Name: 利用X射线晶体学，生物物理学，和功能分析，以确定管理机制T细胞癌抗原的受体识别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解利用X射线晶体学和表面等离子体共振技术分析T细胞受体与肿瘤抗原相互作用的方法。该技术可生成可溶性TCR和肽HLA蛋白，用于研究T细胞免疫应答机制，为癌症免疫治疗提供高分辨率结构数据和热力学参数。

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BM 获得英国癌症研究会博士生奖学金的支持。AG 获得威尔士生命科学研究网络博士生奖学金的支持。VB 获得威尔士癌症研究会博士生奖学金的支持。DKC 是惠康信托研究职业发展研究员（WT095767）。AKS 是惠康信托研究员。GHM 获得威尔士生命科学研究网络与Tenovus癌症护理联合资助的博士生奖学金。我们感谢钻石光源（Diamond Light Source）的工作人员提供的设施与支持。

1. 蛋白质表达
<ol>
	<li>按照先前详细描述的方法构建用于生成可溶性TCR和pHLA的基因质粒17,18。每个构建体设计为含有5'端BamH1和3'端EcoR1限制性酶切位点，以便插入pGMT7载体中。</li>
	<li>将含有目标蛋白编码序列的pGMT7衍生质粒转化至大肠杆菌（E. coli）Rosetta (DE3)pLysS中：取1 µL浓度为50–200 ng/µL的质粒与5 µL E. coli混合，于4 °C孵育5分钟，42 °C孵育2分钟，再于4 °C孵育5分钟，随后涂布于添加了50 mg/L羧苄青霉素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。</li>
	<li>挑取单菌落，在30 mL添加了100 µM羧苄青霉素的TYP培养基（16 g/L胰蛋白胨、16 g/L酵母提取物和5 g/L KH2PO4）中，于37 °C、220 rpm条件下培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD600）达到0.4至0.6之间。</li>
	<li>取5 mL培养物，加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达3小时。分别保留20 µL诱导前和诱导后的菌液用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，并对凝胶进行染色。</li>
	<li>将上述培养的种子液接种至1 L添加了100 µM羧苄青霉素的TYP培养基中，按步骤1.3所述条件继续培养，直至菌液OD600达到0.4至0.6。</li>
	<li>加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达3小时。以3,000 × g离心20分钟，小心弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀溶解于40 mL裂解缓冲液（10 mM Tris，pH 8.1；10 mM氯化镁，MgCl2；150 mM NaCl；10%甘油）中，在冰上超声处理30分钟（功率60%，每2秒间隔一次），随后在室温（RT）下加入0.1 g/L DNase孵育30分钟。</li>
	<li>用100 mL洗涤缓冲液（0.5% Triton X-100；50 mM Tris，pH 8.1；100 mM NaCl；10 mM EDTA）处理含有包涵体（IB）形式蛋白的悬浮液。</li>
	<li>在4 °C、8,000 × g条件下离心20分钟，小心弃去上清液。将沉淀重悬于100 mL重悬缓冲液（50 mM Tris，pH 8.1；100 mM NaCl；10 mM EDTA，pH 8.1）中，再次以8,000 × g离心，小心弃去上清液。</li>
	<li>最后，将沉淀溶解于10 mL变性缓冲液（6 M盐酸胍；50 mM Tris，pH 8.1；2 mM EDTA，pH 8.1；100 mM NaCl）中，并使用分光光度计在280 nm处测定蛋白浓度。</li>
</ol>
2. pHLA 和 TCR 复性
<ol>
	<li>对于pHLA复性，将30 mg HLA-A2（或带有生物素标签的HLA-A2）包涵体、30 mg β2m包涵体和4 mg多肽在6 mL含10 mM二硫苏糖醇（DTT）的变性缓冲液中混合，在37 °C水浴中孵育30分钟。</li>
