紧皮小鼠离体血管舒张及细胞外基质的分离

这些用于分离细胞外基质和进行离体血管舒张实验的整体目标是研究IRF5抑制性肽在啮齿类动物中的治疗作用。该方法有助于解答细胞外基质的变化如何增强或减轻疾病进展的问题。血管舒张研究的主要优势在于，能够在无需考虑全部信号通路组分的情况下，为我们提供对体内过程的深入认识。

心脏细胞外基质的分离方法可应用于其他器官，如后肢或肺。当我们开始关注紧皮小鼠中 fibrillin-1 的重复时，首次产生了这一想法，并认识到细胞外基质改变对细胞行为的影响。在对小鼠进行麻醉并完成手术准备后，使用剪刀切开皮肤。

从胸部向上切开至下颌骨外侧，注意不要扰动下颌前方的深层组织。随后通过去除周围的软组织来分离面动脉。操作时需小心，避免损伤该动脉。

用MOPS缓冲液浸泡暴露的组织，以保持其活性。完全暴露筋膜动脉后，用镊子夹住该动脉第一分支远端、即将切断位置近端的血管段。随后，将其从主干动脉上切断，并用镊子夹住筋膜动脉。

切断来自fascialis的两个分支，然后轻轻提起血管，同时切断其与周围组织的连接，直至到达分叉处。在分叉处，切断两条子动脉，以游离血管，并将其转移至含有MOPS缓冲液的培养皿中，保持湿润直至使用。为测量血管舒张功能，首先准备对血管进行套管插管。

将末端直径为125至175微米的玻璃移液管装满MOPS缓冲液。同时用MOPS缓冲液填充溶液储液罐。现在对分离的血管进行插管。

使用眼科缝线将它们绑在玻璃移液管上。务必防止移液管中产生气泡。接着，将血管腔室安装在配备视频摄像装置的倒置显微镜上。

通过视频测径系统播放视频，以在屏幕上测量血管。现在采用两步法对血管加压。首先，将装满液体的储液器抬升至高于血管的位置，使其产生20毫米汞柱的压力。

使用拖把将管路打开至容器。当容器加压时，检查扎带周围及容器全长是否有泄漏迹象。若未发现泄漏，升高储液罐以产生60毫米汞柱的压力。

然后再次检查容器是否存在泄漏。待压力保持稳定且无泄漏后，在此压力下平衡容器30分钟。平衡完成后，检测血管对目标化合物的舒张反应。

首先通过加入U46619使血管收缩至原来的一半至四分之三。让溶液孵育血管6分钟以达到稳定状态。然后，逐渐将测试化合物（如乙酰胆碱）加入浴槽溶液中。

每两分钟将浴液中测试溶液的浓度增加 10，从 000001 摩尔开始，逐步增加至 001 摩尔。血管舒张的变化引发了关于信号传导的疑问。但我们的研究重点是心脏。

为了减少动物使用，我们选择分离心脏细胞外基质，以专注于从外部启动的信号传导。首先从麻醉小鼠中取出心脏，转移至含有15毫升高渗1%十二烷基硫酸钠的烧杯中。

将溶液置于室温下，在摇床上轻轻搅拌18小时。第二天，更换为15毫升5% Triton X100溶液，作用30分钟，随后更换为15毫升PBS溶液，作用15分钟。然后将细胞外基质（ECM）和液氮迅速冷冻，并置于1.5毫升微量离心管中。

待组织冷冻后，将其转移至预冷的研钵中，用研杵研磨成粉末。将粉末悬浮于含有抗生素（终浓度1:100）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，制成黏稠溶液。将悬浮液置于冰浴中，高功率超声处理30至60秒。

细胞外基质蛋白现已分离，必须保持低温。使用蛋白前，需采用Bradford法测定其浓度。IRF5D肽是一种抑制性肽，与正常的IRF5存在显著差异。

IRF5D 仅有17个氨基酸，可结合IRF5的磷酸化位点，从而阻止其磷酸化和同源二聚化，干扰IRF5活性状态的形成。对杂合型紧皮小鼠皮下注射IRF5D，持续治疗三周。

通过免疫组织化学检测，每视野平均染色细胞数显示中性粒细胞和CD64数量减少。与磷酸盐缓冲液处理组相比，IRF5D处理改善了杂合型紧肤小鼠腹肌动脉的乙酰胆碱诱导血管舒张功能。在来源于转基因小鼠心脏组织的培养心肌细胞中，来自杂合型紧肤小鼠的培养物中IRF5阳性细胞数量多于对照小鼠。

用IRF5D处理任一培养物均可导致IRF5阳性细胞核减少。观看本视频后，您应能充分理解如何对心脏进行脱细胞处理。一旦掌握该技术，便可将其应用于多种器官，并有助于回答各类科学问题。请记住，避免过度消化基质至关重要。

还应充分掌握分离和悬挂筋膜动脉的方法。一旦掌握，该技术大约需要60分钟，几乎可用于任何血管床。需要注意的是内皮非常脆弱，在解剖过程中应谨慎操作。

健康的平滑肌与受损的内皮同时存在的情况并不少见。