Name: 瞬时转染293T细胞复制缺陷型逆转录病毒生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学习使用293T细胞瞬时转染技术制备复制缺陷型逆转录病毒，用于将人源癌基因导入小鼠细胞并诱导骨髓增殖性疾病模型。该方法为研究人类白血病机制提供了可靠的体内实验手段。

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<ol>
<li>转化前一天晚上，将293T细胞以3-5×10⁵个细胞/皿的密度接种于培养皿中。6 细胞/6 cm 组织培养板 注意：我们使用293T细胞，因为其转染操作简便，并且作为病毒生产细胞具有高效性。这些细胞在缺乏辅助质粒的情况下，无法有效包装病毒。 </li>
<li>第一天早晨，轻柔吸除培养基，更换为含25 mM氯喹的4 ml 293T细胞培养基，放入培养箱孵育1小时。 注意：培养板应达到约80%汇合度。 </li>
<li>同时，每次在5 ml离心管中为2块培养板制备病毒制备混合液：<ol>
<li>2 x 10 mg 逆转录病毒质粒构建体</li>
<li>2 x 5 mg 包装结构（EcoPak） </li>
<li>2 × 62 ml CaCl</li>
<li>用无菌 ddH₂O 定容至 1 ml2O 注意：逆转录病毒质粒编码目的癌基因和标记基因，EcoPak 编码 gag-pol-env。与 293T 细胞共同作用时，将产生一种特异性感染小鼠细胞的嗜鼠逆转录病毒（RV），但不能感染人类细胞。氯喹和 CaCl₂2 已被证明可提高转染效率。 </li>
</ol></li>
<li>向混合物中逐滴加入1 ml 2x无菌HBS，同时轻轻涡旋振荡试管。</li>
<li>立即向2个培养皿中分别加入1 ml该溶液，轻轻逐滴加入。 </li>
<li>放入培养箱孵育7至11小时。</li>
<li>傍晚（7至11小时后），轻柔地吸出培养基，并非常轻柔地更换为5 ml新鲜的293T培养基。放入培养箱中，至次日中午。 注意：此步骤非常重要，因为需要去除细胞中的氯喹。如果长时间保留，氯喹具有毒性。由于转染混合物形成极细微的粉尘状沉淀，培养板中的溶液看起来有些浑浊。 注意：由于细胞已被氯喹致敏，容易从培养板上脱落，因此更换培养基时务必格外轻柔。 </li>
<li>次日，在收集病毒前18至24小时（约中午时分），轻柔吸除培养基，非常轻柔地更换为3 ml新鲜的293T培养基，放回培养箱中过夜培养。</li>
<li>第三天早晨（18至24小时后），使用配有18号针头的10 ml注射器轻轻吸出培养板中的培养基。此上清液含有逆转录病毒。</li>
<li>更换针头为45 mm注射器滤器，倒置注射器数次以充分混匀溶液，将上清液通过滤器过滤，分装至冻存管中 注意：或者，如果你正在制备3个或以上的病毒板，将相同病毒的所有上清液收集到一个50 ml 圆底管中。充分混匀，然后通过过滤将含有逆转录病毒的上清液分装至冻存管中。 </li>
<li>含有病毒上清液的管子保存在 -80°C 冰箱中，直至使用。</li>
</ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

确保优质病毒储备液成功的四个关键点：    
<ol>
<li>293T 生产细胞必须非常健康，即需定期传代，从未过度生长，并以每 6 cm 组织培养皿 350 万至 500 万个细胞的优化密度接种，使其在转染当天早晨达到培养皿 80% 的密度。&nbsp; </li>
<li>添加氯喹可通过稳定细胞溶酶体并增加到达细胞核的 DNA 比例，使转染效率和后续病毒滴度提高约 3 至 5 倍。也可使用丁酸钠（另一种溶酶体稳定剂）达到此目的。氯喹可以省略，此时转染后 7 至 11 小时无需更换培养基。 </li>
<li>DNA 质量至关重要。载体和包装质粒 DNA 的最佳纯化方法是经氯化铯-溴化乙锭梯度密度离心法纯化两次。我们希望 DNA 浓度至少达到 1 mg/ml，OD 260/280 比值应在 1.75–1.90 之间。Qiagen 纯化的 DNA 也可使用，但在作者的操作中，效果略差。需注意 DNA 溶液的总体积应较小（&lt; 每最终毫升总体积 50 µl），以避免 Tris 和 EDTA（TE 缓冲液）对磷酸钙沉淀产生不利影响。 </li>
<li>逆转录病毒载体的选择以及包装结...

