Name: 隔离容器的血管扩张和细胞外基质的紧皮肤小鼠隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学习从紧皮肤小鼠模型中分离心脏细胞外基质并进行离体血管扩张实验的方法。该技术结合IRF5抑制肽处理，可深入研究基质变化对心血管疾病进展的影响机制。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目HL-089779（DW）、HL-112270（KAP）和HL-102836（KAP）以及Cimphoni生命科学公司（资助DW部分薪金）的支持。作者感谢Meghann Sytsma对稿件的编辑工作。

本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已获机构动物护理与使用委员会批准（方案编号：AUA#1517）。所有涉及小鼠的研究均符合美国公共卫生署（PHS）政策要求。
1. 诱饵肽的设计
<ol>
	<li>基于IRF5的三维结构进行设计。设计一条17个氨基酸的肽段，命名为IRF5D（ELDWDADDIRLQIDNPD），其中用天冬氨酸（D）取代丝氨酸（S），以模拟IRF5在421–438位点（ELSWSADSIRLQISNPD）的磷酸化状态。结合对三维结构中巯基基团的分析及对IRF5激活机制的已有认知， 即，丝氨酸磷酸化，提示靶向IRF5的一种策略是生成诱饵肽。参见 图 1. 为了确定三维结构中的最佳区域，使用分子建模软件来设计小分子和多肽15. 
	注意：此过程中的关键步骤是获得靶蛋白的三维结构及其可能的结合位点。IRF5 的三维结构能够准确反映其在磷酸化后形成二聚体的方式。将天冬氨酸取代丝氨酸或苏氨酸的步骤由外部完成。该肽段单独合成，不与 IRF5 连接。</li>
	<li>通过将丝氨酸（S）替换为天冬氨酸（D），复制磷酸化结构域。根据原始序列（ELSWSADSIRLQISNPD），合成新的IRF5S肽，其氨基酸序列为Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH₂。2 (IRF5D)</li>
</ol>
2. 生物层干涉测量法（BLI）
注意：重组IRF5的纯化工作已外包。16
<ol>
	<li>使用带有长链连接臂的生物素化试剂，按照1:1的生物素与配体摩尔比对IRF5进行生物素标记。长链连接臂将确保配体表面更活跃且更均一。
	<ol>
		<li>将1 mL浓度为2 mg/mL的IRF5加入13 µL浓度为20 mM的生物素试剂中，必要时可增加体积。冰上孵育2小时。标记完成后，使用脱盐离心柱从标记蛋白中去除反应混合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将生物素标记的配体与生物传感器孵育15分钟。避免过度标记，并调整至1:1的摩尔比。标记完成后，使用脱盐离心柱从标记蛋白中去除反应混合物。</li>
	<li>将生物素标记的IRF5生物传感器在不同浓度的IRF5诱饵肽溶液中孵育10分钟。结合与解离速率的测定方法如文献10,17,18所述。</li>
</ol>
3. 凋亡与增殖检测
<ol>
	<li>增殖实验 通过 四氮唑的生物还原
	<ol>
		<li>采用标准抓颈法，使用27号针头在Tsk/+和C57Bl/6J小鼠皮下注射用PBS稀释的IRF5D（1 mg/kg/d，20 g小鼠注射体积为20 µL）或单独注射PBS，持续21天。</li>
		<li>用异氟烷（5%）麻醉小鼠，随后进行颈椎脱位。沿胸骨剪开胸腔以取出心脏。用镊子提起心脏并将其摘除。</li>
		<li>用含有 50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.5% NP-40、250 mM NaCl、5 mM EDTA、50 mM NaF 的蛋白裂解缓冲液裂解心脏组织10 并通过Bradford法测定蛋白浓度19.</li>
		<li>用第7节所述方法分离的C57Bl/6J心脏基质包被96孔板。将悬浮于PBS中的C57Bl/6J心脏基质稀释至浓度为20 µg/mL，每孔加入30 µL。置于37 °C培养箱中静置过夜。</li>
		<li>使用500 mL内皮细胞基础培养基，添加0.4%牛脑提取物、0.1%抗坏血酸、0.1%氢化可的松、0.1%人表皮生长因子、2%胎牛血清和0.1%庆大霉素/两性霉素B，培养人脐静脉细胞。将细胞接种于96孔板中，在5% CO₂条件下培养。2 以及95%常氧空气，细胞密度为每孔25,000个细胞。在培养基中加入浓度递增的IRF5D（0–100 µg/mL）进行刺激（加样体积为0–50 µL/mL）。</li>
		<li>三天后测定细胞增殖情况，并使用酶标仪评估吸光度差异。该反应为 MTS 四唑化合物的生物还原反应。代谢活跃的细胞中的脱氢酶酶类可产生 NADPH 或 NADH。</li>
		<li>由于 MTS 四唑化合物需在 -20 °C 冷冻保存，使用前需在室温下缓慢解冻约 90 分钟。用移液器向 96 孔板的每孔中加入 20 µL 该化合物，再加入 100 µL 培养基。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育 1 至 4 小时。2 腔室</li>
		<li>在490 nm波长处测定吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞凋亡检测 通过 caspase 活性 
	注意：实验装置与上述 3.1.1 至 3.1.5 相同。
	<ol>
		<li>在培养基中加入浓度范围为 0 - 100 µg/mL 的 IRF5D，对细胞进行梯度浓度刺激。</li>
		<li>向内皮细胞中加入绿色检测用Caspase 3/7底物，于37 °C孵育30分钟。使用酶标仪在激发/发射波长502/530 nm条件下同步检测荧光信号。实验重复三次。 
		注意：绿色荧光试剂是一种四氨基酸肽与核酸结合染料的结合物。当该试剂在caspase 3和7激活后被切割时，即产生荧光，该荧光可被检测。其优势在于减少了洗涤步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 心脏中IRF5和ICAM-1表达的评估
<ol>
