流量Virometry来分析病毒颗粒的抗原谱和外囊泡

病毒或细胞外囊泡用与识别表面抗原的抗体偶联的 15 nm 磁性纳米颗粒进行免疫捕获。捕获的病毒粒子或囊泡用针对其他表面抗原的荧光抗体标记。在强磁场中分离所得复合物，并使用触发荧光的常规流式细胞仪进行分析。

该程序的总体目标是使用磁性颗粒或 MNP 通过常规流式细胞仪鉴定单个病毒粒子或单个细胞外囊泡表面的多种抗原。这种方法可以帮助我们了解囊泡和病毒在人类疾病中，特别是病毒感染中表型和功能之间关系的性质。该技术的主要优点是它允许分析单个病毒粒子或单个细胞外囊泡，而不是批量分析，在这种分析中，这些颗粒的单个特性会丢失。

这种方法可以深入了解病毒颗粒的正确测试，但如果有合适的抗体，它也可以应用于其他系统。通常，刚接触这种方法的人会很困难，因为在分析之前必须验证和检查所有步骤，包括流式细胞仪的正确设置。首先，将每个条件 60 μL MNP 和 5 μL 标记的 FAB 片段混合在 1.5 mL 微量离心管中，这些片段对目标捕获抗体的同种型具有特异性。

将溶液在室温下孵育 30 分钟，并连续混合。然后用 300 微升 PBS 预润湿 100K 浓缩器，并在微量离心机中旋转浓缩器。离心结束时，在 100K 柱上纯化标记的复合物，然后再次微量离心，将沉淀重悬于 200 μL 新鲜 PBS 中。

为了捕获目标颗粒，将抗体标记的 MNP 与目标颗粒孵育适当的孵育时间和温度。接下来，用适当种类的 IGG 抗体阻断任何非特异性 FC 结合，轻轻涡旋并在室温下孵育颗粒溶液 3 至 5 分钟。然后，将制造商推荐的每种检测抗体浓度添加到颗粒中，或将同型对照抗体添加到同型对照样品中，在室温下再孵育 20 分钟。

为了将 MNP 捕获的颗粒与未结合的抗体分离，首先将磁性分离柱放入分离磁体中，并用 500 μL 洗涤缓冲液预润湿柱。让洗涤缓冲液流经色谱柱，然后将 MNP 颗粒复合物添加到色谱柱中，在废液容器中收集流出液。当所有复杂溶液都通过色谱柱时，用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤色谱柱 3 次。

然后将色谱柱转移到 12 x 75 mm 的试管中。三分钟后，加入 200 μL PBS，让磁珠在重力作用下洗脱。当所有 PBS 都通过色谱柱后，向试管中加入 200 微升新鲜 PBS，并用 200 微升 4% 多聚甲醛固定颗粒。

接下来，将 0.22 微米过滤的 PBS 加载到流式细胞仪上，并在细胞仪上调整 PMT 电压，直到过滤后的 PBS 显示零到极少的事件。然后使用低流量运行 MNP 捕获的颗粒，该过滤器带有 0.04 微米的在线过滤器，用于鞘液，串联放置在标准 0.2 微米鞘液过滤器后面，以进一步消除任何错误事件。通过流式病毒测定法，现在可以观察单个病毒颗粒上的细胞抗原。

例如，在该实验中，观察到 LFA-1 和 HLA-DR 存在 HIV-1 病毒粒子的高异质性，病毒颗粒捕获依赖于复制病毒的细胞。登革热病毒的成熟与病毒粒子上前体膜蛋白的表达有关，这可以通过流式病毒测定法进行区分，如刚才所示。在这个代表性实验中，使用各种荧光 MNP 偶联抗体从血小板贫血浆中捕获细胞外囊泡，以研究急性冠脉综合征患者的不同细胞外病毒亚群。

流式病毒分析确定，虽然与健康供体对照相比，急性冠脉综合征患者的总体细胞外囊泡数量大多增加，但不同细胞外囊泡亚群之间的增加幅度不同。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住在开始分析之前正确设置流式细胞仪。

该技术的发展为病毒学和细胞外生物学领域的研究人员开辟了一条途径，以研究这些颗粒在体外系统以及人类和动物样本的正常和病理过程中的作用。按照此程序，可以执行其他方法（如 PCR 或质谱法）来回答其他问题，例如特定捕获的 EV 或病毒携带哪些蛋白质或 RNA 或 DNA 分子。我希望在观看此视频后，您对如何分析单个病毒粒子或单个细胞外囊泡的抗原组成有很好的了解。