Name: 流量Virometry来分析病毒颗粒的抗原谱和外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学习使用磁性纳米颗粒免疫捕获和常规流式细胞术分析单个病毒颗粒和细胞外囊泡表面抗原谱的方法。该技术可在约两小时内完成高通量单颗粒表型分析，揭示病毒和囊泡异质性。

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AA、SZ、WF、J-C.G 和 LM 的工作得到了 NICHD 院内项目的支持。MV 的工作得到了俄罗斯联邦政府资助项目 #14.B25.31.0016 的支持。

1. 磁性纳米颗粒（MNPs）的偶联
<ol>
	<li>使用商用偶联方法和试剂将磁性纳米颗粒（MNPs）与抗体（Abs）（通常为1 mg）进行偶联。所用的氧化铁纳米颗粒以羧基作为反应基团。
	<ol>
		<li>如果抗体体积超过 0.5 ml，使用 100K 浓缩器进行浓缩。以 2,000 × g 离心 3–5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在步骤结束时，加入10 µl淬灭缓冲液后，将磁性纳米颗粒（MNPs）转移至一支12 mm × 75 mm的试管中，并加入3 ml洗涤/储存缓冲液。将试管置于磁力分离器的中心孔中，在4 °C下静置过夜。</li>
	<li>确认磁性纳米颗粒（MNPs）已全部吸附至管壁一侧后，小心吸出全部液体。加入 3 ml 新鲜洗涤/储存缓冲液，再次置于磁铁上。</li>
	<li>数小时后，检查磁性纳米颗粒是否已聚集至管壁一侧，然后吸除上清液。加入 2 ml 洗涤/储存缓冲液重悬磁性纳米颗粒，并于 4 °C 保存。</li>
	<li>通过使用相应的荧光标记 Fab 抗体片段对抗体进行标记，验证抗体是否已偶联至磁性纳米颗粒（MNPs）例如 若使用小鼠单克隆抗体作为捕获抗体（如第2节所述），则采用抗小鼠山羊抗体，并在流式细胞仪上检测。</li>
</ol>
2. 与磁性纳米颗粒偶联的抗体标记
<ol>
	<li>在1.5 ml微量离心管中，将60 µl（3.9 × 1012 个颗粒）磁性纳米颗粒（每种条件）与5 µl商品化溶液（200 µg/ml）的标记Fab片段混合，该Fab片段针对捕获抗体的同种型。</li>
	<li>室温下持续混匀孵育30分钟。</li>
	<li>用300 µl磷酸盐缓冲液（PBS）预润湿100K浓缩柱，在微量离心机中以1,500 × g离心5分钟。</li>
	<li>在100K柱上纯化标记复合物。将步骤2.2中的混合物在微量离心机中以1,500 × g离心5分钟，用200 µl PBS洗涤，并回收至初始体积。</li>
</ol>
3. 使用标记的抗体-磁性纳米颗粒复合物捕获目标颗粒（病毒或细胞外囊泡）
<ol>
	<li>孵育预先标记的MNPs 60 µl（3.9 x 1012 颗粒）与HIV（60 µl）或EV制备物（100 µl）混合。
	<ol>
		<li>采用不同方法制备细胞外囊泡（EV）。此处可通过蔗糖梯度离心纯化EV，或使用外泌体沉淀试剂从血小板贫乏血浆中收集EV，或直接从血浆中分离EV 8. 