	<li>使用27号针头，通过标准抓颈法，将用PBS稀释的IRF5D（1 mg/kg/d，在20 g小鼠中注射20 µL体积）或单独PBS，对Tsk/+小鼠和C57Bl/6J小鼠进行皮下注射，每日一次，持续21天。</li>
	<li>用异氟烷（5%）麻醉小鼠，实施颈椎脱位。沿胸骨切开胸部以取出心脏。用镊子提起心脏并将其完整摘除。</li>
	<li>用含有50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.5% NP-40、250 mM NaCl、5 mM EDTA、50 mM NaF10的蛋白裂解缓冲液裂解心脏组织，并通过Bradford法19测定蛋白浓度。
	<ol>
		<li>对心脏组织裂解物进行Western blot分析。用含5%巯基乙醇的Laemmli上样缓冲液将样品稀释至总蛋白量为25 µg，总体积为40 µL。在4–15% TGX凝胶上以50 mV电压电泳5分钟，随后将电压升至100 mV，持续1小时，直至染料前沿跑出。</li>
		<li>将凝胶放入1×转膜缓冲液（25 mM Tris，190 mM甘氨酸，20%甲醇，必要时调节pH至8.3）中，孵育10–15分钟。</li>
		<li>组装转膜“三明治”结构（海绵、滤纸、凝胶、纤维素膜、滤纸、海绵），确保各层之间无气泡。应将凝胶置于阳极侧，膜置于阴极侧。在4°C条件下以100 mA电流转膜1小时。</li>
		<li>次日，用含5%吐温的Tris缓冲盐水（TBS-T）清洗膜三次，每次5分钟，随后在室温下用5%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点30分钟。</li>
		<li>加入一抗溶液，在4°C孵育过夜。一抗使用针对IRF5或ICAM-1的多克隆抗体，以Tris缓冲盐水按1:1,000比例稀释。</li>
		<li>将二抗用Tris缓冲盐水稀释后，在室温下孵育膜1小时。二抗选用辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG（1:10,000）和辣根过氧化物酶标记的驴抗山羊IgG（1:10,000）。</li>
		<li>根据制造商说明书混合化学发光试剂，将其加入膜上，孵育3分钟以使目标条带发光。将膜暴露于X射线胶片上进行显影。使用ImageJ软件测量条带密度，并将各条带密度值归一化至对照条带10。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. IRF5 抑制后炎性细胞数量的评估
<ol>
	<li>使用27号针头，通过标准抓颈法，将溶于PBS的IRF5D（1 mg/kg/d）或仅PBS皮下注射至Tsk/+小鼠和C57Bl/6J小鼠体内，持续21天。</li>
	<li>用异氟烷（5%）麻醉小鼠，行颈椎脱位处死。沿胸骨切开胸部暴露心脏，用镊子提起并切除心脏。将切除的心脏迅速冷冻，并保存至分析前。</li>
	<li>将冷冻心脏置于适用于所用恒冷切片机的组织夹持器上，使用恒冷切片机切取厚度为10 µm的冷冻切片，用于免疫组织化学分析。</li>
	<li>用含1%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液在室温下固定冷冻切片20分钟。随后用含0.5% Triton-X 100的PBS在室温下通透切片5分钟。 
	注意：多聚甲醛为受控致癌物，操作时需谨慎。</li>
	<li>将抗兔CD64抗体（单核细胞/巨噬细胞标记物）用PBS按1:200稀释，加入固定后的切片中，在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>在室温下用PBS洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将抗大鼠NIMP抗体（中性粒细胞主要标记物）用PBS按1:200稀释，加入固定后的切片中，在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>在室温下用PBS洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将荧光二抗——抗兔Alexa 488偶联抗体和抗大鼠Alexa 488偶联抗体——用PBS按1:200稀释。</li>
	<li>将抗兔Alexa 488偶联和抗大鼠Alexa 488偶联二抗分别加入对应切片中，在37 °C孵育30分钟。抗体体积根据切片大小而定，应充分覆盖整个切片区域，通常体积在100至200 µL之间。</li>
	<li>使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）作为核染色剂，以PBS按1:1,000稀释。取1 µL加入1 mL PBS中，在最后一次洗涤步骤中加入DAPI。滴加水性封片剂于盖玻片上，然后将其覆盖在载玻片上。</li>
	<li>使用40倍油镜通过共聚焦显微镜分析荧光标记切片。CD64和NIMP的激发波长为488 nm，发射波长大于530 nm；DAPI的激发波长为360 nm，发射波长为460 nm（蓝色）。根据不同的荧光标记区分单核细胞/巨噬细胞与中性粒细胞（每种抗体n = 10张图像，来自每组3只不同小鼠），并进行计数。数据以计数细胞数量表示。</li>
</ol>
6. IRF5 抑制后的细胞依赖性血管舒张
<ol>
	<li>使用氯胺酮（80 - 100 mg/kg）和赛拉嗪（10 - 12.5 mg/kg）混合物对C57Bl/6J对照小鼠以及经或未经肽处理的Tsk/+小鼠进行麻醉。通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合物，并手动固定小鼠。
	<ol>
		<li>使用25号或更小的针头。将针头插入腹部右下象限。在注射前回抽针筒活塞，以确保针头未进入血管或肠管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当达到足够的麻醉深度后，将小鼠仰卧位固定，用含酒精的纱布擦拭毛发，使用剪刀打开胸腔并取出心脏。 
	注意：放血可使小鼠安乐死，并通过减轻血管系统的压力使解剖更易进行，从而在切断血管时减少出血。
	<ol>
		<li>使用剪刀切开皮肤，从胸部开始沿下颌骨外侧向上剪开，注意不要扰动下颌前方的深层组织。</li>
		<li>通过去除周围软组织分离面动脉。</li>