	<li>通过将上述混合物稀释至1 L预冷的pHLA复性缓冲液（50 mM Tris，pH 8.1；400 mM L-精氨酸；2 mM EDTA，pH 8.1；6 mM 半胱胺；4 mM 胱胺）中，启动蛋白复性过程，持续3小时。</li>
	<li>在4 °C下搅拌复性反应液3小时，随后转移至12.4 kDa截留分子量（MWCO）透析管中，用20 L的10 mM Tris缓冲液（pH 8.1）透析两次，每次24小时。</li>
	<li>对于TCR复性，将30 mg TCR α链包涵体和30 mg TCR β链包涵体在6 mL含10 mM DTT的变性缓冲液中混合，在37 °C水浴中孵育30分钟。</li>
	<li>通过将变性的TCR混合物稀释至1 L预冷的TCR复性缓冲液（50 mM Tris，pH 8.1；2.5 M 尿素；2 mM EDTA，pH 8.1；6 mM 半胱胺；4 mM 胱胺）中，启动蛋白复性，持续3小时。</li>
	<li>将复性产物转移至12.4 kDa MWCO透析管中，用20 L的10 mM Tris缓冲液（pH 8.1）透析两次，每次24小时。</li>
	<li>使用0.45 µm膜滤器对pHLA或TCR复性产物进行过滤，以用于后续纯化步骤。</li>
</ol>
3. 快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化
<ol>
	<li>将过滤后的复性产物（pHLA 或 TCR）上样至一个 7.9 mL、50 µm 的阴离子交换树脂柱，该柱已使用 20 mL 的 10 mM Tris（pH 8.1）在灵活且直观的层析系统上预先平衡。</li>
	<li>以 5 mL/min 的流速，用盐梯度（在 10 mM Tris，pH 8.1 中含 0–500 mM NaCl，8 个柱体积内完成）洗脱蛋白，并收集 1 mL 的组分。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 分析对应目标蛋白的组分，合并含有目标蛋白的组分，并通过离心（4,000 × g，20 分钟）使用 10-kDa 截留分子量（MWCO 20）或 10 kDa 截留分子量（MWCO 4）超滤管浓缩至 500 µL，弃去滤过液。</li>
	<li>将浓缩后的蛋白样品加载至 2 mL 上样环，进样到已预先用适当洗脱缓冲液平衡的 24 mL 凝胶过滤层析柱中：磷酸盐缓冲盐水（PBS）、HBS（10 mM HEPES，pH 7.4；150 mM NaCl；3.4 mM EDTA；0.005% 表面活性剂）或结晶缓冲液（10 mM Tris，pH 8.1，10 mM NaCl）。</li>
	<li>以 0.5 mL/min 的流速在一个柱体积范围内洗脱蛋白；收集经 SDS-PAGE 验证含有目标蛋白的 1 mL 组分。 
	注：这些方法用于制备可溶性 PMEL17 TCR 和 gp100 TCR，以及本研究中使用的所有 pHLA：HLA-A*0201 负载 YLEPGPVTA（A2-YLE）、YLEPGPVTV（A2-YLE-9V）、ALEPGPVTA（A2-YLE-1A）、YLAPGPVTA（A2-YLE-3A）、YLEAGPVTA（A2-YLE-4A）、YLEPAPVTA（A2-YLE-5A）、YLEPGAVTA（A2-YLE-6A）、YLEPGPATA（A2-YLE-7A）或 YLEPGPVAA（A2-YLE-8A）。</li>
</ol>
4. 表面等离子体共振（SPR）分析
<ol>
	<li>使用配备 CM5 传感器芯片的分子相互作用分析系统进行平衡结合分析或热力学分析19。</li>
	<li>以 10 µL/min 的流速和 25 °C 的条件，注入 100 mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与 400 mM 1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺（EDC）的 1:1 混合液，持续 10 分钟，以活化 CM5 芯片。</li>
	<li>将链霉亲和素（200 µg/mL 溶于 10 mM 乙酸盐缓冲液，pH 4.5，共 110 µL）共价偶联至四个流通池的芯片表面，加载约 5,000 响应单位（RU），随后使用 100 µL 的 1 M 盐酸乙醇胺封闭芯片上剩余的活性基团。</li>
	<li>将约 500–600 RU 的 pHLA（浓度约为 1 µM，溶于商品化缓冲液，由生产商提供）以 10 µL/min 的低流速偶联至 CM5 传感器芯片，以确保其在芯片表面均匀分布。</li>
