通过瞬时转染293T细胞生产复制缺陷型逆转录病毒

我们位于塔夫茨大学新英格兰医学中心的分子肿瘤学研究所。我叫Christina Lesco，是Rick Van博士实验室的一名博士后研究员。我们实验室致力于研究人类免疫母细胞性白血病、慢性髓性白血病（CML）以及类似CML的疾病。

我们将这种人类疾病建模于小鼠中，实现方法是通过逆转录病毒载体导入人类癌基因。因此，为了将该人类癌基因导入小鼠细胞，首先要制备病毒本身。下一步则是实际浓缩病毒。

这是我培养的 293T 细胞。我需要用 PBS 洗去培养基，293T 细胞是贴壁细胞，但贴附性不强，因此每一步操作都必须非常轻柔。洗去培养基后，我们将用胰蛋白酶替代 PBS。

为了使细胞从培养板上脱离，我们需要将培养板放回培养箱中约三分钟。因此，经过两到三分钟后，细胞实际上已处于悬浮状态。接下来我们将加入几毫升的常规培养基。

这将中和胰蛋白酶。此时，我们反复吹打以确保所有细胞充分重悬，然后将细胞悬液转移至50 ml离心管中，在存在台盼蓝的情况下用血细胞计数板手动计数细胞。现在我按照计算结果进行稀释，随后将每块培养板接种三百万个细胞。

在 4 ml 培养基中，我们需确保细胞已充分接种，并将培养板放回培养箱中孵育 16 至 18 小时，通常至第二天早晨。因此，目前处于感染 GFP 病毒后 48 小时。使用氯喹的目的是增强细胞对后续转染 DNA 的摄取能力。

我们轻轻吸去细胞培养液，此时细胞已轻柔地贴附在培养板的侧壁上。接下来，我们将把培养板重新放回培养箱中，孵育约一小时。在此期间，我们将准备用于转染的DNA混合物：其中一种DNA含有新霉素抗性基因，另一种则表达GFPI，同时我将使用XI DNA作为对照，以监控整个转染过程。

最后，我们加入氯化钙。使用氯化钙可显著提高转染效率。现在已过一小时，我们取出了含氯喹培养基的培养板，接下来将加入转染溶液。

最后一步是，在加入 H2XHBS 溶液的同时，实际加入 1 ml 的 2× 无菌 HBS。我们需要在加入过程中同时涡旋离心管，并且要缓慢地逐滴加入，以避免产生沉淀。随后立即以逐滴方式将 1 ml 溶液分配至目标培养板中，同样需缓慢进行。

此时，293T 细胞已非常敏感。由于培养基中含有氯喹，我们需要确保所有区域均被覆盖，并尽量减少对培养板的移动。用你所加入的载体名称标记培养板，并对下一个载体重复上述操作。

此时，将培养板放回培养箱中孵育 7 至 11 小时。孵育时间至少 7 小时，但不得超过 11 小时，因为细胞因氯喹处理而变得非常敏感，此后我们需要更换培养基。目前距离转染已过去约 30 小时。

这是目前最后一次换液，293 C3T 细胞已达到汇合状态。再次强调，将新培养基加入培养板侧边时必须非常轻柔。我正在使用带有针头的 10 ml 注射器。

我将用滤器替换针头，此时充分混匀培养基。至此，我们已收集好病毒，可将其置于-80摄氏度保存，待使用时取出。第一步是实际浓缩病毒。制备病毒过程中有多个关键步骤，其中第一个关键点是293T细胞的合适浓度。

我们将每孔接种 3×10⁶ 个细胞，因为 18 小时后细胞汇合度约为 80%。这仍能保证细胞有足够时间继续生长，因此转染后 24 小时细胞将达到 100% 汇合度。已有研究表明，这对于获得高滴度的病毒至关重要。

下一步是使用氯喹，而使用氯喹实际上会使293细胞致敏，因此所有换液操作都必须非常轻柔，以防止整层293T细胞从培养板上脱落。最后，用于制备病毒的DNA必须极为纯净。我们使用的是氯化铯梯度离心法纯化的DNA。

获得病毒后，我们将病毒保存在零下80摄氏度。通常每次传代会使病毒滴度降低两倍。因此，我们倾向于在测定病毒实际滴度之前，先将制备的病毒进行冻存并传代处理。

根据病毒类型的不同，我们可以在病毒中加入GFP表达以追踪实际感染的细胞，或者加入新霉素抗性。在使用病毒前，准确测定其滴度非常重要，以便能够在不同实验或不同突变体之间进行比较。