		<li>注意：在操作过程中，避免损伤血管或牵拉面动脉，同时保持暴露的组织浸润于MOPS缓冲液（2.0 mM CaCl2·2H2O，0.02 mM EDTA，5.0 mM葡萄糖，4.7 mM KCl，1.17 mM MgSO4·7H2O，3.0 mM MOPS，145 mM NaCl，1.2 mM NaH2PO4·H2O，2.0 mM丙酮酸）中以防止干燥。操作应在双目立体变倍解剖显微镜（放大倍数3.5X至45X）和光纤光源下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离面动脉。
	<ol>
		<li>用镊子夹住面动脉第一分叉近端及计划切断部位远端，将其从母体动脉即颈外动脉上切断。分别从小鼠对照组、Tsk/+小鼠（经或未经IRF5D处理）中取出面动脉。</li>
		<li>在仍用镊子夹持动脉的同时，剪断从面动脉发出的两个分支，以便轻柔提起血管，并识别和切断任何未剪断的周围组织。</li>
		<li>以此方式继续操作，直至到达分叉处，切断两个子代动脉以完全游离血管。由于心脏已被移除，血管系统压力已解除，因此在切断前无需夹闭血管。将游离的血管置于MOPS缓冲液中，同时对另一侧的面动脉进行解剖和分离。</li>
		<li>通过将血管结扎在末端直径为125 - 175 µm的玻璃移液管上进行套管插管。预先用MOPS缓冲液填充玻璃移液管和缓冲液储液罐。 
		注意：防止移液管中产生气泡。</li>
		<li>使用眼科缝线将血管结扎固定在移液管上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将血管腔室安装在配有摄像装置的倒置三目显微镜上。将视频信号接入视频测径系统，用于在屏幕上测量血管直径。20
	<ol>
		<li>采用两步法加压。首先，将装有MOPS缓冲液的储液罐抬升至高于血管位置，相当于20 mmHg压力，手动打开储液管路中的旋塞阀使液体流入血管。检查血管结扎处及沿血管全长是否有渗漏。其次，将储液罐升高至60 mmHg压力，并再次检查血管。</li>
		<li>在60 mmHg压力下加压后，让血管平衡30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为评估乙酰胆碱（10-7 至 10-4 M）引起的血管舒张反应，先使用U46619（1 - 3.0 × 10-8 至 10-7 M）使血管预收缩至其最大直径的50 - 75%。待血管稳定6分钟后，以2分钟为间隔逐步向浴槽中添加乙酰胆碱，使浴槽中最终浓度依次达到10-7、10-6、10-5、10-4 M。测量三组小鼠血管的舒张反应。</li>
</ol>
7. 心脏细胞外基质的分离
<ol>
	<li>使用异氟烷（5%）麻醉C57Bl/6J对照小鼠以及经或未经肽处理的Tsk/+小鼠，并实施颈椎脱位。沿胸骨切开胸部以取出心脏。用镊子提起心脏并完整摘除。</li>
	<li>将取出的心脏放入烧杯中，加入15 mL高渗的1%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。在室温下将心脏在1% SDS溶液中振荡18小时，方法是在溶液中加入搅拌子并将烧杯置于搅拌器上进行搅拌，以破坏细胞结构。 
	注意：需注意，若在高渗溶液中放置时间过长，细胞外基质会降解；反之，若在高渗溶液中振荡时间不足，则细胞无法充分溶解，烧杯中将残留细胞碎片。</li>
	<li>用15 mL 0.5% Triton X-100洗涤30分钟，随后用15 mL PBS洗涤15分钟。每颗心脏需单独进行脱细胞处理。</li>
	<li>将细胞外基质在液氮中速冻，然后使用预冷的研钵和研杵将冷冻的心脏细胞外基质研磨成粉末。</li>
	<li>将研磨后的基质粉末悬浮于含1%抗生素的PBS中。通常加入的体积为300 µL。将悬浮液置于冰上，高功率超声处理30–60秒。 
	注意：必须确保样品始终保持低温。需注意，由于蛋白聚糖含量高，该悬浮液黏度极高。</li>
	<li>采用Bradford法测定蛋白浓度。 
	注意：应确保悬浮液中含有抗生素和抗真菌剂。青霉素/链霉素是最常用且推荐的试剂。</li>
</ol>
8. 通过免疫组织化学评估核转位&#160;
<ol>
	<li>使用 PBS 中终浓度为 20 µg/mL 的心脏细胞外基质对培养皿和载玻片进行包被。向一个 100 mm 培养皿中加入 500 µL 心脏细胞外基质溶液用于包被，向一张载玻片上加入 150 µL 终末细胞外基质溶液。</li>
	<li>在培养的大鼠新生心肌细胞中加入浓度为 50 µg/mL 的 IRF5D，作用 24 小时以抑制 IRF5。对照组心肌细胞培养物不做处理。</li>
	<li>通过免疫荧光法评估 IRF5 从细胞质向细胞核的转位，并使用共聚焦显微镜进行分析。绿色荧光标记代表 IRF5，蓝色荧光标记为细胞核的 DAPI 染色。</li>
	<li>加入一抗抗-IRF5 抗体。一抗在 PBS 中按 1:200 稀释。将载玻片在 37 °C 下孵育 30 分钟，随后进行三次每次 5 分钟的洗涤步骤。二抗为 Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体。</li>
	<li>将二抗在 PBS 中按 1:1,000 稀释。在 37 °C 下孵育二抗 30 分钟。使用 DAPI 实现细胞核染色。将 DAPI 在 PBS 中按 1:1,000 稀释。总共洗涤载玻片三次，每次 5 分钟，并在第三次也是最后一次洗涤步骤中加入 DAPI。</li>
	<li>利用共聚焦显微镜捕捉转位过程，并如前所述测量细胞核和细胞质中的荧光强度10。绿色荧光标记代表 IRF5，蓝色荧光标记为细胞核的 DAPI 染色。细胞核呈蓝色且其中含有绿色标记的细胞表明 IRF5 已被激活并从细胞质转位至细胞核。当 IRF5 未被激活时，绿色标记存在于细胞质中。</li>
	<li>使用 40X 油镜通过共聚焦显微镜对荧光标记的细胞进行分析。IRF5 检测时激发波长为 488 nm，发射波长大于 530 nm。DAPI 观察时激发波长为 360 nm，发射波长为 460 nm。</li>
</ol>
9. 统计学
<ol>
	<li>进行组内和组间重复测量的方差分析（ANOVA），并在方差分析后采用经Bonferroni校正的Student t检验。数据以均值的标准误表示。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