		注意：每次实验所需的最适比例需根据具体实验确定，且取决于制备物中病毒/细胞外囊泡（EV）的浓度。MNP-Ab 组分应约为 106 相较于病毒/细胞外囊泡组分的浓度过量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>37 °C 轻柔混匀孵育 40 分钟（适用于病毒），或 4 °C 孵育 1 小时（适用于细胞外囊泡）。</li>
	<li>加入2.5%小鼠IgG/人IgG以阻断Fc结合，轻轻涡旋混匀，室温孵育3–5分钟。</li>
	<li>加入每种检测抗体的推荐浓度或已滴定浓度，于室温下额外孵育20分钟。</li>
</ol>
4. 使用磁性柱分离MNP捕获的病毒颗粒（或细胞外囊泡）与未结合的抗体
<ol>
	<li>将磁性分离柱置于分离磁铁中，以准备使用。</li>
	<li>用500 µl洗涤缓冲液（含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液）预润湿柱子，使洗涤缓冲液完全流过柱体。</li>
	<li>将MNP-病毒/MNP-EV复合物加入柱中，待所有液体流尽后，再加入500 µl洗涤缓冲液，使其全部通过柱体。</li>
	<li>重复使用洗涤缓冲液洗涤柱子2次。</li>
	<li>将柱子从磁铁上取下，放入12 mm × 75 mm试管中以收集滞留的MNP-病毒/MNP-EV复合物。让柱子在试管中脱离磁铁静置3分钟。加入200 µl PBS，使磁珠在重力作用下流出；再加入200 µl PBS，并在洗脱后用200 µl 4%多聚甲醛固定。 
	注意：多聚甲醛为疑似致癌物，应在通风橱中操作并佩戴手套。</li>
	<li>为定量单个病毒颗粒/细胞外囊泡（EVs），可在高通量进样器（HTS）上使用体积定量模式，或在开始采集前加入充分混匀的流式细胞术计数微球。</li>
</ol>
5. 使用流式细胞仪分析MNP捕获的病毒/细胞外囊泡
<ol>
	<li>将流式细胞仪预热 30 分钟。</li>
	<li>运行质控微球。</li>
	<li>根据磁性纳米颗粒（MNPs）或标记的病毒/细胞外囊泡（EVs）的荧光信号设置阈值。使用 0.22 µm 滤膜过滤的 PBS 调整阈值，以降低背景&#34;噪声&#34;。通过调节光电倍增管（PMT）电压，使过滤后的 PBS 不产生或仅产生极少的事件信号，以此设定阈值。</li>
	<li>以低速运行样品。（在标准的 0.2 µm 鞘液过滤器后串联一个额外的 0.04 µm 在线过滤器，以进一步消除假阳性事件）。</li>
</ol>
6. 捕获效率的评估
<ol>
	<li>使用磁性纳米颗粒抗体（MNP-Abs）捕获荧光标记的细胞外囊泡（EVs）或HIV，操作如3.1、3.2所述。（EVs可通过膜染料或其内含物进行标记 15；HIV可通过基因编码的染料16或膜染料12,17进行标记。）</li>
	<li>按照（4.1–4.2）所述准备磁性分离柱。</li>
	<li>将MNP-病毒/MNP-EV复合物加入分离柱中，使所有液体流过（穿流组分）。将穿流组分收集至离心管中。</li>
	<li>对保留在分离柱上的组分，按（4.4–4.5）所述步骤继续操作。</li>
	<li>对步骤6.3中获得的穿流组分重复一次捕获程序，并进行后续分离（4.1–4.5）。</li>
	<li>将第一次和第二次捕获所获得的保留组分分别在流式细胞仪上检测，设置仪器以EVs或HIV的荧光标记信号触发采集。为评估捕获效率，比较两组分中的事件数量。</li>
</ol>
7. 针对特定任务的方案优化
注意：尽管该方案可用于如上所述的 HIV 和 EVs 分析，但对于 DENV 的分析，应引入以下修改：
<ol>
