Name: 对于高度纯化RNA的种子定量转录组分析的隔离中使用的有效方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 了解从植物种子中提取高纯度RNA的有效方法，该方法通过改良离心柱技术克服油脂、蛋白质和多酚的抑制。此技术适用于谷物生物学研究，可实现低转录水平种子中的基因表达分析。

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感谢日本基础生物学研究所核心研究设施的功能基因组学设施、&#160;光谱与生物成像设施，以及日本基础生物学研究所生物资源中心模式植物研究设施的工作人员。

1. 从植物种子中提取总RNA
<ol>
	<li>准备缓冲液组、离心柱、1.5 mL 和 2.0 mL 聚丙烯管，以及无核酸酶的 1.5 mL 聚丙烯管。</li>
	<li>向用于 RNA 提取的细胞裂解缓冲液中加入 1%（w/v）分子生物学级聚乙烯吡咯烷酮（后文简称 PVP），并充分涡旋振荡。在 25 °C 下孵育 20 分钟以完全溶解。孵育 20 分钟后，通过轻轻翻转离心管的方式混匀缓冲液，避免产生气泡。使用前于室温（15–25 °C）保存。</li>
	<li>从 Arabidopsis thaliana 植株上采集果实，并置于冰上的 1.5 mL 聚丙烯管中。将果实放置于保持在 4 °C 的铝板上，在体视显微镜下分离种子。
	<ol>
		<li>将分离得到的种子（约 200 粒）放入预先储存在冰上铝制架中的 1.5 mL 聚丙烯管中，并立即将管子浸入液氮中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从液氮中取出管子，放回冰上的铝架中。加入 100 µL 含 1% PVP 的缓冲液，在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>将管子保持在冰上的铝架中，使用不锈钢研杵配合电动研磨器匀浆样品 60 秒。</li>
	<li>加入 550 µL 含 1% PVP 的缓冲液，通过轻轻翻转离心管的方式轻柔混匀，并在 25 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>在 25 °C 下以 8,000 × g 离心 5 分钟，将 550 µL 上清液转移至新的 1.5 mL 聚丙烯管中。</li>
	<li>在 25 °C 下以 10,000 × g 离心 5 分钟，将 450 µL 上清液转移至新的 1.5 mL 聚丙烯管中。</li>
	<li>将所得上清液作为细胞裂解物用于 RNA 提取。此后步骤请依照市售试剂盒说明书中的操作流程进行。</li>
	<li>使用最小体积的洗脱缓冲液洗脱 RNA，以确保 RNA 浓度足够高，便于检测低丰度转录本的表达模式。将提取的 RNA 储存于超低温冰箱中，直至使用。</li>
</ol>
2. RNA 质量的验证
<ol>
	<li>解冻总RNA，轻轻弹击管壁混匀，并将离心管置于冰上的铝制管架中。</li>
	<li>使用微量分光光度计测定RNA浓度、A260/A280比值和A260/A230比值。</li>
	<li>用无RNase的水将总RNA稀释至终浓度为70 ng/µL。</li>
</ol>
3. 种子总RNA的反转录
<ol>
	<li>从商业试剂盒中取出总RNA和缓冲液组分并解冻。轻轻弹击后，将试剂盒中的酶置于冰上。准备无核酸酶的0.2 mL聚丙烯管。</li>
	<li>在冰上的0.2 mL聚丙烯管中加入5 µL总RNA、1 µL Oligo dT引物（50 µM）和1 µL随机六聚体引物（Random 6-mer，50 µM）。</li>
	<li>在37 °C孵育15分钟，然后置于冰上。</li>
	<li>此后，按照逆转录-PCR试剂盒制造商说明书所述步骤进行操作。</li>
	<li>逆转录产物在使用前应置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 定量实时荧光PCR分析
<ol>
	<li>根据制造商的说明书构建含有目标基因序列的质粒。</li>
	<li>将DNA模板的浓度调整为100–500,000 拷贝/µL，用于标准曲线。</li>
	<li>用蒸馏水将cDNA溶液稀释100倍（1:100）。</li>
	<li>取2 µL稀释后的cDNA溶液以及用于标准曲线的质粒，加入至定量实时PCR试剂盒的预混液中。</li>
	<li>按照以下扩增程序设置实时PCR反应：95 °C 预变性30秒，随后进行40个循环，每个循环为95 °C 变性5秒，60 °C 退火延伸35秒。</li>
	<li>根据实时PCR系统的制造商说明书分析拷贝数。</li>
</ol>