研究目的是设计一种IRF5抑制剂，以阐明IRF5在Tsk/+小鼠心脏炎症、纤维化和血管功能中的作用。研究发现，IRF5D未诱导细胞增殖或凋亡；此外，炎症减轻，血管功能得到改善。这些数据表明，IRF5在Tsk/+小鼠心脏炎症和纤维化的发生发展中具有重要的机制性作用，并具备作为治疗靶点的潜力。
第一步是设计一种抑制剂。在设计肽段时，需要考虑多个因素：序列长度、二级结构、易氧化残基、氨基酸组成、酰胺化与封端、N-末端氨基酸和C-末端氨基酸，以及配体连接方式。理想的序列长度为10至15个残基，以确保最佳的总体产率、更少的杂质以及降低成本。需要注意避免形成β-折叠等二级结构，因为β-折叠可能导致大量缺失序列的产生。应避免使用易氧化的残基，以防发生副反应而影响肽段的活性。为了控制溶解性、合成效率和纯化效果，肽段中疏水性氨基酸的比例应低于50%，并确保含有足够数量的带电残基。N-末端和C-末端应选择不带电荷的形式。避免在N-末端使用谷氨酸，避免在C-末端使用半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸。在肽段与配体之间添加一个间隔基，以最小化折叠效应。因此，可能需要将其以无电荷的酰胺形式进行屏蔽。
<p c...