<table><tbody><tr><td>293T 细胞</td><td>细胞系</td><td></td><td></td><td>每 3 天以 1:3 至 1:4 的比例传代一次，否则细胞在重新接种时容易发生聚团，转染效率也会降低。</td></tr><tr><td>293T 细胞培养基</td><td></td><td></td><td></td><td>DMEM/高糖 + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 1% L-谷氨酰胺（1% 非必需氨基酸，可选）。我们的组织培养试剂购自 CellGro。</td></tr><tr><td>编码 DNA 质粒</td><td></td><td></td><td></td><td>经 CsCl 两次纯化。使用 MSCV 骨架，编码目的癌基因及筛选标记（如 Neo、GFP 等）。</td></tr><tr><td>EcoPak</td><td></td><td></td><td></td><td>又称 pMCV-Ecopac：嗜同性包装质粒，编码 gag-pol-env。</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td></td><td>配制 500 ml：8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4（无水；若为七水合物则为 201.1 mg）+ 1.0 g 右旋糖（D-葡萄糖）+ 5.0 g HEPES 粉末。溶于 450 ml 去离子水（milli-Q 水），用 NaOH 调节 pH 至 7.05，再加去离子水定容至 500 ml。经 0.45 &amp;#x03BC; 滤膜无菌过滤。室温保存，瓶盖需拧紧。</td></tr><tr><td>2M CaCl2</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milliQ H2O</td><td></td><td></td><td></td><td>经无菌过滤</td></tr><tr><td>氯喹</td><td></td><td></td><td></td><td>1000 倍储存液为 25 mM，溶于不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS 中，-20°C 保存。使用时新鲜加入培养基。</td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td></td><td></td><td></td><td>用于组织培养</td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td></td><td>用于组织培养。设定为 37°C、10% CO₂。</td></tr><tr><td>10 cc 无菌注射器</td><td></td><td></td><td></td><td>无菌。每种病毒各用一支。</td></tr><tr><td>18G 针头</td><td></td><td></td><td></td><td>一次性使用，每种病毒各用一支。</td></tr><tr><td>45 μm 注射器滤器</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 塑料离心管</td><td></td><td></td><td></td><td>无菌，用于混合转染溶液，每次最多处理 2 个培养皿（2 ml）。我们使用 Falcon 管。</td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td></td><td></td><td></td><td>2 ml 和 4 ml，用于分装病毒。</td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p&gt;转染所用的所有试剂必须经无菌过滤（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、2x HBS、milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O），并保持无菌状态。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

通过瞬时转染293t细胞生产复制缺陷型逆转录病毒

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

我们的实验室研究由癌基因（如 Bcr-Abl 或生长因子受体来源的癌基因 ZNF198-FGFR1、Bcr-PDGFRα 等）诱导的人类骨髓增殖性疾病。通过将先前感染了表达特定癌基因的逆转录病毒的小鼠骨髓细胞移植到小鼠模型中，我们能够在小鼠体内模拟并研究类似人类的疾病。通过瞬时转染 293T 细胞（一种由腺病毒 E1A 基因产物转化的人肾上皮细胞系）的方案，可产生携带人类癌基因及标记基因（如 GFP、RFP 或抗生素抗性基因等）的复制缺陷型逆转录病毒。293 细胞具有一种独特的高转染特性，可通过磷酸钙（CaPO4）法实现高达 50–80% 的转染效率。在此过程中，我们将表达目标癌基因的逆转录病毒载体与表达 gag-pol-env 包装功能的质粒（例如单基因组包装构建体 kat 或 pCL，本实验中使用 EcoPak 质粒）共同转染至 293 细胞中。初始转染效率可通过添加氯喹进一步提高。转染后 48 小时收集的培养上清液即为嗜鼠病毒原液，可储存于 -80°C，用于细胞系的转化和体外研究，或用于感染小鼠骨髓等原代细胞，随后将这些细胞用于小鼠模型的移植实验。

