Name: 鼠全层皮肤移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习小鼠全层皮肤移植技术，掌握BALB/c至C57BL/6模型的关键操作步骤。该方法无需显微外科技术，可用于研究同种免疫反应和移植物排斥机制，为移植免疫学提供可靠的实验模型。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为 R01AI077610。

所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》的规定，并经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（JHUACUC）批准。具体操作依据批准的ACUC方案MO13M292和MO13M370进行。
1. 供体皮肤采集
<ol>
	<li>使用异氟烷麻醉供体小鼠（诱导时挥发器浓度设为4%，通过小鼠麻醉面罩维持1-2%的浓度）。通过脚趾夹捏回缩反射监测麻醉深度。</li>
	<li>使用电动剃刀剃除动物背部毛发，并用10%聚维酮碘（例如，贝塔碘）进行消毒。</li>
	<li>使用无菌剪刀、手套及无菌操作技术，从髋部至颈部取下供体背部皮肤，在疏松结缔组织层面进行钝性分离。</li>
	<li>获取皮肤移植物后，通过颈椎脱位法处死动物。</li>
	<li>在显微镜下，使用精细的肌腱切断剪刀将结缔组织、脂肪组织和肉膜肌（panniculus carnosus）从背部皮肤上分离。肉膜肌是一层薄而透明的肌肉，负责皮肤的抽动运动。</li>
	<li>采用无菌器械操作技术，从背部皮肤上切取适用于10 mm × 10 mm至15 mm × 15 mm移植床的15 mm × 15 mm移植物。</li>
	<li>将移植物置于浸有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的纱布上，放入培养皿中并置于冰上保存。 
	注：一只供体小鼠可获取8–10个移植物。</li>
</ol>
2. 受体皮肤移植
<ol>
	<li>使用异氟烷麻醉受体小鼠（通过小鼠麻醉面罩，诱导浓度为4%，维持浓度为1%–2%）。通过脚趾夹捏回缩反射监测麻醉深度。</li>
	<li>给予0.02 mg/kg体重的丁丙诺啡，用于术后镇痛。</li>
	<li>剃除将要植入移植物部位的小鼠背部侧面毛发，并用10%聚维酮碘进行消毒。</li>
	<li>使用剪刀剪去一块10 mm × 10 mm至15 mm × 15 mm的方形皮肤。缺损面积应比移植物略大（约10%）。切割时尽可能表浅，注意保留肉膜（panniculus carnosus）及其表面的血管。肉膜可通过其可动性以及其表面走行的血管与深层筋膜相区分。</li>
	<li>将移植物放置于移植物床中，避免边缘出现皱褶。</li>
	<li>在四个角及每条边的中点处各放置一针缝线。每针缝合时，先将针穿过移植物，再穿过移植物床下方受体周围皮肤下的肉膜。</li>
	<li>移除麻醉面罩，在应用粘性绷带前让动物部分恢复清醒。</li>
	<li>用粘性绷带包裹受体小鼠，并在移植物上方覆盖折叠的纱布。制作绷带时可将两个绷带组合，剪去其中一个的粘性部分，并将两个吸收垫并置在一起。</li>
	<li>在恢复期间密切监测小鼠，确保绷带未限制胸廓扩张和呼吸。若呼吸频率下降，或动物出现喘息或浅呼吸，应立即移除绷带。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>术后给予恩诺沙星 5 mg/kg 以预防感染。</li>
	<li>将移植后的小鼠置于清洁笼盒中，并放置在可微波加热的加热垫上&#160;，直至其完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>术后观察小鼠 1 小时，然后将其送回饲养设施。</li>
	<li>术后第 7 天，按照步骤 2.1 的方法麻醉小鼠，仅剪开绷带的腹侧部分以拆除绷带。</li>
	<li>次日观察并触诊移植物，检查是否有结痂、收缩或硬化等迹象。若出现上述情况，表明移植物可能未实现充分血管化，应视为技术失败。</li>
	<li>每日监测排斥反应迹象。当移植物组织坏死面积 ≥90% 时，判定为排斥。</li>
	<li>对发生排斥的动物实施安乐死，并采集用于分析。</li>
</ol>