细胞生长和细胞死亡免疫反应的调控是干扰素调节因子转录因子家族功能的核心。IRF5在调控促炎性的1型免疫反应与以组织修复为目标的2型免疫反应之间发挥关键作用。IRF5在癌症1以及自身免疫疾病2,3,4,5中具有重要作用。
紧皮小鼠（Tsk/+）是由于纤维蛋白-1基因发生重复突变而形成的组织纤维化和硬皮病模型。该突变导致皮肤紧绷以及结缔组织增加。这些小鼠会出现心肌炎症、纤维化，最终发展为心力衰竭5,6,7,8,9。硬皮病是一种自身免疫性纤维化疾病，在美国约影响15万名患者6。该疾病的主要特征是包括心脏在内的内脏器官发生纤维化7,8,9,10,11。
本研究的性质要求设计一种抑制性多肽。与使用噬菌体展示的传统方法相比，选择了基于软件的方法，因为该方法更简便且耗时更少。利用RCSB数据库来识别合适的结合位点12。为了研究新设计的多肽与重组蛋白之间的相互作用，并重点关注其结合参数，采用了称为生物膜干涉技术的方法。生物膜干涉是一种基于生物传感器的技术，通过生物传感器与结合样品来测定结合亲和力、结合速率和解离速率。该生物传感器可用荧光、化学发光、放射性或比色法进行标记。检测原理基于质量的增加或减少，分别对应结合与解离过程13,14。本研究的目的是阐明IRF5在心肌炎症和纤维化中的作用，旨在深入了解IRF5在组织纤维化及硬皮病发展中的功能。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;吐温 X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford 试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生物传感器</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 底物</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>PBS 中 1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>PBS 中 1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>ECL plus</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>经过多次尝试与错误后，我们最终重新选用该试剂</td></tr><tr><td>Eclipse TE 200-U 显微镜，配备 EZ C1 激光扫描软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>PBS 中 1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>HRP&amp;nbsp; 抗山羊抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>TBS 中 1:10,000 稀释</td></tr><tr><td>HRP 驴抗小鼠抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>TBS 中 1:10,000 稀释</td></tr><tr><td>ICAM-1 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>PBS 中 1:200 稀释</td></tr><tr><td>IRF5 抗体 (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Micro plate reader Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP 中性粒细胞标志物</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>PBS 中 1:200 稀释</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>蛋白-蛋白结合检测</td></tr><tr><td>Peptide design&amp;nbsp; Medit SA 软件</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组 IRF5 蛋白合成</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>蛋白表达与合成服务</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>药房</td><td></td><td>受控物质 III 类，需处方&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X 三目变倍解剖立体显微镜，带鹅颈 LED 灯</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 脱盐柱</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>内皮基础培养基 EBM Bullet 试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>试剂盒含生长补充剂</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&amp;nbsp;Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX 凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo 软件</td><td>Medit, Palaiseau, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 缓冲液</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

