亡。
3 小时后，收集含有已从单层分离的漂浮凋亡细胞的培养基。随后，以 500 次 G 离心该培养基 10 分钟，弃去上清液，用培养基 B 洗涤沉淀 3 次，然后将其加回贴壁细胞中。在此洗涤步骤之后，通过在 1X 不含钙和镁的 DPBS 中加入 5 毫摩尔 EDTA 来分离剩余的贴壁细胞。
收集含有分离的凋亡细胞的培养基，并将分离的细胞与漂浮的凋亡细胞一起放入无菌的 15 毫升聚苯乙烯离心管中。然后以 500 x G 的离心力离心 10 分钟，洗涤凋亡细胞 3 次，然后每次洗涤重悬于 10 毫升不含钙和镁的 DPBS 中。最后一次洗涤后，将凋亡细胞以每毫升 5x10^6 个细胞的浓度悬浮在新鲜培养基 B 中，然后使用它们刺激应答细胞。
或者，将洗涤后的凋亡细胞固定在 0.4 多聚甲醛的 1X DPBS 中 30 分钟，然后用培养基 B 洗涤 3 次，并以每毫升 5x10^6 个细胞的浓度悬浮在其中，然后再使用它们刺激反应细胞。将 BUNPT 细胞传代到直径为 100 毫米的无菌聚苯乙烯真空气体等离子体处理的组织培养皿上后，在允许的条件下将它们培养至汇合并加湿的 5% 二氧化碳气氛。然后用 10 mL 培养基 B 冲洗贴壁细胞单层 3 次，每次冲洗。
随后，通过在 1X 不含钙和镁的 DPBS 中加入 5 mM EDTA 来分离细胞。从含 EDTA 的培养基中收集分离的细胞，并将细胞悬液添加到无菌的 15 mL 聚苯乙烯离心管中。接下来，以 500 倍 G 离心 10 分钟，洗涤细胞 3 次，每次洗涤重悬于 10 mL 不含钙和镁的 DPBS 中。
最后一次洗涤后，将细胞以 5x10^6 个细胞/毫升的浓度悬浮在新鲜培养基 B 中。然后，通过在水浴中将细胞加热至 70 摄氏度 45 分钟，每 10 分钟轻轻涡旋一次细胞悬液来诱导坏死。诱导坏死后，将细胞在 37 摄氏度的加湿 5% 二氧化碳气氛中孵育 2 小时，并每 15 分钟轻轻涡旋一次细胞悬液。
在此过程中，在允许的条件下，在无菌的 100 毫米组织培养皿中培养 BUNPT 细胞，直到它们达到约 85% 的汇合度。然后，吸出培养基 A，每次冲洗用 10 mL 培养基 B 冲洗细胞 3 次。然后，在非允许条件下，在加湿的 5% 二氧化碳气氛中，将血清在培养基 B 中饥饿 18 至 24 小时，以诱导静止。
标记汇合 BUNPT 细胞的单独组织培养皿，用于下一个程序的六个实验条件。现在，从静止 BUNPT 反应细胞的预标记培养皿中吸出培养基 B。为了在不同条件下制备 100 毫米培养皿，加入 2 mL 无细胞培养基 B，在培养基 B 中以每毫升 5X10^6 个细胞的浓度添加凋亡细胞悬液，或在培养基 B 中以每毫升 5X10^6 个细胞的浓度添加 5X10^6 个细胞的坏死细胞悬液，实现 1 比 1 的死细胞与反应细胞比率汇合的 100 毫米培养皿，其中包含 10X10^6 个细胞。
轻轻旋转盘子。然后将它们在 37 摄氏度的潮湿 5% 二氧化碳气氛中孵育。30 分钟后，根据培养皿的预标记，用载体或 15 nMOL EGF 刺激反应细胞。
将细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳湿润气氛中孵育 15 分钟。然后，通过添加 5 毫米冰冷的 DPBS 洗去死细胞。旋转培养皿并吸出洗涤液。
重复洗涤 3 次。然后立即将应答细胞培养皿置于冰上进行进一步处理。该图显示，静止的 BUNPT 应答者暴露于凋亡细胞 30 分钟强烈抑制了 GSK3 α β 的基础磷酸化。
为了防止 BUNPT 应答基因和凋亡细胞之间的物理相互作用，BUNPT 应答基因在可渗透的支持系统中生长，并通过 0.4 微米聚碳酸酯膜与凋亡靶标分离。阻止 BUNPT 反应者和凋亡细胞之间的物理相互作用消除了凋亡靶标抑制 GSK3 α β 磷酸化的能力。为了评估吞噬作用的作用，使用细胞骨架抑制剂细胞松弛素 D 来防止死细胞的吞噬摄取。
在没有吞噬作用的情况下，响应凋亡细胞的 GSK3 α β 磷酸化受到抑制。一旦掌握，如果作得当，该技术可以在 4-6 小时内完成，不包括凝胶电泳和免疫印迹所需的时间。在尝试此过程时，重要的是要记住，使用细胞悬浮液而不是可溶性配体作为刺激会带来一些固有且基本上不可避免的实验障碍。
使用相同的程序，可以研究其他细胞功能，例如存活或增殖或细胞生长，以确定活反应细胞在与附近死细胞相互作用后诱导的信号转导事件的功能后果。观看此视频后，您应该对如何识别活反应细胞与附近死细胞发生物理相互作用后诱导的特定信号转导事件有很好的了解。
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概述
该协议概述了活细胞与相邻死亡或死去的细胞的物理相互作用所诱导的细胞内信号传导事件的确定。它强调受体介导的识别而非吞噬性摄取。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 病理学
- 生理学
背景
- 了解死细胞对活邻居的影响至关重要。
- 这种方法简单且经济实惠。
- 它可应用于研究活细胞与凋亡细胞相互作用后的生物效应。
- 由实验室技术员Lanfei Feng演示。
研究目的
- 识别活细胞中的信号传导事件。
- 探索死或死去的细胞对活细胞的影响。
- 提供研究细胞相互作用的协议。
使用的方法
- 在真空气体等离子体处理的培养皿中培养BUNPT细胞。
- 在培养基A中培养细胞至汇合。
- 用培养基B冲洗粘附的细胞单层。
- 在培养基B中使用司他曲宁诱导细胞凋亡。
主要结果
- 可以有效测量信号传导事件。
- 活细胞和死细胞之间的物理相互作用具有重要意义。
- 该协议是可重复和可靠的。
- 获得了对细胞对凋亡反应的洞察。
结论
- 该技术为细胞信号传导提供了宝贵的见解。
- 它增强了对各种生物学环境下细胞相互作用的理解。
- 该方法对相关领域的研究人员来说是可行的。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding how apoptotic cells modulate signaling in viable neighbors informs target validation by revealing context-dependent pathway modulation. This protocol enables mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses by distinguishing receptor-mediated, soluble mediator, and phagocytosis-dependent signaling mechanisms. Insights support predictive confidence in early discovery by clarifying how cell death influences functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying intracellular signaling events induced in responder cells via apoptotic cell interaction.
- Operational Value: Enables dissection of mechanism (receptor-mediated, soluble release, phagocytosis) to clarify pathway-specific effects.