	<li>用商品化缓冲液（由生产商提供）中含 1 mM 生物素的溶液冲洗芯片表面 60 秒，以饱和未结合位点。</li>
	<li>在 25 °C 下，以 30 µL/min 的高流速将可溶性 TCR 的十个连续稀释浓度注入相应的流通池。</li>
	<li>采用非线性曲线拟合（y = (P1x)/(P2+x)）计算平衡结合常数（KD (E)）值20。 
	注：y = 响应单位，x = 分析物浓度，P1 = rmax，P2 = KD。</li>
	<li>假设为 1:1 Langmuir 结合模型，使用软件包中的全局拟合算法进行动力学分析2。</li>
	<li>通过在以下温度下重复该方法进行热力学实验：5 °C、12 °C、18 °C、25 °C 和 30 °C19。</li>
	<li>利用 SPR 在不同温度下测定的 KD 值，根据标准热力学方程（ΔG° = -RTlnKD）计算 ΔG°19。 
	注：R = 气体常数，T = 开尔文温度，ln = 自然对数。</li>
	<li>根据 Gibbs-Helmholtz 方程（ΔG° = ΔH − TΔS°）计算热力学参数19。</li>
	<li>以结合自由能 ΔG°（ΔG° = -RTlnKD）对温度（K）作图，采用非线性回归拟合三参数方程（y = ΔH+ΔCp*(x-298)-x*ΔS-x*ΔCp*ln(x/298)）19。 
	注：y = 温度（K），x = ΔG°。</li>
</ol>
5. 等温滴定 calorimetry（ITC）
<ol>
	<li>使用等温滴定微量热仪进行ITC实验。将30 µM pHLA注入量热计样品池中，并将210 µM可溶性TCR装入注射器中。缓冲液条件如下：20 mM Hepes（pH 7.4），含150 mM NaCl。</li>
	<li>进行20次TCR注射，每次注射体积为2 µL。使用分析软件计算ΔH和KD。</li>
</ol>
6. 结晶、衍射数据收集与模型优化
<ol>
	<li>使用结晶机器人进行结晶实验。</li>
	<li>在18 °C条件下，采用悬滴法于96孔板中通过蒸气扩散法生长晶体，每个储液池中含60 µL结晶缓冲液（母液）21。</li>
	<li>将可溶性pHLA在结晶缓冲液中浓缩至约10 mg/mL（0.2 mM），使用截留分子量为10 kDa的离心浓缩器，在3,000 × g条件下离心完成。</li>
	<li>对于共复合物结构，将TCR与pHLA按1:1摩尔比混合，获得浓度约为10 mg/mL（0.1 mM）的蛋白溶液。</li>
	<li>使用结晶机器人，将200 nL单独的pHLA或TCR与pHLA的1:1摩尔比混合液，加入至结晶筛选板中每孔200 nL的储液溶液中，并在24小时、48小时、72小时后以及此后每周在显微镜下观察并记录晶体生长情况。</li>
	<li>在显微镜下手动将单晶装载至冷冻环中，并通过浸入液氮（100 K）进行冷冻冷却并保存。 
	注：晶体装载需要一定练习，而判断哪些晶体适合用于数据收集则依赖经验。一般而言，晶体越大且越规则，质量越好。</li>
	<li>在100 K的氮气流中收集衍射数据。 
	注：本研究的数据是在英国Diamond Light Source（DLS）国家同步辐射科学设施采集的。</li>
	<li>使用xia2程序结合MOSFLM22和XDS软件包23估算衍射点强度，然后使用SCALA或AIMLESS24以及CCP4软件包25对数据进行标度处理。</li>
	<li>采用分子置换法，使用PHASER26求解结构。</li>
	<li>使用COOT27对模型进行调整，并使用REFMAC528对模型进行精修。</li>
	<li>使用PYMOL29生成结构图示。</li>
	<li>使用CCP4软件包中的&#34;contact&#34;程序计算分子间相互作用，范德华接触的截断距离设为4 Å，氢键和盐桥的截断距离设为3.4 Å。</li>
	<li>使用CCP4软件包中的&#34;SC&#34;程序计算表面互补性。</li>
	<li>按照文献所述方法计算TCR-pHLA复合物的交叉角度30。 
	注：本研究中，衍射数据和最终模型坐标已提交至PDB数据库（PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6，A2-YLE PDB: 5EU3，A2-YLE-3A PDB: 5EU4，以及A2-YLE-5A PDB: 5EU5）。</li>
</ol>