紧皮小鼠离体血管舒张及细胞外基质的分离

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

干扰素调节因子5（IRF5）对于细胞决定其产生促炎性或抗炎性反应至关重要。IRF5能够使细胞在不同信号通路之间转换，这一特性使其成为极具吸引力的治疗靶点。我们利用分子建模软件设计了一种模拟肽IRF5D，用于小分子和肽类的设计。
IRF5D 抑制了 IRF5，减少了紧皮小鼠（Tsk/+）细胞外基质的改变，并改善了内皮依赖性血管舒张功能。通过生物膜干涉技术结合实验测定，IRF5D 与重组 IRF5 的解离常数（Kd）为 3.72 ± 0.74 × 10-6 M。使用不同浓度的 IRF5D（0 至 100 µg/mL，处理 24 小时）处理内皮细胞（EC）后，细胞增殖和凋亡未发生显著变化。对 Tsk/+ 小鼠给予 IRF5D 治疗（1 mg/kg/天，皮下注射，持续 21 天）。经 IRF5D 治疗后，IRF5 和 ICAM 的表达水平降低。通过检测面部动脉的血管舒张反应发现，接受 IRF5D 治疗的 Tsk/+ 小鼠内皮功能较未接受 IRF5D 治疗的小鼠得到改善。作为一种转录因子，IRF5 可从细胞质转运至细胞核。通过在不同心脏细胞外基质上培养心肌细胞并进行免疫组织化学染色，评估 IRF5 的转位情况。与未接受 IRF5D 治疗的动物相比，经 IRF5D 处理（50 µg/mL，24 小时）的 Tsk/+ 小鼠心肌细胞中 IRF5 阳性细胞核数量减少。这些结果表明，IRF5 在 Tsk/+ 小鼠的炎症和纤维化过程中发挥着重要作用。

