Name: 颈动脉肿瘤细胞注射，产生脑转移瘤小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学习通过颈动脉注射肿瘤细胞建立小鼠脑转移瘤模型的显微外科技术。该方法具有高重复性和低变异性，为评估新疗法和研究脑转移生物学提供可靠平台。

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作者无致谢。

伦理声明：所有动物实验均经德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 准备注射用癌细胞
<ol>
	<li>在注射前一至两天接种癌细胞。使用添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基，除非特定细胞系在文献中建议使用特殊培养基。</li>
	<li>手术当天，当细胞生长至70–80%融合度时进行收获：先用无血清培养基洗涤一次，随后在37 °C下用0.25%胰蛋白酶消化1–2分钟。加入含10% FBS的DMEM/F12培养基以终止0.25%胰蛋白酶的消化作用。</li>
	<li>以80 × g离心3分钟。用无血清培养基洗涤细胞两次，以去除残留血清，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，浓度为1–5 × 106 个细胞/mL，具体浓度根据细胞系而定。置于冰上保存，直至注射时使用。 
	注意：本研究中使用了MDA-MB-231乳腺癌细胞和K1735黑色素瘤细胞，两种细胞系均以2 × 106 个细胞/mL的浓度使用。胰蛋白酶消化时间应尽可能短，过度处理可能影响转移实验的结果。</li>
</ol>
2. 准备小鼠以进行肿瘤细胞注射
<ol>
	<li>通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮/赛拉嗪混合液（氯胺酮 100 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>通过轻捏动物足部确认麻醉完全，并观察其无反应。</li>
	<li>将小鼠置于玻璃板（用于灌注蛋白凝胶）上，并用橡皮筋固定。</li>
	<li>如有必要，通过剃毛或涂抹少量脱毛剂并用纸巾擦去毛发的方式去除颈部毛发。注意：若使用裸鼠，可跳过此步骤，因其无体毛。</li>
	<li>用聚维酮碘和 70% 酒精清洁颈部皮肤。</li>
	<li>将小鼠置于解剖显微镜的载物台上。</li>
	<li>使用手术刀片在皮肤上做一个约 1 cm 长的切口。</li>
	<li>用有齿镊钝性分离肌肉，以暴露下方的颈动脉。</li>
	<li>用手术镊将颈动脉与邻近的迷走神经分离。</li>
	<li>使用手术镊从棉球上取下部分棉花，润湿后捏成较小的棉球。将此经缓冲液润湿的棉球置于预定注射部位的颈动脉下方。</li>
	<li>在棉球远端和近端各放置一根缝线并打松结。收紧近端结扎线以阻断血流进入注射部位。</li>
	<li>若棉球处的颈动脉充满新鲜红色血液且压力充分，即可进行癌细胞注射。</li>
</ol>
3. 将癌细胞注射至颈动脉
<ol>
	<li>涡旋混匀后，用注射器吸取100 µl癌细胞悬液。</li>
	<li>在解剖显微镜下，将31 G针头（斜面向上）缓慢插入位于棉球上方的颈动脉管腔内。</li>
	<li>缓慢将注射器中的细胞注入颈动脉。当缓冲的癌细胞进入循环系统时，可在显微镜下观察到附近血管和肌肉颜色发生变化，表明注射成功。</li>
	<li>当全部体积注射完成后，轻轻提起远端颈动脉，防止反流。</li>
	<li>迅速扎紧远端结扎线，完成注射过程。</li>
	<li>注射完成后，在解剖显微镜下收紧结扎线，并用显微剪修剪多余的丝线。将分离的肌肉复位以覆盖伤口部位，用两枚皮肤钉闭合皮肤。</li>
</ol>
4. 手术恢复
<ol>
	<li>将手术后的动物移至加热垫上进行恢复。动物恢复意识可能需要 30 - 60 分钟。在此期间，给予布托啡诺（0.05 mg/kg） 通过 皮下注射作为术后镇痛。 &#160;注意：应根据您的&#160;经本地IACUC批准的方案。&#160;</li>
	<li>待动物苏醒并恢复至正常行为后，将小鼠放回饲养区域。术后数天内为小鼠提供凝胶食物。保留手术记录并存放于实验室内。</li>
</ol>
5. 非侵入性 在体 内 成像
<ol>
	<li>对于标记了荧光素酶报告基因构建体的细胞，使用以下方法测定癌细胞注射效率： 体内 成像系统14. 
	注意：为避免对实验动物造成过度应激，注射当天不进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastases%3A+epidemiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Brain metastases: epidemiology and pathophysiology.</a> J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).</li>
<li>Patchell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+management+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">The management of brain metastases.</a> Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).</li>
<li>Barnholtz-Sloan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+proportions+of+brain+metastases+in+patients+diagnosed+%281973+to+2001%29+in+the+Metropolitan+Detroit+Cancer+Surveillance+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System.</a> J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).</li>
<li>Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+brain+metastases+in+a+cohort+of+patients+with+carcinoma+of+the+breast%2C+colon%2C+kidney%2C+and+lung+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma.</a> Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).</li>
<li>Bendell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+metastases+in+women+who+receive+trastuzumab-based+therapy+for+metastatic+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma.</a> Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).</li>
<li>Clayton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+cerebral+metastases+in+patients+treated+with+trastuzumab+for+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer.</a> Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).</li>
<li>Romond, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+plus+adjuvant+chemotherapy+for+operable+HER2-positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer.</a> N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).</li>
<li>Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patient+perspective+on+brain+metastases+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A patient perspective on brain metastases in breast cancer.</a> Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).</li>
<li>Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+metastases+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">CNS metastases in breast cancer.</a> J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+determinants+of+brain+metastasis+of+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis.</a> Cell Biosci. 1 (1), 8(2011).</li>
<li>Fidler, I. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+selectivity+for+implantation+survival+and+growth+of+B16+melanoma+variant+tumor+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines.</a> J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+PTEN+loss+by+exosomal+microRNA+primes+brain+metastasis+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth.</a> Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+family+kinases+as+novel+therapeutic+targets+to+treat+breast+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases.</a> Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).</li>
<li>Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+of+mammary+tumors+using+IVIS+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta2+is+a+molecular+determinant+for+site-specific+melanoma+metastasis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain.</a> Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成功进行颈动脉注射癌细胞的最关键步骤是：1）对小鼠实施深度麻醉，以准备手术操作；2）将颈动脉稳定地放置在棉质支撑物上方；3）在成功注射后对颈动脉进行牢固结扎。
在体视显微镜下进行稳定的手术操作通常需要约30分钟的深度麻醉。我们使用市售的现成氯胺酮/赛拉嗪混合制剂对小鼠进行麻醉。为避免潜在的过量风险，可将氯胺酮/赛拉嗪混合液用生理盐水按1:1或1:2比例稀释，以便更灵活地调节麻醉给药体积。 alternatively，非管制类药物三溴乙醇也可用作麻醉剂；然而，我们发现三溴乙醇容易降解，其作为有效麻醉剂的可靠性不如氯胺酮/赛拉嗪混合制剂。
颈动脉位置稳定且充分充盈血压，可极大地方便癌细胞注射；因此，我们强烈建议在显微镜下仔细调整动脉位置，充分准备后再进行注射，而不应在不理想条件下仓促操作。
在颈动脉注射侧，更多的癌细胞会滞留在血管系统中。有时，大量转移细胞可能迁移到大脑的对侧，导致濒死动物的双侧半球均出现明显的转移性病灶。
<p class="jove_content...