- Predictive Value: Supports target validation by determining whether observed phenotypes depend on direct contact or soluble factors from apoptotic cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assessing compound effects on apoptosis-induced signaling in live cells.
- Operational Value: Standardizes co-culture conditions with defined apoptotic:responder ratios and wash steps to ensure reproducibility.
- Scalability: Uses inexpensive, straightforward techniques adaptable to multi-well formats for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase signaling observations to disease-relevant systems where apoptotic cell clearance influences tissue homeostasis.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes phagocytosis-dependent vs. independent signaling to avoid misattribution of drug effects in preclinical models.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether target modulation requires viable cell interaction with dying neighbors.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within early discovery to assess how microenvironmental cues from apoptotic cells influence target engagement and pathway modulation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating variables (e.g., phagocytosis inhibition) to determine mechanism of apoptotic cell signaling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation of apoptotic cells and serum-starved responders for consistent stimulus delivery.
- Analytics: Facilitates quantitative measurement of phosphorylation states (e.g., GSK3 alpha/beta) as dependent variables to compare signaling conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling how apoptotic cell burden in tissues may alter drug response in viable cells.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for studying necrotic vs. apoptotic cell effects across cell lines and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic dissection of apoptotic cell signaling pathways.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined cell ratios, wash steps, and controls for phagocytosis and physical separation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying whether drug effects require intact apoptotic cell interaction or are mediated by soluble factors.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by distinguishing contact-dependent vs. soluble mediator mechanisms in pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, apoptosis induction, and sterile handling of cell suspensions.
- Needs centrifugation equipment, vacuum gas plasma-treated dishes, and reagents for apoptosis (staurosporine) and necrosis induction.
- Demands standardization across teams for apoptotic cell preparation, washing, and quantification to ensure consistent stimulus activity.
- Involves adaptation considerations when transferring to non-epithelial or non-kidney-derived cell lines, though protocol notes ease of adaptation.
- Includes practical limitations such as variability in apoptotic cell yield and challenges in detecting signaling amid cellular debris, mitigated by multiple washes and controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Preparation of Apoptotic BU.MPT Cells
3:03
Preparation of Necrotic BU.MPT Cells
4:39
Preparation of BU.MPT Responder Cells
5:27
Stimulation of Responder Cells with Apoptotic and Necrotic Cells
7:03
Results: Inhibition of Phosphorylation of GSK3α/β in BU.MPT Responder Cells Following Exposure to Apoptotic Cells Requires Direct Cell-cell Interaction but Is Independent of Phagocytosis
8:08
Conclusion
