一种用于评估抗菌疗效的免疫健全啮齿类动物肺炎稳健模型S. pneumoniae,H. influenzae,K. pneumoniae,P. aeruginosa或A. baumannii

本非手术经支气管感染方法的总体目标是在免疫功能健全的啮齿类动物中建立稳定的细菌性肺炎模型。该方法通过在免疫功能健全的重度肺炎模型中评估潜在治疗手段的有效性，为抗菌药物的发现与开发提供了重要价值。该技术的主要优势在于，它能够建立稳定且可重复的肺部感染，适用于多种细菌分离株，包括那些通常需要动物处于中性粒细胞减少状态的菌株，或在其他方法中难以形成有效感染的菌株。

通常，初次接触该操作的人员会遇到困难。正确的插管是一种盲操作，需要掌握恰当的手感，以确保将导管插入气管而非食管。对每位科研人员而言，正确的插管手法可能有所不同。

导管的确切角度可能因人而异。关键在于触诊气管的软骨环隆起。本技术将由本实验室的科学家Cindy Mininger进行演示。

首先，根据文字方案所述，从过夜液体培养物制备盐水细菌悬液，或如本处所示，从琼脂平板上制备。使用无菌接种环刮取琼脂平板表面的过夜培养菌落，将收获的菌体转移至5 mL无菌生理盐水中，直至形成浑浊、不透明的菌悬液，并轻轻涡旋振荡使菌液均匀。

按照文本方案，对样品进行连续稀释，然后从每种稀释液中取一份等分试样进行平板接种。在制备琼脂并准备好感染过程所需的工具后，根据文本方案，将九毫升琼脂分装至无菌试管中，然后将试管放入水浴中，直至琼脂温度平衡至约 42 摄氏度。将一毫升先前制备的生理盐水细菌悬液加入该试管的琼脂中。

然后，将离心管反复倒置数次以混匀，并将其放回水中。在靠近水浴的工作台面上放置一张洁净的一次性垫膜。为准备工作台面和插管装置，首先根据文本方案对金属套管和聚乙烯导管进行灭菌，然后将其连同玻璃储存管一起转移至工作台面。

然后，取下储存管的管盖，将套管的手柄端滑入管子的开口端。使用无菌镊子从烧杯中取出一段聚乙烯导管，将其穿过无菌金属套管内部，确保其可自由移动。用永久性记号笔在预定位置做好引导标记。

接下来，将无菌一次性25号针头套在聚乙烯导管的自由端，使针头向导管内滑入数毫米。然后，用无菌生理盐水填充一支新的一次性1毫升注射器。将注射器连接到已安装在聚乙烯导管上的针头，并将全部生理盐水推注通过导管。

将使用过的注射器丢弃至锐器容器中。然后，从水浴中吸取基于琼脂的接种物，注入新的无菌一次性1毫升注射器内。重新安装25号针头和导管，通过推动推杆使琼脂流经导管，直至导管完全充满琼脂为止。

按照文本方案麻醉大鼠后，将动物仰卧置于一次性垫上，头部朝右，尾部朝左。接着，将金属导管的自由端插入动物口腔内。旋转导管，使自由端向上倾斜，并借助轻微扭转动作轻柔地向前推进，小心绕过喉部结构，进入气管。

通过轻轻前后滑动套管数次，同时用左手食指触诊气管软骨环，确认套管插入的是气管而非食管。为确保正确插入气管而非食管，应轻微来回移动套管，并感受是否存在软骨环的隆起。若套管顺畅滑入咽喉且无法触及隆起结构，应立即取出装置并重新尝试。

当导管到达气管分叉为左右支气管的位置时，应轻轻向动物的左侧扭转，以确保导管插入左支气管。常见的错误是将接种物插入肺部过浅，这可能导致气道阻塞并抑制呼吸。当导管调整至合适角度时，应能顺利滑入左支气管，并顺畅推进至适当深度。

将金属套管向前推进，直至其末端到达左肺深度的一半至四分之三处，参考先前标记的定位记号以确认已达到适当深度。保持金属套管位置不变，根据聚乙烯导管上预先标记的定位记号，将导管向前推进数毫米，确保其仅伸出金属套管末端即可，避免刺穿肺组织。当两根套管均就位后，使用连接的注射器将100微升琼脂悬浮液注入左肺大叶深部。

回撤数毫米导管，轻柔取出完整的插管装置。将其放回玻璃储存管中，并将动物转移至新的笼具中恢复。按照前述大鼠的操作方法，使用适合小鼠尺寸的设备准备操作台和套管。

使用无菌的一次性1毫升注射器和无菌25号针头，将无菌生理盐水注入玻璃微量注射器中。然后，将生理盐水通过重新组装的装置冲洗一遍。接着，使用一支新的无菌一次性1毫升注射器和无菌25号针头，将琼脂接种物注入微量注射器中。

然后，重新组装装置，并通过管路冲洗琼脂，直至管路完全充满琼脂。按照文本方案麻醉小鼠后，将动物置于与大鼠相同的方向位置，并以稳定而轻柔的压力，以类似于大鼠的方式进行气管插管。操作时应避免用力，因小鼠的操作技术更为精细。

通过触诊气管软骨环确认套管已插入气管。轻轻转动并推进套管进入左支气管，利用预先标记的引导刻度将其深入插入肺部。固定金属套管后，将聚乙烯导管向前推进数毫米，并注入 20 µL 琼脂悬浮液。

图中显示的是肺组织匀浆样本经连续稀释后进行三重平板接种，在琼脂平板上生长出的菌落的代表性示例。如本图中肺炎链球菌（S. pneumoniae）所示，对于大多数细菌分离株，感染后肺组织中的细菌载量通常比基线对照高出数个对数级（CFU，以10为底的对数），即使在感染后96小时仍可观察到该现象，且动物个体间的差异较小。在本实验中，两种化合物分别针对喹诺酮敏感或喹诺酮耐药的肺炎链球菌分离株进行评估，以证明该肺部感染模型可在先导化合物系列优化过程中用于支持构效关系研究。

每个符号代表从一只大鼠肺部分离得到的菌落形成单位（CFU）。图中所示为利用免疫功能正常小鼠的剂量-效应数据建立的 E max 模型，这些小鼠经肺部感染肺炎链球菌（S. pneumoniae）或流感嗜血杆菌（H. influenzae）分离株，用于确定新型多肽脱甲酰基酶抑制剂的药代动力学和药效学靶标。圆形符号代表每组四至五只小鼠在接受不同剂量化合物治疗后的平均细菌负荷。

空心圆表示曲线下自由面积，实心圆表示药物浓度-时间曲线下面积超过最低抑菌浓度的部分。掌握该技术后，每只动物的操作时间约为30秒，每注射器琼脂接种物可接种五到六只动物。观看本视频后，您应能够充分理解如何实施这种非手术经支气管感染方法，并能够利用该方法建立由多种不同细菌分离株引起的肺部感染模型。

充满活力的器乐