对于高度纯化RNA的种子定量转录组分析的隔离中使用的有效方法

该程序的总体目标是从植物种子中提取高纯度 RNA。这种方法可以帮助回答谷物生物学领域的关键问题，例如了解包含种子中原始转录本的基因图谱。该技术的主要优点是研究人员能够制备高纯度的 RNA，只需对基于离心柱的方法稍作修改即可制备

一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为筛子前含有大量的油、蛋白质、碳水化合物和多酚，这使得分离高度纯化的 RNA 变得困难;演示该程序的是我们实验室的技术人员 Kazumi Hikino。要开始实验，将每体积重量为 1% 的分子生物学级 PVP 添加到细胞裂解缓冲液中用于 RNA 提取，并剧烈涡旋混合物。将 PVP 在 20 摄氏度下孵育 25 分钟以使其完全溶解。

孵育 20 分钟后，将试管倒置，轻轻混合缓冲液，以防止形成气泡。从拟南芥植物中收获果实，并将它们放入冰上的两个 1.5 毫米聚丙烯管中，然后将果实放在保持在 4 摄氏度的铝板上，并在立体显微镜下从果实中分离种子。接下来，将大约 200 颗分离的种子放入 1.5 毫升聚丙烯管中，这些管之前已储存在冰上的铝架中，并立即将管子放入液氮中。

从液氮中取出试管，然后将它们放回冰上的铝架上。向每根试管中加入 100 微升 1% PVP 缓冲液，并在 4 摄氏度下以 1000 倍 G 离心试管 1 分钟。离心后，使用电动研磨机用不锈钢研杵将样品均质化 60 秒，同时将试管放在冰上的铝架中;接下来，加入 550 微升 100% PVP 缓冲液，轻轻将试管倒置以混合和孵育试管。

孵育后，离心溶液，然后将 550 μL 上清液转移到新的 1.5 mm 聚丙烯管中，并离心上清液。将 450 μL 上清液转移到新的 1.5 mm 聚丙烯管中。使用上清液作为细胞裂解物，使用市售试剂盒提取 RNA。

在冰上准备一个铝制架子，轻轻敲击解冻总 RNA 混合物，然后将试管放在架子上。使用超微量分光光度计测量 RNA 浓度。然后在不含 RNase 的水中稀释总 RNA。

解冻市售试剂盒中的总 RNA 和缓冲液组，轻轻敲击后将试剂盒中的酶置于冰上。准备无菌的不含核酸酶的 0.2 mL 聚丙烯管用于后续分析。在冰上，将 5 μL 总 RNA、1 μL 或 50 μmol oligo DT 引物和 1 μL 或 50 μmol 随机 6-mer 混合在 0.2 mL聚丙烯管中。

将混合物在 15 摄氏度下孵育 37 分钟，然后将试管放在冰上。调整标准曲线的 DNA 模板的质粒浓度。接下来，用蒸馏水将 CDNA 溶液稀释 1 至 100，然后将两微升稀释的 CDNA 溶液和先前制备的标准曲线质粒添加到定量实时 PCR 试剂盒的预混液中。

最后，设置实时 PCR 并插入样品。使用不同浓度的细胞裂解缓冲液 PVP 从大约 1， 000 颗种子中分离出总 RNA。分离的 RNA 的数量和纯度表明，1.0% PVP 是从种子中分离大量纯化 RNA 的最有效浓度。

从 200 颗种子中分离的 RNA 的浓度、A260 和 A280 比率以及 A260 A230 比率表明，该方法最擅长从开花后 8 天和 12 天分离高度纯化的 RNA 或 DAF 种子。尽管在发育中的种子中皱 1 和糖依赖性 1 转录本的数量相对较低，但可以通过实时 PCR 检测不同发育阶段种子之间的表达变化;这种方法也适用于其他油籽，如此表所示。经过开发，这项技术为植物生物学领域的研究人员探索高浓度储存储备（如种子和水果）中的基因表达谱铺平了道路。