Name: HDAC 抑制剂介导的 B 细胞 rna 和基因的基因组分析--诱导进行类开关 DNA 重组和血浆细胞分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学习HDAC抑制剂介导的B细胞RNA和基因基因组分析方法，用于研究抗体类别转换重组和浆细胞分化机制。该技术利用体外B淋巴细胞刺激、qRT-PCR和高通量测序，为免疫学研究提供有效框架。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI 105813 和 AI 079705（授予 PC）、狼疮研究联盟狼疮靶点识别资助项目 ALR 295955（授予 PC）以及关节炎国家研究基金会研究资助（授予 HZ）的支持。TS 得到了中国长沙中南大学湘雅医学院第二湘雅医院儿科医学中心的支持，该支持来自湘雅-德克萨斯大学圣安东尼奥医学中心医学生访问项目。

本方案遵循圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会的动物护理指南。
1. 小鼠B细胞的刺激以诱导类别转换重组、浆细胞分化及HDI处理
<ol>
	<li>脾细胞悬液的制备 
	注意：除小鼠安乐死和解剖步骤外，所有操作均须在超净工作台中进行。
	<ol>
		<li>通过 CO₂ 处死无特定病原体的 C57BL/6J 小鼠（8-12 周龄）2 吸入</li>
		<li>将小鼠仰卧置于解剖板上，使用18号、1.5英寸皮下注射针固定小鼠四肢。</li>
		<li>使用70%乙醇浸湿的擦拭巾对皮肤进行消毒。</li>
		<li>使用一套灭菌手术器械（镊子和解剖剪），在肋骨下方切开皮肤，以暴露脾脏（位于腹腔左侧，肝脏下方）。</li>
		<li>使用另一把无菌镊子和剪刀，通过镊子轻轻夹住位于胃大弯下方的脾脏，并用解剖剪切断所有连接组织，将脾脏取出。确保完全去除所有连接组织。</li>
		<li>将脾脏放入含有1,000 µL完全RPMI1640培养基（RPMI 1640培养基添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 µg/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和50 µM β-巯基乙醇）的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>将70 µm细胞筛置于50 mL聚丙烯圆锥形离心管上，将微型离心管中的脾脏组织倒入细胞筛中。用15 mL聚丙烯圆锥形离心管的管尖轻轻碾压脾脏，使其通过细胞筛。用15至20 mL完全培养基冲洗细胞筛。</li>
		<li>在 350 × g 离心 5 分钟，弃上清液。</li>
		<li>从脾细胞悬液中去除红细胞。将细胞沉淀重悬于ACK裂解缓冲液中（每只脾脏5 mL），室温孵育4分钟，期间偶尔轻轻摇动，随后加入25 mL完全培养基终止反应。</li>
		<li>在 350 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用 1 或 10 mL 完全培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板计数活细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>B细胞分离 
	注意：按照制造商说明书通过负向选择法分离B细胞。使用针对非B细胞（CD4、CD8、CD11b、CD43、CD49b、CD90.2、Ly-6C/G（Gr-1）和TER119）的生物素标记抗体及链霉亲和素包被的磁性颗粒，去除非B细胞。
	<ol>
		<li>制备 0.25&#160;至2 mL浓度为1 × 10⁶的细胞悬液8 细胞/mL，加入完全培养基中，置于无菌的5 mL（12 x 75 mm）聚苯乙烯圆底试管中。向样品中加入正常大鼠血清（50 µL/mL）。</li>
		<li>向样品中加入 50 µL/mL 分离试剂盒。轻轻吹打混匀细胞 上下颠倒混匀2-3次，室温孵育10分钟。</li>
		<li>向样品中加入 75 µL/mL 链霉亲和素包被的磁性颗粒。轻轻吹打混匀 2–3 次，室温孵育 2.5 分钟。</li>
		<li>加入完全 RPMI 1640 培养基，轻轻吹打细胞悬液 2–3 次以混匀。</li>
		<li>将离心管（不加盖）放入磁力架中，室温孵育2.5分钟。倾去含有未结合B细胞的上清液至新的15 mL锥形管中。</li>
		<li>使用血细胞计数板和台盼蓝染色计数活细胞。通过流式细胞术分析B细胞表面标志物（如B220和CD19）以评估B细胞纯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>B细胞刺激与HDI治疗
	<ol>