结果表明 图1 展示如何设计一种多肽。 图1左上图显示了IRF5中被多种激酶磷酸化的区域（位于两个黄色箭头之间，氨基酸425-436）。 图1，右上方显示一个黄色椭圆形区域，为IRF5的磷酸化结构域结合位点。将3DSH的二聚体结构旋转后，可观察到位于螺旋2（aa303-312）左侧的一个裂隙或凹谷，该位置即为IRF5的磷酸化尾部结构域在完全激活状态下预期结合的位点即，丝氨酸磷酸化），形成同源二聚体并进入其假定的生物学活性状态。
在图2中展示了通过生物膜干涉技术测定的结合活性。为确定诱饵肽IRF5D无细胞毒性，在用不同浓度的IRF5D处理细胞后，检测了细胞增殖和凋亡情况（图3）。经IRF5D处理Tsk/+小鼠后，炎症标志物ICAM-1和IRF5的表达水平均降低，该结果通...

我们描述了从C57Bl/6J对照小鼠、紧皮小鼠以及用IRF5抑制肽处理的紧皮小鼠中分离心脏细胞外基质的方法。同时，我们还描述了对来自C57Bl/6J小鼠、紧皮小鼠以及用IRF5抑制肽处理的紧皮小鼠的离体血管进行的血管舒张研究。

干扰素调节因子5（IRF5）在细胞决定其产生促炎性或抗炎性反应过程中起着关键作用。IRF5的……

这些用于分离细胞外基质和进行离体血管舒张实验的整体目标是研究IRF5抑制性肽在啮齿类动物中的治疗作用。该方法有助于解答细胞外基质的变化如何增强或减轻疾病进展的问题。血管舒张研究的主要优势在于，能够在无需考虑所有信号通路组分的情况下，使我们深入了解体内的生理过程。心脏细胞外基质的分离方法可应用于其他器官，如后肢或肺。当我们开始关注紧皮小鼠中 fibrillin-1 的重复时，首次产生了这一想法，并认识到细胞外基质改变对细胞行为的影响。在对小鼠进行麻醉并做好手术准备后，使用剪刀切开皮肤。从胸部向上切开至下颌骨外侧，注意不要扰动下颌前方的深层组织。随后通过去除周围软组织游离出筋膜动脉，操作时需小心避免损伤该动脉。用MOPS缓冲液浸泡暴露的组织，以保持其活性。完全暴露筋膜动脉后，用镊子夹住该动脉第一分支远端、即将切断位置近端的血管段。随后，将其从主干动脉上切断，并用镊子夹住筋膜动脉。切断来自fascialis的两个分支，然后轻轻提起血管，同时切断其与周围组织的连接，直至到达分叉处。在分叉处，切断两条子动脉，以游离血管，并将其转移至含有MOPS缓冲液的培养皿中，保持湿润直至使用。为测量血管舒张功能，首先准备对血管进行套管插管。使用末端直径为125至175微米的玻璃移液管，装入MOPS缓冲液。同时将MOPS溶液注入溶液储液池中。现在对分离的血管进行插管。用眼科缝线将它们绑在玻璃移液管上。务必防止移液管中产生气泡。接着，将血管腔室安装在配有摄像装置的倒置显微镜上。通过视频测径系统运行视频，以在屏幕上测量血管。现在采用两步法对血管加压。首先，将装满液体的莫氏（Mops）储液器抬升至高于血管的位置，以产生20毫米汞柱的压力。使用拖把将管路与容器连接打开。当容器加压时，检查扎带周围及容器全长是否有泄漏迹象。若未发现泄漏，升高储液罐以产生60毫米汞柱的压力。然后再次检查容器是否存在泄漏。确认无泄漏且压力保持稳定后，在此压力下平衡容器30分钟。平衡完成后，检测血管对目标化合物的舒张反应。首先通过加入U46619使血管收缩至原来的一半到四分之三。让溶液孵育血管6分钟以达到稳定状态。然后，逐渐将测试化合物（如乙酰胆碱）加入浴槽溶液中。每两分钟将浴液中测试溶液的浓度增加10倍，从0.00001摩尔开始，逐步增加至0.01摩尔。血管舒张的变化引发了关于信号传导的疑问，但我们的研究重点是心脏。为了减少动物使用，我们选择分离心脏细胞外基质，以专注于从外部启动的信号传导。首先，从麻醉小鼠体内取出心脏，转移至含有15毫升高渗1%十二烷基硫酸钠的烧杯中。将溶液置于室温下，在摇床上轻轻搅拌18小时。第二天，更换为15毫升5% Triton X-100溶液，作用30分钟，随后更换为15毫升PBS溶液，作用15分钟。然后将细胞外基质（ECM）与液氮在1.5毫升微量离心管中迅速冷冻。待组织冻结后，将其转移至