癌症向中枢神经系统（CNS）的转移是一种严重的疾病，可累及脑实质或软脑膜&#34;脑转移&#34; 在本文中均指此而言。它是主要的颅内恶性肿瘤，其发病率超过原发性胶质瘤 &#62; 10:11,2肺癌、乳腺癌和黑色素瘤是导致脑转移发生率最高的三大主要肿瘤性疾病。3,4近年来，新型癌症疗法取得了令人瞩目的进展，显著延长了众多癌症患者的生存期并改善了其生活质量。然而，在疾病复发后，脑转移的发生率正迅速上升。例如，抗HER2抗体曲妥珠单抗（trastuzumab，Herceptin）在HER2阳性乳腺癌患者中已显示出显著的临床疗效；但在这些患者中却出现了一种令人担忧的趋势：最初颅外全身性疾病对曲妥珠单抗治疗有反应的患者中，高达1/3后续会发展为脑转移5,6,7遗憾的是，脑转移患者对目前几乎所有治疗方法均不敏感，通常会经历生活质量的急剧恶化，且确诊后的一年生存率仅为约20%。8目前针对脑转移的治疗方法（包括类固醇、全脑放疗以及对部分患者实施的手术切除）仅为姑息性治疗，无法根治。9因此，脑转移正成为当今新型癌症疗法时代面临的下一个严峻挑战。为了应对患者在临床中每天所面临的未被满足的医疗需求，我们亟需更深入地理解脑转移的潜在机制，并利用这些知识开发新型治疗方法。
转移性癌细胞成功定植大脑需要执行一系列功能，这些功能由多种生物因素之间复杂的相互作用所介导，例如穿越血脑屏障（BBB）以及逃逸大脑固有的免疫防御机制10，这些特征在其中均未重现 离体 或 体外 系统。因此，正确且忠实地 体内 模型对于脑转移研究至关重要。一种传统的 体内 转移实验引入癌细胞 通过 尾静脉注射导致大多数细胞滞留在肺部。在这些模型中，由于肺部肿瘤负荷引起的动物死亡之前，极少产生脑转移病灶。11直接向脑内注射癌细胞可在中枢神经系统内产生稳定的肿瘤生长，该方法被广泛用于原发性胶质瘤的研究。然而，此类注射会破坏血脑屏障，并在注射部位造成创伤性损伤，这两点均对该模型的生理相关性构成重要质疑。另一种常用的癌细胞接种途径——心内注射，操作简便且可诱导癌细胞向中枢神经系统发生实验性转移。但该方法总会伴随中枢神经系统以外器官的转移灶形成，可能导致实验动物死亡。11因此，该模型的高度变异性使得其在动物数量有限的情况下，不适用于对生物学机制或治疗药物进行定量评估。
此处我们描述了建立实验性脑转移的实验步骤 通过 将癌细胞注射至颈总动脉。我们已采用该方法解析单个基因在脑转移级联过程中的作用，并评估治疗干预措施的有效性12,13该方法的主要优点是具有高度的可重复性和较低的变异性；主要缺点是进行显微手术所需的技术复杂性和操作灵巧性。