<ol><li>Furtmuller, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+Hind+Limb+Transplantation+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Oh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Microsurgical+Model+for+Heterotopic%2C+En+Bloc+Chest+Wall%2C+Thymus%2C+and+Heart+Transplantation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cervical+heart+transplantation+model+using+a+modified+cuff+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique.</a> J Vis Exp. , e50753(2014).</li>
<li>Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+identifies+selectins+that+regulate+T+cell+traffic+into+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts.</a> J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).</li>
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<li>Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+tail+skin+to+study+allogeneic+CD4+T+cell+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice.</a> J Vis Exp. , e51724(2014).</li>
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<li>Chen, H. D., Silvers, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Langerhans+cells+on+the+survival+of+H-Y+incompatible+skin+grafts+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats.</a> J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).</li>
<li>Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+and+limits+of+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Lessons and limits of mouse models.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495(2013).</li>
<li>Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surgical+technique+for+experimental+free+skin+grafting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Surg%22%5BJournal%5D)">A surgical technique for experimental free skin grafting in mice.</a> Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).</li>
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<li>Lee, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+Allograft+Rejection+by+Targeting+Immune+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism.</a> Cell reports. 13, 760-770 (2015).</li>
<li>Pollizzi, K. N., Powell, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+canonical+and+metabolic+signalling+programmes+in+the+regulation+of+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses.</a> Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).</li>
<li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+immunity%3A+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342, 1242454(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

自Medawar首次在人类研究中引入皮肤移植，随后在兔子和小鼠中应用以来，皮肤移植已成为研究同种异体免疫反应的宝贵模型6,7。在本论文中，我们介绍了一种利用背部上下区域皮肤进行的大规模、非血管化全层皮肤移植模型。迄今为止，已有多种替代方法被报道，包括使用小鼠尾部皮肤或耳部皮肤作为移植物来源8,9。这些模型具有操作简便的显著优势，适用于高通量实验。然而，尾部皮肤移植物中表皮朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞相对缺乏，会导致排斥反应延迟，并促进宿主对移植物的接受，尤其在主要组织相容性复合体（MHC）轻度不匹配模型中更为明显10,11。因此，全层躯干皮肤移植被认为是一种更为可靠的模型，更适合用于研究T细胞介导的急性排斥反应12。
此外，我们的模型采用简单的技术，无需高级的显微外科技能。手术时间较短（每只小鼠从麻醉开始到手术结束约10分钟），术后发病率和死亡率极低。总体手术死亡率（术后24小时内死亡以及拆除绷带前死亡）据报道为3.8%13。大多数并发症源于麻醉过量或包扎过紧，通过在术后即...

器官移植是终末期器官衰竭患者的首选治疗方法，随着外科手术和免疫抑制方案的进步，移植预后已显著改善。然而，长期免疫抑制伴随明显的副作用，因此建立促进免疫耐受的新策略仍是现代移植研究的目标。
为了开展移植领域的基础研究，探索同种异体移植物排斥反应的机制，并测试预防移植物排斥和促进长期耐受的免疫抑制策略，人们已开发出多种动物模型1-3。由于小鼠具有种类丰富且特异性明确的诊断与治疗用抗体，以及大量遗传背景清晰的近交系和转基因品系，已成为免疫学研究的主要模型。皮肤移植操作简便，无需特殊的显微外科技术，且术后易于观察。综上所述，小鼠皮肤移植已成为研究同种免疫反应多个方面的理想工具，包括抗原呈递、细胞迁移以及移植物排斥过程中的组织破坏等环节4,5。
本文展示了利用小鼠模型进行全层皮肤移植的逐步操作流程，并描述了确保移植皮肤成功植入所必需的关键步骤。

<table><tbody><tr><td>直显微镊</td><td>Sigma</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>弯显微镊</td><td>Aesculap</td><td>BD333R</td><td></td></tr><tr><td>弯Stevens肌腱剪</td><td>Aesculap</td><td>BC905R</td><td></td></tr><tr><td>梅奥组织剪</td><td>Sigma</td><td>S3146</td><td></td></tr><tr><td>显微持针器</td><td>Aesculap</td><td>BM563R</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Covidien</td><td>441218</td><td></td></tr><tr><td>6-0尼龙缝线</td><td>MWI</td><td>31849</td><td></td></tr><tr><td>塑料条创可贴&amp;#45;Aid</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td></td><td>从药房获取</td></tr><tr><td>10 cm培养皿</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119069131</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td></td><td></td><td>需持有美国药品执法局编号（DEA Number）；从医院药房获取</td></tr><tr><td>恩诺沙星</td><td>Bayer Health Care</td><td>186599</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠全层皮肤移植

Murine Full-thickness Skin Transplantation

小鼠全层皮肤移植是一种成熟的体内模型，用于研究同种免疫反应和移植物排斥。尽管其在人类中的应用有限，小鼠皮肤移植已广泛应用于移植研究。该操作易于学习和实施，无需精细的显微外科技术或长期培训。此外，该模型中的移植物排斥表现为高度可重复的免疫反应，可通过直接观察和触诊轻松监测。另外，在更复杂的移植模型中，可通过供体匹配或第三方皮肤移植物进行二次皮肤移植，作为评估供体特异性耐受性的替代且简便的方法。该操作的并发症较少，通常仅限于麻醉过量或术后呼吸困难。而移植物失败则较为常见，通常由移植物制备不佳、在移植床中位置不当或敷料放置不当所致。本文介绍了一种小鼠全层皮肤移植的实验方案，并详细描述了确保手术成功的关键步骤。