作者没有利益冲突或竞争性经济利益。

本文所述方案为在任何人类疾病背景下进行T细胞反应的分子与细胞层面解析提供了框架。尽管本研究主要聚焦于癌症，但我们已采用非常相似的方法来研究T细胞对病毒32,33,34,35,36,37以及自身免疫疾病38,39,40的反应。此外，我们还更广泛地应用这些技术来理解调控T细胞抗原识别的分子机制2,19,41,42。事实上，肽段残基修饰的不可预测性——即使这些残基位于TCR接触残基之外——对T细胞识别的影响，对于异源肽（heteroclitic peptides）的设计具有重要意义。这些发现已直接推动了新型T细胞疗法的发展，包括肽疫苗6,43和人工高亲和力TCR3,4,5,20,44，以及更优的诊断技术45,46,47。
方案中的关键步骤 
获得高纯度且具有功能活性的蛋白质对于本文所述所有方法均至关重要。
修改与故障排除 
获得高纯度蛋白的困难通常与表达高纯度但不溶性包涵体（IBs）有关 E. coli 表达系统。通常，修改表达方案（例如， 在不同光密度下诱导，使用不同的 E. coli 菌株或使用不同培养基配方）可解决这些问题。
技术的局限性 
这些技术使用的是通常在细胞表面表达的可溶性蛋白质分子（TCR 和 pHLA）。因此，重要的是要确保结构/生物物理研究结果与细胞水平的研究方法一致，以验证其生物学意义。
该技术相对于现有/替代方法的重要性 
通过结合功能分析验证的X射线晶体学和生物物理学方法，我们及其他研究者已证明，特异性识别癌症表位的TCR通常具有较低的结合亲和力48。这种低TCR亲和力可能有助于解释为何T细胞在自然状态下无法有效清除癌细胞。抗肿瘤TCR与相应肿瘤抗原复合物的高分辨率原子结构研究正逐步揭示这种弱亲和力的分子基础。此外，这些研究有助于阐明旨在克服这一问题的治疗干预措施背后的机制，为未来的改进提供依据16。在本研究中，我们解析了天然存在的αβTCR与gp100 HLA-A*0201限制性黑色素瘤表位复合物的首个结构。该结构结合深入的生物物理分析，揭示了该相互作用的整体结合模式。我们还发现了一种意外的分子开关机制：在肽段的突变形式中，该机制阻断了TCR的结合（通过表面等离子共振检测）以及CD8+ T细胞的识别（通过功能实验验证）。只有借助本文所述的高分辨率方法，才能揭示这种HLA抗原呈递的新机制。
掌握该技术后的未来应用或研究方向 
总体而言，我们的结果展示了X射线晶体学与生物物理方法在结合稳健的功能分析时的强大能力。利用这些方法，可以解析出调控T细胞抗原识别的精确分子机制。事实上，该方法也可用于解析未结合配体的TCR结构，从而揭示构象变化在抗原分辨过程中的作用49,50,51。对TCR-pHLA相互作用背后高度复杂且动态特性的更深入理解，显然对治疗策略的设计具有重要意义。能够直接&#34;观察&#34;治疗靶向的分子，以及修饰对抗原识别所产生的影响，将显著促进未来药物的开发。在本研究中，我们发现即使TCR并未显著接触的肽段单个残基发生改变，也可能不可预测地将结构变化传递至HLA结合肽段中的其他残基，从而剧烈改变T细胞的识别行为。在设计针对多种人类疾病的未来疗法时，对T细胞抗原识别过程中所涉及分子机制的更全面理解将带来巨大裨益。