	<li>将病毒颗粒与1 µM DiI在室温下避光孵育30分钟。孵育后，在密度梯度培养基（10%、20%、25%和35%）中以240,000 × g于4 °C离心1.5小时（不使用刹车）以纯化染色后的病毒。收集位于20%与25%密度梯度培养基层之间的组分14。</li>
	<li>将DiI标记的DENV 1 × 107（60 µl）与制造商推荐浓度或经滴定确定浓度的检测抗体，在含有2.5%小鼠IgG的条件下于室温孵育20分钟。</li>
	<li>将上述混合物与预先标记的60 µl（3.9 × 1012 粒子）MNP-捕获抗体复合物在37 °C轻轻混匀孵育40分钟。</li>
	<li>如上所述，利用磁性柱分离结合后的复合物与未结合的抗体，并通过流式细胞仪进行分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

传统的流式细胞仪仍然是基于单个细胞的物理和化学特性对其进行分析的主要工具18。自流式细胞术发展以来，其基本原理未发生改变：当一个细胞通过激光束并散射光时，即构成一个事件，触发对细胞结合的荧光抗体所发射的荧光光谱的记录。小于300 nm的微小颗粒无法通过流式细胞仪的侧向散射被检测到，因为它们在较大角度下散射更多的光，而大多数流式细胞仪在这些角度并不收集散射光18。本文所述的技术使得利用具有荧光触发功能的传统流式细胞仪，对大量单个病毒或细胞外囊泡（EVs）上的多种抗原进行鉴定和分析成为可能。
实验方案中的关键步骤是将抗体偶联到磁性纳米颗粒（MNPs）上。我们的实验采用15 nm的氧化铁纳米颗粒，其表面带有羧基作为反应基团，具体方法如前所述 9。根据制造商提供的信息，每个15 nm的MNP最多可结合20个抗体；我们实际每个15 nm MNP约结合10个抗体。该估算基于偶联前后抗体的用量、以及通过纳米颗粒表征与粒径分析仪器测定的微球数量（个/mL）。理论上，偶联过程可能导致颗粒聚集，这是不希望出现的情况。为确认本实验方案未引起聚集，我们使用纳米颗粒表征与粒径分析仪器进行了验证。该仪器测量的是颗粒的流体动力学直径，包含涂层及抗体层，而不仅仅是15 nm的核心尺寸。结果显示，大多数偶联后的微球集中在单一峰位（主峰平均值为64.7 ± 4.2 nm，90%的事件低于73 ± 7.3 nm）。将Ab-MNP复合物与病毒颗粒或细胞外囊泡（EVs）以适当比例混合至关重要，需确保MNPs的浓度比EVs/病毒颗粒高出数个数量级。这是保证单个EVs/病毒颗粒被单独分析的关键。为避免事件重叠，应在低流速下运行流式细胞仪。务必以荧光信号触发数据采集，并使用体积控制方法测定捕获目标物的浓度。
然而，磁性纳米颗粒（MNPs）可能通过交联作用，或通过将两个或更多病毒颗粒结合至同一纳米颗粒上，导致细胞外囊泡（EVs）或病毒颗粒发生聚集。为检测是否存在此类聚集现象，可按照下述方法进行聚集性测试。 图4 必须执行此操作。即使单个捕获的病毒颗粒或细胞外囊泡也可能同时进入流式细胞仪的激光束，这会导致两种不同抗原出现假阳性信号。为避免此问题，应按照前述方法设置流式细胞仪，并对样本进行稀释。可通过采用前一点所述的相同策略来检查是否发生重合事件。此外，可通过分析样本的系列稀释液，验证事件数量随稀释倍数呈线性减少，同时荧光标记抗原的平均荧光强度在所有稀释样本中保持恒定，从而确认无重合事件发生。图5）。另一个问题是捕获的病毒/细胞外囊泡（EVs）数量过少。这可能是由于实际携带可通过特异性磁性纳米颗粒（MNPs）进行捕获的抗原的病毒/EVs本身极为稀少所致。或者，由于多种原因导致捕获效率较低。例如抗体与磁性纳米颗粒（MNPs）偶联效率低下，磁性纳米颗粒（MNPs）与病毒颗粒/细胞外囊泡（EVs）的比例偏离本方案所设定的优化比例， 等等。）。为避免后一种情况，应专门评估捕获效率。通常，捕获效率应达到约90%，如 图6.