<table><tbody><tr><td>盐酸氯胺酮/盐酸赛拉嗪溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr><tr><td>常规体视显微镜 Leica M50</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>该显微镜为模块化设计，高度可配置，可适应特定的空间需求。</td></tr><tr><td>一次性外科手术刀</td><td>Integra Miltex</td><td>4-410</td><td>用于制作皮肤切口</td></tr><tr><td>组织镊子 - 1×2 齿</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td>用于钝性分离肌肉</td></tr><tr><td>Dumont #5 镜面镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td>用于分离并准备颈动脉以进行注射</td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td>用于剪断缝线</td></tr><tr><td>EZ Clip 器械包</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>用于伤口闭合</td></tr><tr><td>BD 胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>328438</td><td>用于细胞注射</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum &lt;em&gt;活体&lt;/em&gt;成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr></tbody></table>

颈内动脉癌细胞注射构建小鼠脑转移模型

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

转移，即恶性细胞在患者体内继发部位的扩散与生长，是导致 &#62; 90%的癌症相关死亡。近年来，新型疗法取得了令人瞩目的进展，显著延长了众多癌症患者的生存期并改善了其生活质量。然而，脑转移复发的发生率正迅速上升，而目前所有疗法仅具姑息性。因此，迫切需要建立良好的实验动物模型，以促进对疾病生物学的深入研究，并用于评估新型治疗方案的临床前效果。但是，标准的 体内 转移实验 通过 尾静脉注射癌细胞主要导致肺部转移性病灶；动物通常在脑转移灶出现明显生长之前，即因肺部肿瘤负荷而死亡。心脏内注射肿瘤细胞可使转移病灶出现在包括脑在内的多个器官部位；然而，该模型产生的肿瘤生长变异性较大，限制了其在评估治疗效果方面的应用价值。为建立可靠且一致的脑转移动物模型，本文描述了一种在小家鼠（*Mus musculus*）中诱导实验性脑转移的操作流程。Mus musculus) 通过 颈内动脉注射肿瘤细胞。该方法可获得大量具有相似生长特性和死亡特征的脑转移小鼠模型，从而有助于研究基本的生物学机制以及评估新型治疗药物。