X射线晶体学过去是，未来仍将是理解配体-受体相互作用本质的一种极为强大的技术。通过在原子水平上可视化这些相互作用，不仅能够揭示调控多种生物过程的分子机制，还可以直接改造相互作用界面以获得治疗效益。结合表面等离子共振和等温滴定 calorimetry（仅举两例）等技术，可对这些改造进行生物物理分析，以评估其对结合亲和力、相互作用动力学及热力学的直接影响。最后，通过对相关细胞类型进行功能实验，可以获得配体-受体相互作用在分子和功能层面影响的详细图景，从而提供非常特异的机制性信息。总体而言，这类方法提供了原子分辨率的视角，有助于阐明生物系统的工作机制，并为诊断和治疗的进步带来重要启示。
本实验室常规使用这些技术来研究介导人类T细胞对病原体和癌症免疫反应的受体，以及在自身免疫和移植过程中的相关受体。本文重点探讨由T细胞受体（TCR）与人类白细胞抗原（HLA）限制性肿瘤来源肽段（pHLA）相互作用所介导的人CD8+ T细胞对癌症的免疫应答。这一点非常重要，因为尽管CD8+ T细胞能够靶向癌细胞，但我们及其他研究团队此前已证实，抗肿瘤TCR与其对应的pHLA结合效率较低1,2。因此，许多实验室尝试改造TCR3,4,5或肽配体6,7,8，以增强免疫原性并更有效地靶向癌细胞。然而，这些方法并不总是有效，且可能产生严重副作用，包括脱靶毒性4,9,10。进一步研究调控T细胞识别肿瘤抗原的分子机制，对于克服上述局限性至关重要。
在本研究中，我们重点关注了CD8对自体黑色素瘤细胞的反应+ 针对黑色素细胞分化抗原糖蛋白100（gp100）片段的T细胞，gp100280-288，由HLA-A*0201（最常表达的人类pHLA I类分子）呈递。该抗原是黑色素瘤免疫治疗中被广泛研究的靶点，并已被开发为所谓的 &#34;异源性&#34; 一种在锚定位点9处以缬氨酸取代丙氨酸以提高pHLA稳定性的多肽11该方法被用于增强黑色素瘤反应性CTL的诱导 体外 并在临床试验中成功应用12然而，肽残基的修饰可能对T细胞特异性产生不可预测的影响，这一点已通过大多数异源肽在临床应用中的低效性得到证实6,13确实，gp100的另一种异嗜性形式280-288，其中肽段第3位的谷氨酸残基被丙氨酸取代，导致gp100多克隆群体无法识别280-288特异性T细胞14,15我们先前已证明，即使肽段锚定残基发生微小改变，也可能以不可预测的方式显著改变T细胞的识别6,16因此，该研究着重于构建更详细的CD8+ T细胞识别gp100，以及TCR与pHLA之间相互作用的修饰如何影响这一功能。
本研究中，我们制备了两种针对由HLA-A*0201（A2-YLE）呈递的gp100280-288的T细胞受体（TCR）的高纯度可溶性形式，以及天然型和修饰型pHLA分子。这些试剂被用于获得蛋白质晶体，以解析人源TCR与异嗜性A2-YLE复合物的三元原子结构，以及两种未结合状态的突变型pHLA结构。随后，我们采用肽段扫描方法，通过深入的生物物理实验，揭示肽段替换对TCR的影响。最后，我们构建了一株经基因改造的CD8+ T细胞系，使其表达其中一种特异性识别A2-YLE的TCR，以开展功能实验，评估不同肽段修饰的生物学效应。研究结果表明，即使对TCR结合基序以外的肽段残基进行修饰，也可能对邻近残基产生不可预测的连锁效应，从而阻断TCR结合及T细胞识别。本研究首次揭示了T细胞识别黑色素瘤重要治疗靶点的结构机制。

