在支撑脂双层配体纳米簇阵列

该技术的总体目标是在支撑的脂质双层中制造一系列蛋白质纳米簇，这与用于细胞生物学应用的敏感表面显微镜技术兼容。这种方法可以帮助回答细胞生物物理学领域的关键问题，特别是配体的纳米聚集如何影响 T 细胞活化和粘附。该技术的主要优点是它在标准生物物理实验室中易于重现，并且与先进的表面敏感显微镜技术兼容，例如 TIRF 和 RICM。

虽然这项技术旨在提供对免疫学的见解，但它可以应用于其他细胞类型，在细胞生物学、肿瘤学和组织工程中具有潜在应用。要开始此过程，请按照文本方案中的概述清洁玻璃盖载玻片和观察室。然后，将 70 微升 2% 二氧化硅珠悬浮液逐滴沉积到倾斜 15 度的盖玻片上。

在悬浮液干燥时，每 15 秒将玻璃杯翻转 90 度，持续 1 分钟。创建紧密堆积的单层珠子并避免形成多层和油簇至关重要。这就是为什么需要优化微珠溶液的浓度和体积以及玻片的亲水性的原因。

液体蒸发后，将载玻片放入射频 magnatron 溅射装置内，放在距离铝硅靶材 105 毫米的旋转台上。在此之后，使用涡轮分子泵将沉积室中的压力降低到负四帕斯卡的 2.6 乘以 10。引入通量为每分钟 10 标准立方厘米、压力为 0.8 帕斯卡的纯氩气气氛。

接下来，打开射频发电机。等离子体稳定后，在保持快门关闭的同时溅射 2 分钟，以去除目标表面可能存在的杂质。打开快门，让溅射继续 60 分钟，在载玻片上沉积一层 200 纳米厚的铝。

然后切断氩气的流动。关闭闸阀，将涡轮分子泵与沉积室隔离。之后，用干净的氮气对腔室进行排气，使其达到环境压力。

从腔室中恢复镀铝载玻片。将回收的玻片在室温下浸入超纯水中，并以 50 瓦和 50 赫兹的功率进行超声处理 30 秒。接下来，将 0.5 毫米的 APTES 沉积在干燥器的底部。

将载玻片放在陶瓷网格上。将网格放入干燥器中。将干燥器连接到隔膜泵。

然后以最大功率运行泵 30 分钟以产生低真空。关闭干燥器的阀门，然后关闭泵。加热至 50 摄氏度 1 小时。

在此之后，打开干燥器并收集载玻片。将收集的玻片放在 PTFE 支架上。存入 2 毫升每毫升 25 微克溶解在 PBS 中的生物素。

让玻片在室温下静置 30 分钟。然后用 PBS 冲洗 10 次。将玻片在氢氧化钠和 PBS 溶液中于室温下孵育过夜。

之后，用超纯水冲洗载玻片 10 次。清洁 Langmuir 槽后，将 PTFE 托盘放入槽的 PTFE 外壳中。然后用超纯水填充。

将测得的压力设定为零毫牛顿/米。使用气密玻璃金属注射器，将 30 微升每毫米 1 毫克的 DOPC 和氯仿溶液沉积在水面上。关闭 PTFE 屏障，直到达到每米 27 毫牛顿的所需压力以压缩脂质单层。

接下来，使用电动夹具将准备好的载玻片浸入 PTFE 外壳中。将载玻片固定在垂直于气-水界面的夹具中。以每分钟 15 毫米的速度通过界面抬起载玻片，同时保持每米 27 毫牛顿的恒定压力。

然后，将载玻片水平放置在 PTFE 托盘上方的水面上。接下来，使用金属镊子将载玻片向下推入 PTFE 托盘中，将其浸入超纯水中。使用镊子将装有玻片的 PTFE 托盘转移到装满超纯水的结晶器中。

将涂层载玻片转移到水下观察室中。在此之后，关闭腔室，确保内部有大约 1 毫升的水。另一个微妙的步骤是在水下组装样品室。

并且应该绝对避免与沉积双层的空气接触，因此要确保这一点，请使用大量的水并确保整个组装过程可以在水下进行。将组装好的腔室从水中取出，检查以确保腔室防水且无泄漏。加入 500 微升 PBS，然后从腔室中取出 500 微升液体。

重复此过程 10 次，以用 PBS 完全替换腔室中的 1 毫升超纯水。接下来，将每毫升 100 μg 牛血清蛋白引入观察室。在室温下孵育 30 分钟。

在此之后，从腔室中取出并加入 500 微升，冲洗双层，10 次。然后，用配体功能化，沉积细胞，并观察文本方案中概述的蛋白脂质纳米模式和 SLB 流动性。在该协议中，使用珠掩模通过铝的受控沉积来创建二次金属掩模。

然后，去除珠罩，留下一层带孔的铝。接下来，将称为 APTES 的有机氨基硅烷沉积在气相中，然后在水相中沉积 BSA-生物素。然后，去除铝，露出纳米级蛋白质斑块。

最后，用支持的脂质双层回填点间空间。然后拍摄纳米点和支撑脂质双层的落射荧光图像。合成图像显示与脂质双层完美互补，脂质双层独特地沉积在蛋白质点周围，但不沉积在它们上。

在新鲜沉积的支撑脂质双层的落射荧光图像中，蛋白质点在明亮的脂质海洋中显示为黑点。然而，在连续光漂白 50 秒后，图像在由场振膜划定的区域内显示一个光晕，表明脂质是可移动的。对沿场振膜边缘的平均强度分布的分析，以及该强度在漂白过程中随时间的衰减，表明扩散常数为每秒 5 平方微米。

如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。在铝沉积过程中保持非常干净的条件，并仔细校准沉积曲线非常重要。按照此过程，可以进一步对有图案的载玻片进行功能化。

例如，通过在双层中添加另一个生物分子。我们用它来模拟抗原植物性细胞，以研究 T 细胞的活化。因此，在开发之后，这种技术应该会引起不同的受众的兴趣。

例如，组织工程师可能希望将其用作培养人造组织的支架，而肿瘤学家可能会将其用作提出有关添加癌细胞的基本问题的平台。观看此视频后，您应该对如何在支撑脂质双层中构建蛋白质纳米簇区域有很好的了解，这与先进的显微镜技术兼容。虽然我们用它来研究 T 细胞，但我们相信这种底物有可能成为研究任何类型细胞与受控模式蛋白脂质膜相互作用的首选平台。