利用X射线晶体学、生物物理学与功能检测确定T细胞受体识别肿瘤抗原的调控机制

本实验的总体目标是获得高质量的可溶性重组T细胞受体及肽段-HLA蛋白，以用于生物物理和结构分析。该方法有助于回答T细胞免疫学领域中的一些问题，例如，为何T细胞对癌症的反应不够强烈？

该技术的主要优势在于，能够获得极高分辨率的机制性数据，阐明T细胞受体如何识别其靶标，从而引发T细胞介导的免疫反应。该技术的应用前景广泛，几乎涵盖所有人类疾病的治疗或诊断，因为T细胞在大多数免疫反应中发挥着关键作用。尽管该方法可用于研究T细胞免疫反应，也可推广应用于其他由受体-配体相互作用调控的生物系统。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为要获得足够高质量、可溶且具有活性的蛋白质以用于生物物理和结构实验非常具有挑战性。开始进行多肽-HLA 复性操作时，向六毫升含 10 毫摩尔二硫苏糖醇的盐酸胍缓冲液中加入 30 毫克 HLA-A2 包涵体、30 毫克 β2-微球蛋白包涵体以及 4 毫克目标多肽。将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

然后，用一升预冷至4°C的HLA复性缓冲液稀释该混合物，并在该温度下搅拌三小时。将混合物在10毫摩尔Tris（pH 8.1）溶液中透析两次，每次20升，各持续24小时。开始TCR复性步骤时，向6毫升含10毫摩尔二硫苏糖醇的胍缓冲液中，分别加入30毫克TCR α链和β链包涵体。

将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，并用一升预冷的 TCR 复性缓冲液稀释该混合物。以与多肽 HLA 混合物相同的方式搅拌并透析稀释后的 TCR 复性混合物。将两种透析后的复性混合物均通过 0.45 微米膜滤器过滤。

接下来，将一种经过过滤复性处理的样品上样至一个7.9毫升、50微米的阴离子交换树脂柱，该柱已预先用20毫升10毫摩尔Tris缓冲液（pH 8.1）平衡。以每分钟5毫升的流速，使用盐梯度缓冲系统洗脱蛋白质。收集每管1毫升的洗脱组分，并通过SDS-PAGE分析各组分。

合并含有复性蛋白的组分。将蛋白混合物置于截留分子量为10千道尔顿的离心浓缩管中。在4000 × g条件下离心20分钟或直至浓缩至500微升所需的时间，以浓缩该混合物。

弃去流穿液。将浓缩的蛋白样品注入2毫升的进样环中，并将其上样至预先用适当洗脱缓冲液平衡的24毫升凝胶过滤层析柱。以0.5毫升/分钟的流速，用一个柱体积的缓冲液洗脱蛋白。

收集1 mL的洗脱组分，通过SDS-PAGE分析各组分，并合并含有目标蛋白的组分。配制TCR溶液的10个连续稀释浓度，浓度范围应覆盖已知KD值的10倍以上至10倍以下；若KD未知，则从200 µM的TCR浓度开始。

接下来，在25摄氏度下，以10微升/分钟的流速将100毫摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺与400毫摩尔的EDC等体积混合液流经羧甲基化葡聚糖包被的传感器芯片10分钟，以活化芯片表面。然后，在全部四个流通池中加载110微升浓度为200微克/毫升的链霉亲和素和pH 4.5的10毫摩尔乙酸缓冲液，以功能化芯片表面。最后用100微升1摩尔的乙醇胺盐酸盐溶液封闭任何剩余的活性基团。

接下来，以每分钟10微升的流速，将浓度约为1微摩尔的肽-HLA溶液在芯片制造商提供的缓冲液中流经芯片表面，直至响应单位数值增加500至600。随后，用1毫摩尔的生物素与制造商提供的缓冲液处理芯片表面60秒以达到饱和。然后，在25摄氏度下，以每分钟30微升的流速依次注入10个梯度稀释的TCR溶液。

计算平衡结合常数并进行动力学分析。以这种方式进行一系列 SPR 实验，仅改变注入 TCR 稀释液时的温度。测定每个温度下的平衡结合常数，并计算吉布斯自由能及其他热力学参数。

使用非线性回归拟合方法，绘制吉布斯自由能随温度变化的曲线。将肽段-HLA 溶液与结晶缓冲液在10 kDa分子量截断的离心浓缩管中，于3,000 × g条件下离心浓缩至0.2毫摩尔。配制0.1毫摩尔的一比一 TCR 与肽段-HLA 溶液，用于共复合物结晶。

使用结晶机器人和筛选试剂盒，在96孔板中采用悬滴法设置结晶实验。每个储液池中加入60微升结晶缓冲液，每滴由200纳升蛋白溶液和200纳升缓冲液组成。在18摄氏度下培养晶体。

在24小时、48小时、72小时后以及之后每周，在显微镜下对晶体进行评分。一旦生长出质量足够的单晶，使用与低温剂兼容的环状工具收集单晶，并将晶体储存在液氮中。在100开尔文温度下，通入氮气流进行同步辐射X射线衍射，分析数据并使用适当的软件解析结构。

根据已解析的结构计算接触面、表面互补性以及交叉角度。利用这些方法，TCR 和肽段-HLA 分子被表达并重折叠为可溶性形式。肽段-HLA 分子中的肽段为 gp100 抗原。

采用表面等离子共振（SPR）技术测定PMEL17 TCR与抗原在不同温度下的结合亲和力。随后利用SPR和等温滴定微量热法共同确定该蛋白质-蛋白质相互作用的热力学参数。PMEL17 TCR与A2-YLE-9V复合物经结晶后，采用同步辐射X射线衍射进行分析。

已鉴定出TCR的CDR环以及TCR蛋白所接触的肽段-HLA残基，并研究了这些相互作用的性质。还通过该方法纯化并结晶了含有突变肽段的肽段-HLA分子，以探究可能阻碍与TCR结合的结构差异。

第三或第五位残基的突变被发现会显著改变脯氨酸第四位的位置，从而破坏与TCR CDR-3 Alpha环的多个相互作用。在进行该操作时，重要的是仅选择最纯的蛋白质用于后续分析。完成该步骤后，可利用可溶性蛋白质进行其他方法，如肽-HLA四聚体染色，以从患者血液中分离抗原特异性T细胞，用于诊断和进一步分析。

该技术问世后，为T细胞免疫学领域的研究人员深入探索T细胞受体（TCR）与肽段-HLA结合机制铺平了道路，推动了针对癌症及其他人类疾病新药的研发。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备高质量的TCR及肽段-HLA蛋白，以开展生物物理和结构分析。