将绷带放置在受体小鼠身上是该操作中的关键步骤。皮肤移植物应置于受体躯干上，位于肩部、髋部与脊柱之间（图1）。绷带由折叠的纱布及两片塑料粘性绷带组合而成。将受体小鼠移植物朝下放置于绷带中央的纱布上。使用两把弯头显微镊，先拉紧绷带的下端，再将上端绕过小鼠背部覆盖至腹部。
在完全不匹配模型中，全层皮肤移植物通常在8至12天内被排斥。在轻微不匹配模型中，排斥反应较慢，变异较大，皮肤移植物的外观变化不明显，例如收缩或脱毛（图2）。急性移植物排斥通常始于移植物的肿胀和红斑。随后出现移植物干燥、收缩和结痂（图2B 和 C）。根据MHC不匹配程度和免疫抑制方案的不同，排斥也可能通过亚急性过程发生，表现为细微变化，如脱毛、色素沉着、真皮脊消失以及移植物体积减小。在这些情况下，被排斥的移植物呈现发亮、苍白、无毛且边缘不规则的外观（<str...

小鼠全层皮肤移植是一种研究同种免疫环境下排斥反应的成熟模型。本文中，我们将详细介绍进行BALB/c--&#62;C57BL/6全层皮肤移植的每一步操作流程。

小鼠全层皮肤移植是一种研究同种免疫反应和移植物排斥的成熟体内模型。尽管其存在局限性……

本视频文章的总体目标是完成全层皮肤移植，并描述成功实施该手术所需的关键步骤。小鼠全层皮肤移植是一种成熟的模型，用于研究同种免疫反应和移植物排斥。该操作简便，无需精细的显微外科技术。在此模型中，移植物排斥反应具有高度可重复的免疫学反应特征，可通过直接观察和触诊轻松监测。此外，通过使用供体匹配或第三方皮肤移植物进行二次皮肤移植，可构建更为复杂的移植模型，作为评估供体特异性耐受性的替代且简便的方法。根据文本方案麻醉供体小鼠后，使用电动剃须刀剃除动物背部的毛发。然后，使用10%聚维酮碘对皮肤进行消毒。用剪刀和钝性分离法，在乳晕结缔组织层面，从髋部至颈部取下供体背部皮肤。将背部皮肤置于显微镜下，用精细的肌腱切断剪分离结缔组织和肉膜层（panniculus carnosus）与皮肤。从背部皮肤切取 15 × 15 毫米的移植物，用于制备 10 × 10 至 15 × 15 毫米的移植床。将移植物置于浸有 PBS 的纱布上，放入培养皿中，并置于冰上保存。根据文本方案对受体小鼠进行麻醉。剃除动物背部侧面将要植入移植物区域的毛发，然后按每千克体重给予0.02毫克的丁丙诺啡，以缓解术后疼痛。使用10%聚维酮碘对局部区域进行消毒。用剪刀尽可能浅表地剪下一块10×10至15×15毫米的方形皮肤。注意保护位于其浅层的肉膜肌（panniculus carnosus）及走行于其上的血管。随后，将移植物置于移植床，避免边缘出现皱褶。接着，在移植物的四个角及各边中点处共放置八针缝线，将缝针先穿过移植物，再穿过移植床肉膜肌，位于周围受体皮肤下方。将折叠的纱布置于双层绷带上，然后将动物放置于绷带上，移植物一侧朝下，取下麻醉面罩以使动物部分恢复意识。随后，将绷带包裹住动物。移植过程中最关键的环节是宿主血管向移植物内生长，实现移植物组织的再血管化。解剖肉膜及正确包扎是最重要的步骤。手术后立即给予5毫克/千克的恩诺沙星以预防感染。将移植小鼠置于清洁的笼子中，直至其完全从麻醉中恢复。术后观察小鼠一小时，然后再将其送回饲养设施。在恢复期间密切监测小鼠，确保绷带未限制胸廓扩张和呼吸。八天后，观察并触诊移植物，检查是否有结痂、收缩或硬化迹象。若出现上述任何体征，可能表明移植组织未实现充分的血管化，应视为技术失败。需每日监测移植组织是否有排斥迹象。当移植组织坏死面积大于或等于90%时，应判定为移植排斥。 在完全不匹配模型中，全层皮肤移植通常在8至12天内被排斥。在轻微不匹配模型中，排斥反应较慢，变异较大，皮肤移植物的外观特征变化较不明显，例如收缩或毛发脱落。急性移植物排斥通常始于移植物的肿胀和红斑。随后会出现移植物干燥、结痂和收缩，如图所示。根据MHC错配程度及免疫抑制方案的不同，排斥反应可能通过一种亚急性过程发生，其特征为细微变化，例如毛发脱落、色素沉着、真皮乳头消失以及移植物体积缩小。在这些情况下，被排斥的移植物表现为发亮、苍白、无毛发，边缘不规则。以 BALB/c 小鼠作为供体，C57 black 6 小鼠作为受体，观察到抑制糖酵解和氧化磷酸化，或单独抑制谷氨酰胺代谢，均可延长皮肤移植物的存活时间。然而，同时阻断这三条通路可显著进一步延长移植物存活。此外，三重代谢治疗的效果优于传统的环孢素或雷帕霉素治疗。此外，与未经治疗的组织相比，代谢疗法组皮肤移植物的组织学显示组织排列更为完整，淋巴细胞性炎性浸润更少。随着外科手术技术和免疫抑制方案的进步，器官移植的预后已显著改善。然而，长期免疫抑制伴随明显的副作用，因此促进免疫耐受的新策略仍是现代移植研究的目标。众所周知，代谢在调控T细胞功能中具有重要作用。通过抑制糖酵解、氧化磷酸化和谷氨酰胺代谢，我们能够显著延长同种移植物的存活时间。这种新方法比传统治疗更为有效，代表了免疫调控和移植领域潜在策略的一次范式转变。