<table><tbody><tr><td>S.O.C. 培养基</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe New Orbit 培养箱</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>carbenicillin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain SafeStain&amp;nbsp;</td><td>Generon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT 离心机&amp;nbsp;</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化镁&amp;nbsp;</td><td>Arcos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls HD 2070&amp;nbsp;</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA酶&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胍&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND1000&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多肽</td><td>Peptide Protein Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸&amp;nbsp;</td><td>SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>半胱胺&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胱胺&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透析袋&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metricel 0.45 &amp;mu;m 膜滤器</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&amp;nbsp;</td><td>Applied biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA pure FPLC 系统&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&amp;nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&amp;nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL 色谱柱&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Oxoid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore 缓冲液 HBS&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素化试剂盒</td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM5 芯片偶联试剂盒</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal VP-ITC&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon 结晶机器人</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intelli-plate&amp;nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>结晶筛选试剂盒及试剂</td><td>Molecular Dimensions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤器</td><td>Miller-GP, Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 超速离心管&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP 配 SW28 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 磁珠&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 CD3/CD28 Dynabeads&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 PE 磁珠&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK 培养基，PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 TCRV&amp;beta; 单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>达沙替尼&amp;nbsp;</td><td>Axon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&amp;beta; 和 TNF&amp;alpha; ELISA&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Cr&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450 Microbeta 计数器</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用x射线晶体学、生物物理学与功能检测确定t细胞受体识别肿瘤抗原的调控机制

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

人类 CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）在肿瘤控制中发挥着重要作用。为了实现这一功能，细胞表面表达的T细胞受体（TCR）必须能够功能性识别由人类白细胞抗原（HLA）限制的肿瘤来源肽段（pHLA）。然而，我们及其他研究者已发现，大多数TCR与肿瘤抗原的结合效果次优。揭示决定这种低效识别的分子机制，将有助于开发新的靶向疗法，以克服这些局限性。事实上，目前缺乏此类分子层面理解的治疗方法尚未普遍有效。本文描述了我们在实验室中常用的方法，用于研究TCR与pHLA之间相互作用的性质如何调控T细胞功能。这些方法包括可溶性TCR和pHLA的制备，以及利用这些试剂进行X射线晶体学分析、生物物理分析，以及使用pHLA多聚体对T细胞进行抗原特异性染色。通过这些方法并结合结构分析，可以对TCR与pHLA之间的相互作用进行改造，并进一步检测这些改造如何影响T细胞对抗原的识别。这些研究成果已帮助阐明了T细胞识别多种肿瘤抗原的机制，并可指导改造肽段和修饰TCR的设计，从而推动新型癌症疗法的开发。

本文介绍了我们在实验室中常用的方法，用于研究T细胞受体与人类白细胞抗原呈递的肿瘤抗原之间的相互作用特性如何调控T细胞功能；这些方法包括蛋白质表达与纯化、X射线晶体学、生物物理学分析以及功能性T细胞实验。

利用X射线晶体学、生物物理学与功能检测确定T细胞受体识别肿瘤抗原的调控机制

人类CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）在肿瘤控制中发挥着重要作用。为了实现这一功能，该细胞……