不同的抗体可能会因空间位阻而相互干扰，或与偶联在磁性纳米颗粒（MNPs）上的抗体发生干扰。为验证此类干扰未发生，必须测试反向捕获方案（如第7节所述）。简言之，应首先用荧光标记的检测抗体对病毒颗粒或细胞外囊泡（EVs）进行染色，然后通过抗体-磁性纳米颗粒（Ab-MNP）复合物进行捕获，随后在磁性柱上将结合的复合物与游离的抗体分离。
相较于现有的病毒颗粒或细胞外囊泡（EVs）抗原组成分析方法，流式病毒术具有显著优势。常规的生物化学方法仅能报告样品中特定蛋白质的总体存在情况，但无法提供关于病毒颗粒或EVs异质性的任何信息。这包括利用 commercially available 的大颗粒对病毒颗粒或EVs进行免疫捕获。这类颗粒直径通常为数微米，每个颗粒可捕获数百至数千个病毒颗粒或EVs。因此，后续的任何分析结果均反映的是单个颗粒所捕获的病毒颗粒/EVs特性的平均值。相比之下，流式病毒术采用直径为10–15 nm的磁性纳米颗粒（MNPs），根据所述实验方案，至少90%的检测事件代表单个病毒颗粒或单个EV。
主要局限性在于，制备样品中的病毒颗粒或细胞外囊泡（EVs）整体可能并未全部被分析，而仅限于被捕获的颗粒。因此，选择用于捕获病毒颗粒或EVs的抗原变得至关重要。此外，与流式细胞术不同，由于病毒颗粒或EVs的表面积较小，可同时检测的不同抗原（即针对不同抗原的荧光标记抗体）数量受到限制。最后，由于这些颗粒的表面面积较小（相较于细胞），不同的抗体之间可能因空间位阻而相互干扰。
只要具备可用于捕获的特异性抗体，本方案可适用于任何来源的病毒或细胞外囊泡（EV）的分析。对单个病毒颗粒表面抗原的分析，可帮助研究人员探究病毒群体中不同组分的致病机制。此外，对血浆中单个EV的鉴定可能实现追溯EV的细胞来源，并反映这些细胞及其所在器官的正常或病理状态。

多细胞生物体中的细胞具有许多个体特征，这些特征可能为特定细胞所独有，或至少属于某些独特的细胞群体。即使是培养的克隆细胞，也表现出个体差异，其形态多样性即是明证。此外，细胞的个体性也体现在其分泌产物中。在病毒感染的情况下，病毒颗粒可携带产生该病毒的宿主细胞的蛋白质。例如，在人类免疫缺陷病毒（HIV）中，许多宿主细胞蛋白嵌入病毒包膜中，而由不同细胞产生的病毒可能携带这些特征性蛋白1，2或&#34;细胞印记&#34;。
即使没有感染，细胞也会向周围培养基中释放少量细胞外囊泡（EVs）。这些囊泡的生物发生过程及其结构在许多情况下与病毒相似，尤其是逆转录病毒。近年来人们逐渐认识到，最初被认为是&#34;血小板尘埃&#34;的EVs3，实际上构成了细胞间通讯的一个重要生理系统。与另外两种细胞间通讯系统——即细胞间接触相互作用和分泌的可溶性分子——共同协作，EVs参与调控正常生理功能，并在多种病理状态下发生改变4,5，包括病毒感染6,7。
尽管释放的病毒颗粒和细胞外囊泡均具有高度异质性，但目前主要通过整体分析进行表征，导致其个体特征丢失。因此，需要一种类似于流式细胞术的方法，能够基于不同表面抗原对细胞进行表型分析，从而对单个病毒及类病毒颗粒进行表征。然而，由于细胞外囊泡或小型病毒颗粒过小，无法产生足够的光散射信号，而大多数流式细胞仪依赖该信号进行触发检测，因此无法使用标准流式细胞术方法对其进行分析。为克服这一限制，可采用荧光触发技术。但是，若使用荧光标记抗体对细胞外囊泡或病毒颗粒进行染色，则由于游离抗体及其聚集体与目标颗粒的荧光强度和大小相近，难以将二者区分开来。
最近，我们开发了一种基于纳米技术的高通量方法，可利用常规流式细胞仪对单个微小颗粒上的抗原进行表征 8,9我们采用磁性纳米颗粒（MNPs）对目标颗粒进行免疫捕获，该方法已被其他研究团队用于多种不同应用中。 10,11,12,13；然而，我们的新型技术能够捕获特定的单个目标，随后通过流式细胞术以荧光触发而非光散射的方式对捕获的颗粒进行表型分析，且不受游离抗体的干扰。该方法具有广泛的应用前景，可用于表征细胞产生的任何病毒性和非病毒性小颗粒的抗原组成 体内 和 体外 提供了针对表面抗原的特异性荧光抗体后，我们已将该技术应用于研究多个生物学问题。