评估注射质量有两个关键时间点。第一个时机是在注射过程中，操作者可通过观察血管颜色的变化来判断。在解剖显微镜下，注射不佳导致的渗漏可被轻易发现。将小鼠身体（图1A）及其颈动脉（图1B）稳定、牢固地放置在支撑用的棉球上，是实现颈动脉顺利且成功注射的关键因素。第二个评估注射质量的时机是术后无创成像。为此，通常在注射前将癌细胞在体外（ex vivo）用荧光素酶报告基因进行标记。为了尽量减少对动物的应激，活体（in vivo）成像通常在注射后24小时进行。成功的注射会导致颅内出现较强的癌细胞负荷，且仅有小鼠头部区域显示阳性信号（图2A）。
使用 体内 利用成像系统追踪荧光素酶标记的癌细胞，我们观察到注射后数天内信号强度最初下降；然而，能够在中枢神经系统（CNS）中增殖的癌细胞最终仍可分裂并产生不断增强的信号 ...

脑转移已成为一个迫切且尚未满足的医疗需求，其发病率不断上升，而治疗选择仍局限于姑息治疗。建立脑转移的实验动物模型 通过 颈内动脉注射癌细胞有助于疾病生物学机制的研究及新型干预方案的评估。

转移是指恶性细胞在患者体内继发部位的扩散与生长，导致了超过90%的癌症相关死亡。

本项通过颈动脉进行癌细胞显微注射的总体目标是在小鼠体内建立稳定可靠的体内实验性脑转移模型。该方法有助于回答脑转移研究领域中的关键问题，例如一种新的治疗方法是否可能对脑转移具有治疗效果。该技术的主要优势在于能够以高重复性和低变异性的特点，在体内高效构建实验性脑转移模型。通常，初次接触该技术的研究人员在初期会遇到困难，因为需要经过一定量的练习才能掌握在显微镜下将癌细胞注入小鼠颈动脉时保持手部稳定的操作。在进行实验前，先用添加10%胎牛血清的DMEM/F12培养基接种癌细胞，并在注射前培养一至两天。手术当天，从培养箱中取出细胞，当细胞融合度达到70%至80%时，用无血清培养基洗涤后收集细胞。接着，将细胞在37摄氏度下用0.25%胰蛋白酶孵育1至2分钟。随后，从培养箱中取出细胞，并向细胞中加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基以终止消化反应。以80 × g离心3分钟。随后，移除培养基，并用无血清培养基洗涤细胞两次，以去除残留的血清。接着，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将其重悬于HBSS中。然后，将细胞置于冰上保存，直至注射时使用。在此操作中，通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物使小鼠麻醉。通过轻捏动物的足部并观察其无反应来确认麻醉完全。接着，通过剃毛或使用少量脱毛产品去除颈部毛发。然后，将小鼠置于玻璃板上，并用橡皮筋固定。使用70%酒精在聚维酮碘中擦拭皮肤进行清洁。接着，用手术刀片在皮肤上做一个长约一厘米的切口。然后，使用手术镊钝性分离肌肉，暴露下方的颈动脉。用手术镊将颈动脉与邻近的迷走神经分离。随后，放置两根缝线。在棉球远端和近端各打一个松结。收紧近端的结以阻断血流进入注射部位。然后，用缓冲液润湿一小块棉球，并将其置于预定注射部位的颈动脉下方。然后，如果棉球上的颈动脉充满新鲜的红色血液且压力充足，则继续进行癌细胞注射。在此步骤中，将癌细胞悬液涡旋混匀，并吸取 100 µL 至注射器中。在解剖显微镜下，将31号针头（斜面向上）缓慢插入位于棉球上方的颈动脉管腔内。缓慢将注射器中的细胞注入颈动脉。当缓冲的癌细胞进入循环系统时，可通过观察附近血管和肌肉颜色的变化来判断注射是否成功。注射完成后，轻轻提起远端结扎线，以防止反流。然后迅速收紧远端结扎线以完成注射过程。注射完成后，收紧结扎线，并用显微剪刀剪去多余的丝线。将分离的肌肉复位以覆盖伤口部位，并用两个皮肤钉合器闭合皮肤。恢复期间，将动物转移至加热垫上。随后通过皮下注射给予布托啡诺，作为术后镇痛。待其恢复意识并重新表现出正常行为后，将小鼠送回饲养环境。术后数天内为动物提供凝胶食物。这些图像显示，经改造的 MDA-MB231 乳腺癌细胞在体外被标记了松散的 foraise 报告基因。从颈动脉注射后 24 小时开始，通过重复的活体成像系统成像，无创监测脑转移的发展情况。成像数据的定量分析表明，颈动脉注射后肿瘤负

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