本实验的总体目标是获得高质量的可溶性重组T细胞受体及肽段-HLA蛋白，以用于生物物理和结构分析。该方法有助于回答T细胞免疫学领域中的一些问题，例如，为何T细胞对癌症的反应不够强烈？该技术的主要优势在于，能够获得极高分辨率的机制性数据，阐明T细胞受体如何识别其靶标，从而引发T细胞介导的免疫反应。该技术的应用前景广泛，几乎涵盖所有人类疾病的治疗或诊断，因为T细胞在大多数免疫反应中发挥着关键作用。尽管该方法可用于研究T细胞免疫反应，也可推广应用于其他由受体-配体相互作用调控的生物系统。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为要获得足够高质量、可溶且具有活性的蛋白质以用于生物物理和结构实验非常具有挑战性。开始进行多肽-HLA 复性操作时，向六毫升含 10 毫摩尔二硫苏糖醇的盐酸胍缓冲液中加入 30 毫克 HLA-A2 包涵体、30 毫克 β2-微球蛋白包涵体以及 4 毫克目标多肽。将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。然后，用一升预冷至4°C的HLA复性缓冲液稀释该混合物，并在该温度下搅拌三小时。将混合物在10毫摩尔Tris（pH 8.1）溶液中透析两次，每次20升，各持续24小时。开始TCR复性步骤时，向6毫升含10毫摩尔二硫苏糖醇的胍缓冲液中，分别加入30毫克TCR α链和β链包涵体。将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，并用一升预冷的 TCR 复性缓冲液稀释该混合物。以与多肽 HLA 混合物相同的方式搅拌并透析稀释后的 TCR 复性混合物。将两种透析后的复性混合物均通过 0.45 微米膜滤器过滤。接下来，将一种经过过滤复性处理的样品上样至一个7.9毫升、50微米的阴离子交换树脂柱，该柱已预先用20毫升10毫摩尔Tris缓冲液（pH 8.1）平衡。以每分钟5毫升的流速，使用盐梯度缓冲系统洗脱蛋白质。收集每管1毫升的洗脱组分，并通过SDS-PAGE分析各组分。合并含有复性蛋白的组分。将蛋白混合物置于截留分子量为10千道尔顿的离心浓缩管中。在4000 × g条件下离心20分钟或直至浓缩至500微升所需的时间，以浓缩该混合物。弃去流穿液。将浓缩的蛋白样品注入2毫升的进样环中，并将其上样至预先用适当洗脱缓冲液平衡的24毫升凝胶过滤层析柱。以0.5毫升/分钟的流速，用一个柱体积的缓冲液洗脱蛋白。收集1 mL的洗脱组分，通过SDS-PAGE分析各组分，并合并含有目标蛋白的组分。配制TCR溶液的10个连续稀释浓度，浓度范围应覆盖已知KD值的10倍以上至10倍以下；若KD未知，则从200 µM的TCR浓度开始。接下来，在25摄氏度下，以10微升/分钟的流速将100毫摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺与400毫摩尔的EDC等体积混合液流经羧甲基化葡聚糖包被的传感器芯片10分钟，以活化芯片表面。然后，在全部四个流通池中加载110微升浓度为200微克/毫升的链霉亲和素和pH 4.5的10毫摩尔乙酸缓冲液，以功能化芯片表面。最后用100微升1摩尔的乙醇胺盐酸盐溶液封闭任何剩余的活性基团。接下来，以每分钟10微升的流速，将浓度约为1微摩尔的肽-HLA溶液在芯片制造商提供的缓冲液中流经芯片表面，直至响应单位数值增加500至600。随后，用1毫摩尔的生物素与制造商提供的缓冲液处理芯片表面60秒以达到饱和。然后，在25摄氏度下，以每分钟30微升的流速依次注入10个梯度稀释的TCR溶液。计算平衡结合常数并进行动力学分析。以这种方式进行一系列 SPR 实验，仅改变注入 TCR 稀释液时的温度。测定每个温度下的平衡结合常数，并计算吉布斯自由能及其他热力学参数。使用非线性回归拟合方法，绘制吉布斯自由能随温度变化的曲线。将肽段-HLA 溶液与结晶缓冲液在10 kDa分子量截断的离心浓缩管中，于3,000 × g条件下离心浓缩至0.2毫摩尔。配制0.1毫摩尔的一比一 TCR 与肽段-HLA 溶液，用于共复合物结晶。使用结晶机器人和筛选试剂盒，在96孔板中采用悬滴法设置结晶实验。每个储液池中加入60微升结晶缓冲液，每滴由200纳升蛋白溶液和200纳升缓冲液组成。在18摄氏度下培养晶体。在24小时、48小时、72小时后以及之后每周，在显微镜下对晶体进行评分。一旦生长出质量足够的单晶，使用与低温剂兼容的环状工具收集单晶，并将晶体储存在液氮中。在100开尔文温度下，通入氮气流进行同步辐射X射线衍射，分析数据并使用适当的软件解析结构。根据已解析的结构计算接触面、表面互补性以及交叉角度。利用这些方法，TCR 和肽段-HLA 分子被表达并重折叠为可溶性形式。肽段-HLA 分子中的肽段为 gp100 抗原。采用表面等离子共振（SPR）技术测定PMEL17 TCR与抗原在不同温度下的结合亲和力。随后利用SPR和等温滴定微量热法共同确定该蛋白质-蛋白质相互作用的热力学参数。PMEL17 TCR与A2-YLE-9V复合物经结晶后，采用同步辐射X射线衍射进行分析。已鉴定出TCR的CDR环以及TCR蛋白所接触的肽段-HLA残基，并研究了这些相互作用的性质。还通过该方法纯化并结晶了含有突变肽段的肽段-HLA分子，以探究可能阻碍与TCR结合的结构差异。第三或第五位残基的突变被发现会显著改变脯氨酸第四位的位置，从而破坏与TCR CDR-3 Alpha环的多个相互作用。在进行该操作时，重要的是仅选择最纯的蛋白质用于后续分析。完成该步骤后，可利用可溶性蛋白质进行其他方法，如肽-HLA四聚体染色，以从患者血液中分离抗原特异性T细胞，用于诊断和进一步分析。该技术问世后，为T细胞免疫学领域的研究人员深入探索T细胞受体（TCR）与肽段-HLA结合机制铺平了道路，推动了针对癌症及其他人类疾病新药的研发。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备高质量的TCR及肽段-HLA蛋白，以开展生物物理和结构分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用X射线晶体学，生物物理学，和功能分析，以确定管理机制T细胞癌抗原的受体识别