特别是，我们评估了单个 HIV-1 颗粒上宿主细胞标志物的分布9，通过分析其表面蛋白研究了单个登革病毒（DENV）的成熟过程14，并探究了健康志愿者和急性冠状动脉综合征（ACS）患者血液中释放的细胞外囊泡（EVs）。尽管该新技术基于相似的原理，但其应用需要开发特定的实验方案，如下所述。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>羧基磁性氧化铁纳米颗粒偶联试剂盒</td><td>Ocean Nanotech</td><td>ICK-15-005</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 离心滤过装置（Ultracel-100 膜）</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 圆底聚丙烯试管，无盖</td><td>Falcon</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>优质生物材料&amp;nbsp;</td><td>351-068-131</td><td></td></tr><tr><td>SuperMAG-01 磁力分离器&amp;nbsp;</td><td>Ocean Nanotech</td><td>SuperMAG-01</td><td></td></tr><tr><td>Zenon R-藻红蛋白小鼠IgG1&amp;nbsp;标记试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Z25055</td><td></td></tr><tr><td>采用Omega膜的Nanosep离心装置 100k</td><td>Pall Corp</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>甲醛聚合物，电镜级，已纯化</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>123 计数 eBeads&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CytoCount 微球</td><td>Dako</td><td>S2366</td><td></td></tr><tr><td>AccuCheck 计数微球</td><td>Invitrogen</td><td>PCB100</td><td></td></tr><tr><td>细胞仪设置 &amp;amp; 追踪微珠试剂盒（CST）</td><td>BD生物科学</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI 细胞标记溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;MACS 柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-701</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS 分离器磁铁</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRII 流式细胞仪</td><td>BD生物科学</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 软件</td><td>Flowjo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用流式病毒术分析病毒颗粒与细胞外囊泡的抗原谱

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

细胞会向周围培养基中释放小型细胞外囊泡（EVs）。在病毒感染过程中，细胞也会释放出与某些EVs大小相似的病毒颗粒。病毒颗粒和EVs均携带其来源细胞的蛋白质，且具有抗原异质性。尽管二者存在多样性，目前对病毒和EVs的研究仍主要依赖于整体分析方法。本文介绍一种基于纳米技术的高通量原创方法，可利用常规流式细胞仪对单个小型颗粒表面的抗原进行表征。该方法首先使用偶联了特异性识别某一表面抗原抗体的15 nm磁性纳米颗粒（MNPs）对病毒或细胞外囊泡进行免疫捕获；随后将捕获的病毒颗粒或囊泡与针对其他表面抗原的荧光标记抗体共同孵育。所得复合物通过磁性柱分离以去除未结合的抗体，再通过以荧光信号触发的常规流式细胞仪进行分析。该方法具有广泛的应用前景，可用于表征细胞产生的任何病毒性和非病毒性小型颗粒的抗原组成

关键词：细胞外囊泡，病毒颗粒，磁性纳米颗粒，免疫捕获，流式细胞术，抗原表征，单颗粒分析 体内 和 体外在此，我们提供了该方法的应用实例，用于评估单个HIV-1颗粒上宿主细胞标志物的分布，研究单个登革病毒（DENV）颗粒的成熟过程，以及探究释放到血液中的细胞外囊泡。