该技术展示了一种高效制备编码人癌基因的复制缺陷型逆转录病毒储备液的方法，并可用于在小鼠模型中诱导骨髓增殖性疾病。

通过瞬时转染293T细胞生产复制缺陷型逆转录病毒

我们的实验室研究由Bcr-Abl或生长因子受体来源的癌基因（如ZNF198-FGFR1等）诱导的人类骨髓增殖性疾病。

我们位于塔夫茨大学新英格兰医学中心的分子肿瘤学研究所。我叫Christina Lesco，是Rick Van博士实验室的一名博士后研究员。我们实验室致力于研究人类免疫母细胞性白血病、慢性髓性白血病（CML）以及类似CML的疾病。我们将这种人类疾病建模于小鼠中，实现方法是通过逆转录病毒载体导入人类癌基因。因此，为了将该人类癌基因导入小鼠细胞，首先要制备病毒本身。下一步则是实际浓缩病毒。这是我培养的 293T 细胞。我需要用 PBS 洗去培养基，293T 细胞是贴壁细胞，但贴附性不强，因此每一步操作都必须非常轻柔。洗去培养基后，我们将用胰蛋白酶替代 PBS。为了使细胞从培养板上脱离，我们需要将培养板放回培养箱中约三分钟。因此，经过两到三分钟后，细胞实际上已处于悬浮状态。接下来我们将加入几毫升的常规培养基。这将中和胰蛋白酶。此时，我们反复吹打以确保所有细胞充分重悬，然后将细胞悬液转移至50 ml离心管中，在存在台盼蓝的情况下用血细胞计数板手动计数细胞。现在我按照计算结果进行稀释，随后将每块培养板接种三百万个细胞。在 4 ml 培养基中，我们需确保细胞已充分接种，并将培养板放回培养箱中孵育 16 至 18 小时，通常至第二天早晨。因此，目前处于感染 GFP 病毒后 48 小时。使用氯喹的目的是增强细胞对后续转染 DNA 的摄取能力。我们轻轻吸去细胞培养液，此时细胞已轻柔地贴附在培养板的侧壁上。接下来，我们将把培养板重新放回培养箱中，孵育约一小时。在此期间，我们将准备用于转染的DNA混合物：其中一种DNA含有新霉素抗性基因，另一种则表达GFPI，同时我将使用XI DNA作为对照，以监控整个转染过程。最后，我们加入氯化钙。使用氯化钙可显著提高转染效率。现在已过一小时，我们取出了含氯喹培养基的培养板，接下来将加入转染溶液。最后一步是，在加入 H2XHBS 溶液的同时，实际加入 1 ml 的 2× 无菌 HBS。我们需要在加入过程中同时涡旋离心管，并且要缓慢地逐滴加入，以避免产生沉淀。随后立即以逐滴方式将 1 ml 溶液分配至目标培养板中，同样需缓慢进行。此时，293T 细胞已非常敏感。由于培养基中含有氯喹，我们需要确保所有区域均被覆盖，并尽量减少对培养板的移动。用你所加入的载体名称标记培养板，并对下一个载体重复上述操作。此时，将培养板放回培养箱中孵育 7 至 11 小时。孵育时间至少 7 小时，但不得超过 11 小时，因为细胞因氯喹处理而变得非常敏感，此后我们需要更换培养基。目前距离转染已过去约 30 小时。这是目前最后一次换液，293 C3T 细胞已达到汇合状态。再次强调，将新培养基加入培养板侧边时必须非常轻柔。我正在使用带有针头的 10 ml 注射器。我将用滤器替换针头，此时充分混匀培养基。至此，我们已收集好病毒，可将其置于-80摄氏度保存，待使用时取出。第一步是实际浓缩病毒。制备病毒过程中有多个关键步骤，其中第一个关键点是293T细胞的合适浓度。我们将每孔接种 3×10⁶ 个细胞，因为 18 小时后细胞汇合度约为 80%。这仍能保证细胞有足够时间继续生长，因此转染后 24 小时细胞将达到 100% 汇合度。已有研究表明，这对于获得高滴度的病毒至关重要。下一步是使用氯喹，而使用氯喹实际上会使293细胞致敏，因此所有换液操作都必须非常轻柔，以防止整层293T细胞从培养板上脱落。最后，用于制备病毒的DNA必须极为纯净。我们使用的是氯化铯梯度离心法纯化的DNA。获得病毒后，我们将病毒保存在零下80摄氏度。通常每次传代会使病毒滴度降低两倍。因此，我们倾向于在测定病毒实际滴度之前，先将制备的病毒进行冻存并传代处理。根据病毒类型的不同，我们可以在病毒中加入GFP表达以追踪实际感染的细胞，或者加入新霉素抗性。在使用病毒前，准确测定其滴度非常重要，以便能够在不同实验或不同突变体之间进行比较。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