铬释放试验是一种检测细胞毒性T细胞活性的常用方法，但存在若干局限性。本文利用抗原特异性的CD8...

通过比较Cr51释放实验与xCELLigence系统确定人HER2/neu特异性CD8 T细胞的最佳细胞毒活性

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

我们描述了一种高通量单细胞检测方法，用于测量T细胞与肿瘤靶细胞共孵育时的细胞毒性。该方法采用高密度的弹性体微孔阵列（每个阵列约10万个亚纳升级微孔），将T细胞与靶细胞以特定比例在空间上进行限定，并结合荧光显微镜技术，实时监测效应细胞与靶细胞的结合以及后续的细胞凋亡过程。...

T细胞的定量高通量单细胞细胞毒性检测方法

本文描述了一种基于流式细胞术的细胞结合实验，主要用作筛选工具，用于鉴定能够抑制荧光标记的CXC趋化因子配体12（CXCL12）与CXC趋化因子受体4（CXCR4）结合的化合物。...

一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物

本文采用基于流式细胞术的检测方法，筛选影响T细胞受体信号传导的化学抑制剂文库，以鉴定抑制剂及其作用靶点。此处描述的方法还可扩展用于高通量筛选。...

T细胞受体信号通路中介分子的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选

我们描述了一种定量实时体外细胞裂解检测系统，用于评估靶向液体和实体肿瘤细胞的嵌合抗原受体T细胞的杀伤效力。该方案可扩展用于评估其他免疫效应细胞以及联合治疗方法。...

一种针对实体瘤及血液系统癌细胞的嵌合抗原受体T细胞实时效价检测方法

本文介绍了一种体外共培养方法，用于反复刺激靶向肿瘤的T细胞，从而实现对T细胞抗肿瘤活性的表型和功能分析。...

体外肿瘤细胞再攻击用于预测性评估嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤功能

本实验方案的目的是展示如何利用晶格光片显微镜对活细胞中表面受体的动力学过程进行四维可视化观察。此处展示的是CD4+原代T细胞上的T细胞受体。...

使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

本文介绍了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中研究抗体体内定位的实验方案。...

分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤及组织中的分布

本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内...

动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

本文介绍一种使用正电子发射断层扫描（PET）放射性同位素对细胞进行放射性标记的实验方案。 89Zr (t1/2 78.4 小时），使用即用型放射性标记合成子 [89Zr]Zr-p-异硫氰酸苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN）。使用 [89Zr]Zr-DBN...

细胞追踪的正电子发射断层成像：细胞放射性标记方法

了解利用X射线晶体学和表面等离子体共振技术分析T细胞受体与肿瘤抗原相互作用的方法。该技术可生成可溶性TCR和肽HLA蛋白，用于研究T细胞免疫应答机制，为癌症免疫治疗提供高分辨率结构数据和热力学参数。

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