<ol><li>Hills, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+storage-product+synthesis+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of storage-product synthesis in seeds.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Acyl-lipid metabolism.</a> Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).</li>
<li>Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+pathways+in+seed+oil+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical pathways in seed oil synthesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).</li>
<li>Santos-Mendoza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+gene+regulatory+networks+that+control+seed+development+and+maturation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis.</a> Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).</li>
<li>Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+triacylglycerols+as+feedstocks+for+the+production+of+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plastidic+DEAD-box+RNA+helicase+22%2C+HS3%2C+is+essential+for+plastid+functions+both+in+seed+development+and+in+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth.</a> Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+oil+biosynthesis+during+the+mid-phase+of+seed+development+enhances+oil+content+in+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds.</a> Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).</li>
<li>Dekkers, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+reference+genes+for+RT-qPCR+expression+analysis+in+Arabidopsis+and+tomato+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds.</a> Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).</li>
<li>Salzman, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).</li>
<li>Vicient, C. M., Delseny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+total+RNA+from+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds.</a> Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).</li>
<li>Wang, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high+quality+RNA+from+cereal+seeds+containing+high+levels+of+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch.</a> Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).</li>
<li>Birtic, S., Kranner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+polyphenol-%2C+polysaccharide-+and+lipid-rich+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds.</a> Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基因表达谱有助于我们理解植物生理学；因此，针对不同样品条件已开发出特定的RNA分离方法9-12。我们研究了从种子中提取RNA过程中受抑制的环节，发现RNA与硅胶膜的结合受到严重抑制。大量油脂、蛋白质和多酚类物质会抑制RNA的提取。我们对RNA提取流程进行了改进，在RNA与硅胶膜结合之前，使用裂解液去除这些干扰化合物。关键改进包括添加1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（步骤1.2）以及收集离心后裂解液的上清液（步骤1.7、1.8）。添加1% PVP的目的是去除多酚类物质。我们测试了不同浓度PVP的效果，确认1% PVP是该流程中最有效的浓度。收集离心后裂解液上清液的目的是去除油脂和蛋白质。收集上清液时应小心操作，避免将油层混入上清液或使沉淀物残留在上清液中。这两项简单的改进显著提高了发育中期和晚期种子中RNA的回收率，以及A260/A280比值和A260/A230比值（表1）。
我们的方法对标准实验流程进行了简单改进，采用市售试剂盒进行RNA提取。因此，该方法在无需苯酚-氯仿抽提和氯化锂乙醇沉淀等繁琐附加步骤的情况下，即可从种子中有效...

植物产生种子，种子萌发后形成下一代植株。种子在发育过程中积累大量贮藏物质，如油脂、碳水化合物和蛋白质，以支持萌发后的生长。人类利用种子中的贮藏物质作为食物和动物饲料的来源，因此植物种子是全球可食用有机物的主要供应来源之一。提高种子产量是植物科学领域面临的重要挑战。
由于种子储存物质是具有商业价值的食物和工业材料来源，其储存物质代谢调控的分子机制已被广泛研究1-6。进一步阐明这些机制将有助于提高作物的种子产量。种子在植物受精后的子房中发育，并经历一系列发育阶段而成熟1,6,7。要深入理解种子发育的分子机制，需要获得一系列发育中种子的详细且精确的基因表达谱。然而，植物种子中含有大量油脂、蛋白质、碳水化合物和多酚类物质，这使得难以提取高纯度的RNA，从而阻碍了基因表达的精确分析。
本文介绍一种从富含油脂、蛋白质和多酚的油料种子中高效分离RNA的方法。利用该方法，研究人员能够制备高纯度的RNA。此类RNA可用于监测发育期和成熟期油料种子中调控种子贮藏物质代谢的关键基因的转录变化。

<table><tbody><tr><td>RNeasy 植物小型试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288-100G</td><td></td></tr><tr><td>HOMOGENIZER S-303</td><td>AS ONE</td><td>1-1133-02</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-NDL-US-CAN</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT 试剂盒（完美实时）</td><td>TAKARA</td><td>RR037A</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Fast qPCR 试剂盒</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr></tbody></table>

一种高效分离高纯度种子rna用于定量转录组分析的方法

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

植物种子积累大量由可生物降解有机物组成的贮藏物质。人类依赖种子中的贮藏物质作为食物和工业原料。基因表达谱是研究植物细胞代谢调控的有力工具。因此，作物育种需要获得种子发育过程中详细且准确的基因表达谱。获取高纯度RNA对于生成这些表达谱至关重要。目前亟需高效的方法从种子中分离高纯度RNA。本文介绍一种从富含油脂、蛋白质和多酚类物质的种子中提取RNA的方法，这些成分通常会抑制高纯度RNA的提取。本方法无需使用苯酚、氯仿或额外的RNA纯化步骤，即可获得高纯度RNA。该方法适用于拟南芥、油菜和大豆种子。本方法将有助于监测发育期和成熟种子中低丰度转录本的表达模式。

我们首先利用PVP研究了其最佳浓度 拟南芥 成熟种子。根据上述方案，使用含有0%、0.25%、0.5%、1.0%或2.0% PVP的细胞裂解缓冲液，从约1,000粒种子中提取总RNA。匀浆并离心后，收集上清液，避免接触油层和种子残渣。图1A).
<img alt="油脂提取过程；含有油层的试管、种子残渣；吸收光谱图；分析。" src="/files/ftp_upload/55008/55008fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 细胞裂解缓冲液中聚乙烯吡咯烷酮（PVP）最佳浓度的估算。 使用含有不同PVP浓度的细胞裂解缓冲液提取总RNA。(A) 匀浆并离心后种子的照片。(B...