瞬时转染293T细胞复制缺陷型逆转录病毒生产

制备慢病毒时，将DNA载体转染至人293细胞中。收集并浓缩上清液后，通过流式细胞仪检测荧光表达来测定病毒滴度。...

慢病毒生产

慢病毒是研究基因功能的重要研究工具；然而，研究人员可能希望避免产生编码已知或疑似癌基因的泛嗜性慢病毒。作为替代方案，我们提出了一种更安全的策略，即在经过改造以表达嗜鼠性病毒受体 mSlc7a1...

利用聚合物复合的嗜生态慢病毒转导人细胞以增强生物安全性

在此方案中，我们描述了慢病毒载体的制备、纯化及滴定方法。我们以原代培养的神经元和星形胶质细胞中慢病毒载体介导的基因递送为例进行了说明。本方法也可适用于其他细胞类型 体外 和 体内.

用于转导中枢神经系统细胞的慢病毒载体的制备

RNA干扰（RNAi）相较于基因敲除具有多种优势，已被广泛用作基因功能研究的工具。基于DNA载体的RNAi技术的发明使得长期且可诱导的基因沉默成为可能，同时也提高了基因沉默的可行性。 体内.

基于DNA载体的RNA干扰技术用于研究癌症中的基因功能

本实验利用逆转录病毒转导和串联转染技术，构建一种可在无四环素条件下表达慢病毒载体（LV）各组分的细胞系。该慢病毒载体编码绿色荧光蛋白（GFP），并假型化携带一种糖蛋白SVGmu，后者特异性识别树突状细胞表面的受体。...

一种受四环素调控的细胞系可产生高滴度慢病毒载体，特异性靶向树突状细胞

CRISPR/Cas9 系统有望使靶向基因组编辑技术在科学界变得易于获取且成本低廉。本实验方案旨在演示如何利用 CRISPR/Cas9...

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。...

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文介绍了一种通过在十天内过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和...

小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞的实验方案

我们概述了一项为期9天的实验方案，用于转导并扩增恒河猴外周血单个核细胞，可获得数量充足、目的基因共表达效果优良的细胞，适用于细胞疗效输注研究。...

九天内实现原代T细胞的转导与扩增并维持中央记忆表型

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

学习使用293T细胞瞬时转染技术制备复制缺陷型逆转录病毒，用于将人源癌基因导入小鼠细胞并诱导骨髓增殖性疾病模型。该方法为研究人类白血病机制提供了可靠的体内实验手段。

通过瞬时转染293T细胞生产复制缺陷型逆转录病毒

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