HIV-1 病毒颗粒对细胞抗原的选择性捕获
通过“流式病毒术”，现在可以对单个病毒颗粒上的细胞抗原进行可视化检测。例如，我们重点关注了 HIV-1 携带的两种细胞抗原：LFA-1 和 HLA-DR。此前，这两种抗原已在批量分析的 HIV-1 样品中被鉴定出1。我们制备了偶联有针对 HIV Env 蛋白的抗体 VRC01 的磁性纳米颗粒（MNP），并利用这些 MNP 捕获在人外周血单个核细胞（PBMCs）中产生的 HIV-1 病毒颗粒（HIV-1LAI.04 或 HIV-1SF162）。此外，我们还使用另一种抗 Env 抗体 2G12 对这些病毒颗粒进行染色。流式病毒术结果显示，HIV-1 病毒颗粒在 LFA-1 和 HLA-DR 的表达上具有高度异质性。平均而言，携带 LFA-1 和 HLA-DR 的 HIV-1LAI.04 病毒颗粒比例分别为 16.7 ±2.0%（n = 6）和 8.6 ±0.3%（n = 3）。所有病毒颗粒中仅有 4.8 ±0.6%（n = 3）同时表达这两种抗原。在另一种 HIV-1 毒株 HIV-1SF162 中，这两种抗原分别存在于 20.0 ±4.4%（n = 6）和 10.8 ±1.3%（n = 6）的病毒颗粒上，而同时携带两种抗原的病毒颗粒占 6.5 ±0.4%（图 1）。
细胞蛋白的分布取决于复制病毒的细胞类型。感染HIV的Jurkat细胞产生的病毒颗粒在抗原性上不同于感染的PBMCs所产生的病毒颗粒。由Jurkat细胞产生的HIV-1LAI 0.4病毒颗粒分别携带1.6 ±1.4%（n = 3）和1.6±0.7%（n = 4）的LFA-1和HLA-DR。对于在Jurkat细胞中产生的HIV-1SF162 病毒颗粒，这些参数分别为7.2 ±2.5%（n = 3）和5.6 ±2.7%（n = 4）。因此，由两种不同细胞类型产生的HIV-1LAI.04在抗原组成（至少对于HLA-DR和LFA-1而言）上存在差异（p &lt;0.02）。
流式病毒术在登革病毒评估中的应用
DENV 的成熟与其病毒颗粒表面 prM 蛋白的表达相关。我们采用流式病毒检测技术评估在 BHK-1 细胞和 LoVo 细胞中产生的 DENV 中成熟病毒所占的比例。病毒颗粒用脂质染料 DiI 进行染色。对单个捕获的病毒颗粒的分析显示，在 BHK-1 细胞中产生的 DENV 中有 48.2 ± 5.3%（n = 8）表达 prM；而在 LoVo 细胞中产生的 DENV 中，表达 prM 的比例为 84.5 ± 3.4%（n = 4）。其余病毒颗粒中，分别有 51.8 ± 5.3%（n = 8）和 15.5 ± 3.4%（n = 4）不表达 prM（图 2）。因此，流式病毒检测可用于区分完全成熟的单个 DENV 与未成熟（或部分成熟）的 DENV 病毒颗粒。
健康志愿者和急性冠脉综合征（ACS）患者血液中释放的细胞外囊泡
为了研究急性冠脉综合征（ACS）患者与健康对照者中不同的细胞外囊泡（EV）亚群，我们使用与抗CD31、CD41a或CD63抗体偶联的荧光磁性纳米颗粒（MNPs）从血小板贫乏血浆（PPP）中捕获EV。由CD31-MNPs捕获的EV经CD41a和CD63染色，由CD41a-MNPs捕获的EV经CD31和CD63染色，而由CD63-MNPs捕获的EV则经CD31和CD41a染色（图3）。
急性冠脉综合征（ACS）患者中被CD31磁性纳米颗粒（CD31-MNPs）捕获且对一种或两种检测抗体呈阳性的细胞外囊泡（EVs）数量为3,359 [2,328; 5,472] EVs/µl，显著高于健康志愿者的1,272 [714; 2,157] EVs/µl（p = 0.001）。在ACS患者中，由CD63捕获的总EV数量为3,541 [1,318; 5,173] EVs/µl，而健康志愿者为806 [488; 2,112] EVs/µl（p = 0.007）。使用CD41a-MNPs在ACS患者血浆中捕获的EV数量为4,752 [3,238; 7,173] EVs/µl，而在健康志愿者血浆中该数值显著较低，为2,623 [1,927; 4,188] EVs/µl（p = 0.015）。总体而言，我们的结果表明，尽管ACS患者的EV总量普遍升高，但不同EV亚群的升高幅度存在差异。
