一种高效分离高纯度种子RNA用于定量转录组分析的方法

本实验的总体目标是从植物种子中提取高纯度的RNA。该方法有助于解答谷物生物学领域的关键问题，例如了解种子中原始转录本的基因表达谱。该技术的主要优势在于，研究人员能够在基于离心柱法的基础上稍加改进，即可制备出高纯度的RNA。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为前筛中富含大量油脂、蛋白质、碳水化合物和多酚，使得难以分离出高纯度的RNA；本实验操作将由本实验室的技术员Kazumi Hikino进行演示。实验开始时，在RNA提取用的细胞裂解缓冲液中加入1%（重量/体积）分子生物学级别的PVP，并剧烈涡旋混匀。将PVP在25°C下孵育20分钟，以确保其完全溶解。

孵育20分钟后，通过轻轻翻转离心管使其倒置来混匀缓冲液，以防止气泡产生。从拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株上采集果实，并将其放入置于冰上的两个1.5毫米聚丙烯管中，随后将果实置于保持在4摄氏度的铝板上，在体视显微镜下分离种子。接着，将约200粒分离的种子放入预先放置于冰上铝架中的1.5毫升聚丙烯管中，并立即将这些管子浸入液氮中。

从液氮中取出离心管，并将其放回置于冰上的铝制架子中。向每根离心管中加入100微升1% PVP缓冲液，在4°C条件下以1000 × g离心1分钟。离心结束后，将离心管保持在冰上的铝制架子中，使用不锈钢研杵连接电动研磨器匀浆60秒；随后，加入550微升100% PVP缓冲液，轻轻将离心管颠倒数次以混匀，并进行孵育。

孵育后，将溶液离心，然后取550 µL上清液转移至新的1.5 mL聚丙烯管中，并对上清液进行离心。再将450 µL上清液转移至另一新的1.5 mL聚丙烯管中。使用商品化试剂盒，以上清液作为细胞裂解物进行RNA提取。

在冰上准备一个铝制试管架，轻轻敲击使总RNA混合物解冻，然后将离心管置于试管架上。使用微量分光光度计测定RNA浓度。随后用无RN酶的水稀释总RNA。

将商品化试剂盒中的总RNA和缓冲液体系解冻，轻轻振荡后将试剂盒中的酶置于冰上。准备无菌、无核酸酶的0.2毫升聚丙烯管，用于后续分析。在冰上，于0.2毫升聚丙烯管中加入5 µL总RNA、1 µL（50 µM）寡聚dT引物和1 µL（50 µM）随机六聚体引物。

将混合物在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，然后将试管置于冰上。调整标准曲线用 DNA 模板的质粒浓度。接着，用蒸馏水将 cDNA 溶液按 1 比 100 稀释，然后取 2 µL 稀释后的 cDNA 溶液以及先前制备的标准曲线用质粒，加入到定量实时 PCR 试剂盒的预混液中。

最后，设置实时PCR并插入样品。使用不同浓度的细胞裂解缓冲液PVP，从约1,000粒种子中分离总RNA。分离得到的RNA的数量和纯度结果表明，1.0% PVP是从小麦种子中提取大量高纯度RNA的最有效浓度。

从200粒种子中分离的RNA的浓度、A260与A280比值以及A260与A230比值表明，该方法在开花后8天和12天（DAF）的种子中能够最有效地分离出高纯度的RNA。尽管在发育中的种子中，wrinkled one和sugar-dependent one转录本的含量相对较低，但通过实时PCR仍可检测到不同发育阶段种子之间的表达变化；该方法也适用于其他油料种子，如本表所示。该技术建立后，为植物生物学领域的研究人员探索富含储存物质（如种子和果实）中的基因表达谱提供了重要途径。