我们已成功建立了一种从富含油脂、蛋白质和多酚的植物种子中分离RNA的方法，这些成分会抑制高纯度RNA的提取。本方法适用于检测种子中低丰度转录本基因的表达。

一种高效分离高纯度种子RNA用于定量转录组分析的方法

植物种子积累大量由可生物降解有机物组成的贮藏物质。人类依赖种子贮藏物质作为食物来源以及……

本实验的总体目标是从植物种子中提取高纯度的RNA。该方法有助于解答谷物生物学领域的关键问题，例如了解种子中原始转录本的基因表达谱。该技术的主要优势在于，研究人员能够在基于离心柱法的基础上稍加改进，即可制备出高纯度的RNA。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为前筛中富含大量油脂、蛋白质、碳水化合物和多酚，使得难以分离出高纯度的RNA；本实验操作将由本实验室的技术员Kazumi Hikino进行演示。实验开始时，在RNA提取用的细胞裂解缓冲液中加入1%（重量/体积）分子生物学级别的PVP，并剧烈涡旋混匀。将PVP在25°C下孵育20分钟，以确保其完全溶解。孵育20分钟后，通过轻轻翻转离心管使其倒置来混匀缓冲液，以防止气泡产生。从拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株上采集果实，并将其放入置于冰上的两个1.5毫米聚丙烯管中，随后将果实置于保持在4摄氏度的铝板上，在体视显微镜下分离种子。接着，将约200粒分离的种子放入预先放置于冰上铝架中的1.5毫升聚丙烯管中，并立即将这些管子浸入液氮中。从液氮中取出离心管，并将其放回置于冰上的铝制架子中。向每根离心管中加入100微升1% PVP缓冲液，在4°C条件下以1000 × g离心1分钟。离心结束后，将离心管保持在冰上的铝制架子中，使用不锈钢研杵连接电动研磨器匀浆60秒；随后，加入550微升100% PVP缓冲液，轻轻将离心管颠倒数次以混匀，并进行孵育。孵育后，将溶液离心，然后取550 µL上清液转移至新的1.5 mL聚丙烯管中，并对上清液进行离心。再将450 µL上清液转移至另一新的1.5 mL聚丙烯管中。使用商品化试剂盒，以上清液作为细胞裂解物进行RNA提取。在冰上准备一个铝制试管架，轻轻敲击使总RNA混合物解冻，然后将离心管置于试管架上。使用微量分光光度计测定RNA浓度。随后用无RN酶的水稀释总RNA。将商品化试剂盒中的总RNA和缓冲液体系解冻，轻轻振荡后将试剂盒中的酶置于冰上。准备无菌、无核酸酶的0.2毫升聚丙烯管，用于后续分析。在冰上，于0.2毫升聚丙烯管中加入5 µL总RNA、1 µL（50 µM）寡聚dT引物和1 µL（50 µM）随机六聚体引物。将混合物在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，然后将试管置于冰上。调整标准曲线用 DNA 模板的质粒浓度。接着，用蒸馏水将 cDNA 溶液按 1 比 100 稀释，然后取 2 µL 稀释后的 cDNA 溶液以及先前制备的标准曲线用质粒，加入到定量实时 PCR 试剂盒的预混液中。最后，设置实时PCR并插入样品。使用不同浓度的细胞裂解缓冲液PVP，从约1,000粒种子中分离总RNA。分离得到的RNA的数量和纯度结果表明，1.0% PVP是从小麦种子中提取大量高纯度RNA的最有效浓度。从200粒种子中分离的RNA的浓度、A260与A280比值以及A260与A230比值表明，该方法在开花后8天和12天（DAF）的种子中能够最有效地分离出高纯度的RNA。尽管在发育中的种子中，wrinkled one和sugar-dependent one转录本的含量相对较低，但通过实时PCR仍可检测到不同发育阶段种子之间的表达变化；该方法也适用于其他油料种子，如本表所示。该技术建立后，为植物生物学领域的研究人员探索富含储存物质（如种子和果实）中的基因表达谱提供了重要途径。

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大豆共生根瘤中多聚核糖体的纯化

我们介绍一种简单且高度可重复的方法，用于从拟南芥植物的叶面和质外体中分离细胞外RNA。...

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