<img alt="柱状图，HIV-1病毒颗粒在Jurkat细胞和PBMCs中的百分比；分析LFA-1和HLA-DR标志物。" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：HIV-1病毒颗粒在不同类型细胞中复制时对细胞抗原的选择性整合。由PBMCs或Jurkat细胞释放的HIV（HIV-1LAI.04 或 HIV-1SF162）病毒颗粒通过VRC01-MNPs捕获，并使用第二代抗gp120抗体2G12以及针对HLA-DR和LFA-1的特异性抗体进行染色。染色样本随后进行流式分析，检测HLA-DR（白色柱）和LFA-1（黑色柱）。数据为3至6次实验的均值±标准误（SEM）9。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱比较2H2和IgG2a中DENV的结合情况，显示细胞群体的百分比。" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：DENV病毒颗粒的成熟状态。 在BHK-21细胞（A, B）或LoVo细胞（C, D）中产生的DENV用脂质染料DiI标记，经密度梯度介质超速离心后，使用2H2抗体（A, C）或同型对照IgG2a（B, D）对prM蛋白进行染色。标记后的病毒颗粒随后通过3H5-1-MNP捕获，并进行流式分析14。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞外囊泡浓度图；CD31、CD63、CD41a 标记物；数据比较；柱状图。" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图 3： ACS 患者与健康对照者来源的细胞外囊泡（EV）分析。 使用 CD31-MNPs、CD63-MNPs 或 CD41a-MNPs 捕获血浆 EV，并分别用针对 CD41a 和 CD63、CD31 和 CD41a、以及 CD31 和 CD63 的抗体进行染色。在流式分析中对至少被一种检测抗体染色的被捕获 EV 进行可视化和计数。数据以点图形式展示，中位数和四分位距（IQR）表示。绿色符号：健康志愿者（对照组），棕色符号：ACS 患者。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示 HIV 纳米颗粒标记、稀释倍数和计数分析结果的流式细胞术图谱。" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：代表单个病毒颗粒的流式事件比例评估。（A）HIV-1。将病毒颗粒悬液分为两部分，分别用 DiD (左图) 或 DiO (中图) 染色。混合后，含有两种不同染色病毒颗粒的悬液用 VRC01-MNPs 捕获，并进行流式病毒检测 (右图)。聚集体（双色事件）占总事件的比例低于 10%。（B–D）DENV。将 DiI 染色的病毒颗粒悬液从 1:2 至 1:256 进行连续两倍稀释，并在流式细胞仪上通过高通量进样系统（HTS）检测 (B)。 DiI-DENV 用 2H2 抗体标记 (C)，或 DiI-DENV 被 3H5-1-MNPs 捕获 (D)。将样品 C 和 D 再次从 1:2 至 1:256 进行连续两倍稀释，并通过 HTS 检测14。在所有情况下，稀释倍数与事件数量之间均呈现线性相关关系，表明病毒颗粒未发生明显聚集。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="显示检测到的病毒与稀释倍数关系的病毒稀释分析图，展示相关趋势。" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5： 通过流式细胞仪检测单个病毒颗粒。 DiI 标记的 DENV 悬液从 1:2 到 1:2,048 进行连续两倍稀释，并在流式细胞仪上使用 HTS 模式采集数据。(A) 检测到的病毒数量随稀释倍数的变化关系。(B) DiI 标记 DENV 的中位荧光强度 (MFI)14。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="用于HIV检测的流式细胞术直方图；包含计数与FL-1荧光强度的数据。" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6：使用偶联特异性抗体的磁性纳米颗粒（MNPs）捕获病毒颗粒和细胞外囊泡比例的评估。 标记的HIV-1病毒颗粒或细胞外囊泡（EVs）通过偶联特异性抗体的MNPs捕获，并进行流式病毒分析。在磁性柱分离后，对穿流组分（未被保留）进行分析，以检测在第一轮捕获中遗漏的目标病毒颗粒或EVs。（A）标记的HIV-1BaL病毒颗粒使用2G12-MNPs捕获（左图）。穿流组分被重新捕获并进行流式病毒分析（右图）。在第一轮中，约95%的目标病毒颗粒被成功捕获。（B）标记的EVs使用抗CD81-MNPs捕获，并在磁性柱上分离（左图）。穿流组分被再次捕获并分析（右图）。在第一轮中，约99%的目标囊泡被成功捕获8。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