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免疫学与感染

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同种异体皮肤移植是检测宿主T细胞对MHC不同的供体抗原反应的标准模型。本视频文章以可视化方式演示了进行BALB/c--&gt;C57BL/6皮肤移植的每一步操作过程。...

小鼠皮肤移植

在本报告中，我们描述了一种三维皮肤重建模型，该模型在结构和组成上模拟了人类皮肤。该皮肤重建模型已被用于研究黑素细胞的生理特性、黑色素瘤的进展以及真皮干细胞的命运。此外，该模型还可作为药物评估的临床前工具。...

三维人类皮肤重建模型：研究正常皮肤与黑色素瘤进展的工具

本视频展示了一种将人类皮肤移植到中性粒细胞反应受抑制的免疫缺陷小鼠上的方法。该方法包括将人类薄层皮肤移植物贴附于小鼠的移植床，进行封闭并覆盖保护以促进恢复。最终，人类皮肤与小鼠皮肤牢固结合，建立血管化和血液循环，从而实现成功的异种皮肤移植。...

一种在小鼠模型中进行人类皮肤移植的技术

血管化是实现成功组织工程的关键因素。因此，需要可靠的技术来评估组织构建物中血管网络的形成。本文介绍了一种简单且经济有效的方法，用于可视化并定量分析血管化 体内.

用于评估生物材料血管化的全层皮肤缺损模型 体内

尾部皮肤移植是研究小鼠同种异体免疫反应中T细胞依赖性排斥反应和耐受诱导的有力模型。该方案的优势在于手术创伤小，且易于监测，无需处死受体小鼠。...

小鼠尾部皮肤移植以研究同种异体CD4 T细胞应答

在哺乳动物发育过程中，早期妊娠阶段的皮肤伤口可以无瘢痕愈合。本文详细介绍了一种在E16.5（无瘢痕）和E18.5（有瘢痕）小鼠胚胎背部皮肤上建立胎儿无瘢痕伤口愈合的可靠且可重复的模型。...

一种用于无瘢痕伤口修复的小鼠胎儿皮肤模型

本研究旨在建立一种小鼠烧伤创面愈合模型。使用预热的黄铜模板在小鼠背部皮肤上诱导产生热力烧伤。烧伤组织经清创后，覆盖取自遗传背景相似的供体小鼠尾巴的皮肤移植物。...

一种利用同种异体皮肤移植物重建的烧伤创面小鼠模型

本方案描述了如何将人皮肤移植到非肥胖型糖尿病（NOD）-scid...

异种移植皮肤模型用于调控人类免疫反应 体内

本文介绍了一种改良的异位血管化心脏移植技术，并更新了无菌操作、镇痛和麻醉方法。...

一种改良的小鼠异位心脏移植方案，符合当代无菌技术、麻醉与镇痛标准

我们介绍一种可重复的小鼠异位后肢至颈部血管化复合组织异体移植模型。该超显微外科手术方案涉及0.3-0.5...

小鼠异位后肢至颈部移植：血管化复合异体移植的超显微外科模型

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