vasodilation-isolated-vessels-isolation-extracellular-matrix-tight

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

隔离容器的血管扩张和细胞外基质的紧皮肤小鼠隔离

我们介绍一种用于在原生、完整的微血管内皮中观察和操控钙信号的方法。从供应骨骼肌的小阻力动脉中 freshly...

从小鼠阻力动脉中分离微血管内皮管

在伤口愈合、炎症和肿瘤发生过程中，细胞外基质会发生显著的重塑。本文介绍一种新型的活体免疫荧光显微技术，可利用落射荧光或双光子显微镜，以高空间和时间分辨率可视化纤维状以及网状基质成分的动态变化。...

长期活体免疫荧光成像技术用于观察组织基质成分：基于落射荧光与双光子显微镜的方法

落射荧光显微镜，双光子显微镜，活体成像，免疫荧光，细胞外基质，胶原蛋白，基底膜，组织重塑，肿瘤微环境，炎症，纤维化

小鼠背侧皮肤折叠窗模型展示了一个肌皮瓣急性持续性缺血区域的可视化图像。活体落射荧光显微镜技术可用于对微血管系统进行直接、重复的观察，并实现血流动力学的定量分析。形态学与血流动力学结果还可进一步与组织学及分子生物学分析结果进行关联。...

小鼠背侧皮肤折叠窗模型中的缺血性组织损伤：一种用于研究急性持续性缺血的皮瓣模型

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本文介绍了一种分离完整小鼠乳腺组织以研究细胞外基质（ECM）表达及导管形态的实验方案。从小鼠第4对腹部乳腺中获取8至10周龄未产雌性小鼠的乳腺组织，经中性缓冲甲醛固定后进行切片，并采用免疫组织化学方法对细胞外基质蛋白进行染色。...

完整小鼠乳腺腺体的分离及其细胞外基质表达与腺体形态学分析

本文介绍了一种通过将通透性促进剂注射到小鼠皮肤真皮层来检测血管渗漏的实验方案。该技术可用于评估分子促进或抑制血管渗漏的能力，或用于研究调控血管通透性的分子机制。...

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本文介绍了一种利用原代成纤维细胞进行体外划痕实验的方法，以及一种在小鼠中进行的体内皮肤伤口愈合实验方案。这两种实验均为评估体外和体内伤口愈合的简便方法。...

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本文展示了从小鼠脑实质小动脉中大量制备完整脑微血管内皮"管状结构"的方法，用于研究脑血流调节机制。此外，我们还阐述了该内皮细胞研究模型在荧光成像和电生理学检测中的实验优势，可应用于关键细胞信号通路的分析，包括细胞内[Ca2+]浓度变化和膜电位变化。...

小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析

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紧皮小鼠离体血管舒张及细胞外基质的分离

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