利用与识别表面抗原的抗体偶联的15 nm磁性纳米颗粒对病毒或细胞外囊泡进行免疫捕获。捕获的病毒颗粒或囊泡使用针对其他表面抗原的荧光抗体进行标记。将形成的复合物置于强磁场中分离，并通过以荧光触发的常规流式细胞仪进行分析。

细胞会向周围培养基中释放小型细胞外囊泡（EVs）。在病毒感染后，细胞还会释放出与这些囊泡大小相似的病毒粒子……

本实验的总体目标是利用磁性颗粒（MNPs）结合常规流式细胞仪，对单个病毒颗粒或单个细胞外囊泡表面的多种抗原进行鉴定。该方法有助于我们深入理解囊泡和病毒的表型与功能之间的关系及其在人类疾病、特别是病毒感染中的作用。该技术的主要优势在于，它能够实现对单个病毒颗粒或单个细胞外囊泡的分析，而非传统的群体分析，从而避免了这些颗粒个体特性的丢失。该方法可用于深入了解病毒颗粒的正确检测，但只要有合适的抗体，也可应用于其他系统。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为在分析前必须逐一验证和检查所有步骤，包括流式细胞仪的正确设置。首先，在一个1.5毫升微量离心管中，按每种条件加入60 µL磁性纳米颗粒（MNPs）和5 µL针对目标捕获抗体同型特异的标记FAB片段。将溶液在室温下孵育30分钟，并持续混匀。然后用300微升PBS预润湿一个100K浓缩管，并在微量离心机中离心。离心结束后，使用100K层析柱纯化标记的复合物，随后再次进行微量离心，将沉淀重悬于200微升新鲜PBS中。为了捕获目标颗粒，将抗体标记的磁性纳米颗粒（MNPs）与目标颗粒在适当的孵育时间和温度下进行孵育。接下来，使用适当物种的IgG抗体阻断任何非特异性Fc结合位点，轻轻涡旋混匀，并在室温下孵育颗粒溶液3至5分钟。然后，按照制造商推荐的浓度，将各检测抗体加入颗粒样品中，或将同型对照抗体加入同型对照样品中，在室温下继续孵育20分钟。为了将磁性纳米颗粒（MNP）捕获的颗粒与未结合的抗体分离，首先将磁性分离柱置于分离磁铁中，并用500 µL洗涤缓冲液预润湿柱子。让洗涤缓冲液流过柱子，然后将MNP颗粒复合物加入柱中，收集流出液至废液容器中。当所有复合物溶液均通过柱子后，用500 µL洗涤缓冲液洗涤柱子三次。然后将柱子转移至一个12 × 75 毫米的试管中。三分钟后，加入200 µL PBS，使磁珠依靠重力洗脱。当所有PBS完全通过柱子后，在试管中加入200 µL新鲜PBS，并用200 µL 4%多聚甲醛固定颗粒。接下来，将经过0.22微米滤膜过滤的PBS上样至流式细胞仪，并调整细胞仪的PMT电压，直至过滤后的PBS显示零至极少的事件信号。然后使用低流速运行MNP捕获的颗粒，并在标准的0.2微米鞘液过滤器后串联一个0.04微米的在线过滤器，以进一步消除任何假阳性信号。通过流式病毒检测技术，现在可以对单个病毒颗粒上的细胞抗原进行可视化分析。例如，在本实验中，观察到HIV-1病毒颗粒在LFA-1和HLA-DR的表达方面具有高度异质性，病毒颗粒的捕获依赖于复制病毒的细胞。登革病毒的成熟与其病毒颗粒表面前体膜蛋白的表达相关，正如刚刚所展示的，可通过流式病毒术加以区分。在本代表性实验中，使用多种荧光标记的磁性纳米颗粒偶联抗体，从血小板贫乏血浆中捕获细胞外囊泡，以研究急性冠状动脉综合征患者中不同亚群的细胞外病毒。流式病毒分析结果显示，与健康供体对照组相比，急性冠状动脉综合征患者的整体细胞外囊泡数量大多有所增加，但不同细胞外囊泡亚群的增加幅度存在差异。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两小时内完成。在进行该操作时，重要的是务必在开始分析前正确设置流式细胞仪。该技术的开发为病毒学和细胞外生物学领域的研究人员提供了一条新途径，可用于研究这些颗粒在体外系统以及人和动物样本中正常与病理过程中的作用。通过该方法分离后，可进一步采用其他技术（如PCR或质谱分析）来回答更多问题，例如：特异性捕获的细胞外囊泡（EVs）或病毒颗粒携带哪些特定的蛋白质、RNA或DNA分子。希望在观看本视频后，您能够充分理解如何分析单个病毒颗粒或单个细胞外囊泡的抗原组成。

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