		<li>将纯化的B细胞重悬于完全RPMI 1640培养基中，终浓度为0.3 x 10⁶/mL6 cells/mL</li>
		<li>使用48孔细胞培养板进行细胞培养。每孔加入1 mL纯化的B细胞悬液（0.3 × 10⁶细胞/mL）。6 细胞/毫升），脂多糖（LPS，终浓度为 3 µ克/毫升） 大肠杆菌，IL-4（终浓度5 ng/mL）以及0或500 µM HDI（丙戊酸；VPA）。</li>
		<li>在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞2 60小时用于qRT-PCR以及高通量mRNA和miRNA测序分析，或96小时用于流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分析类别转换重组和浆细胞分化
	<ol>
		<li>培养96小时后，通过反复吹打使各孔中的细胞脱落，将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。使用台式离心机在350 × g下离心5分钟，沉淀细胞后弃去上清液。</li>
		<li>用含1% BSA和0.5 ng/mL荧光素的100 µL HBSS缓冲液重悬细胞 (FITC)-结合的山羊抗-小鼠IgM抗体（Ab）, 0.2 ng/mL 别藻蓝蛋白（APC）标记的大鼠抗小鼠 IgG1 单克隆抗体（mAb），0.2 ng/mL 藻红蛋白（PE）标记的大鼠抗小鼠 B220 单克隆抗体（mAb），0.2 ng/mL PE-Cy7 标记的大鼠抗小鼠 CD138 单克隆抗体（mAb），以及 2 ng/mL 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）。</li>
		<li>将细胞与荧光标记的抗体（步骤1.4.2）在室温避光条件下孵育30分钟。</li>
		<li>用含1% BSA的HBSS溶液洗涤细胞，每次1 mL。</li>
		<li>在台式离心机中以1,500 × g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于300 µL含1% BSA的HBSS中，并将细胞悬液转移至圆底聚苯乙烯管中。用铝箔包裹试管以避免光照。</li>
		<li>对单细胞悬液进行流式细胞术分析。每个补偿样本收集50,000个事件，其他样本收集250,000个事件。使用仪器配套软件分析数据。</li>
		<li>通过脉冲几何门（FSC-H × FSC-A 和 SSC-H × SSC-A）去除碎片和双联体。对 7-AAD 图进行适当设门以排除死细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 高通量 mRNA 测序
<ol>
	<li>培养 60 小时后，使用可回收小 RNA 的总 RNA 提取试剂盒，按照制造商说明书从 2 - 4 × 106 个细胞中提取总 RNA。包括 DNase I 处理步骤。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用生物分析仪检测 RNA 的完整性。</li>
	<li>使用 500–1,000 ng 高质量的总 RNA（RNA 完整性数值 RIN &#62; 8.0），按照制造商说明书，利用商业化的 RNA 样本制备试剂盒进行 RNA-seq 文库构建。</li>
	<li>根据各个 mRNA-seq 文库接头中相应的 6 个碱基索引序列对文库进行混合，并以 50 bp/序列的读长进行测序。按照制造商的操作规程使用高通量 DNA 测序系统。</li>
	<li>测序完成后，使用 CASAVA 进行去多重分析，为每个样本生成 fastq 文件。随后进行序列比对和生物信息学分析，具体步骤如前所述11。</li>
	<li>使用 TopHat2 默认参数将所有测序读段比对至参考基因组（UCSC 小鼠基因组 mm9 版本）14。利用 HTSeq-count 对比对生成的 bam 文件进行处理，获得所有样本中每个基因的读段计数。</li>
</ol>
3. 高通量miRNA测序
<ol>
	<li>使用步骤 2.1 中制备的高质量总 RNA（100 ng–1 µg），采用商用小 RNA-seq 试剂盒进行小 RNA-seq 文库构建。</li>
	<li>使用商用连接试剂盒，将简并的 3' 接头连接至起始小 RNA 分子的 5′ 端，再将简并的 5' 接头连接至其 3′ 端。通过逆转录将 RNA 转化为 cDNA，并使用商用试剂盒通过 PCR 扩增小 RNA-seq 文库。</li>
	<li>使用 6% TBE 天然 PAGE 凝胶分离最终的小 RNA-seq 文库。以 1× TBE 缓冲液在 200 V 条件下电泳，直至溴酚蓝示踪染料条带接近凝胶底部（距底边 0.5–1 cm）。</li>
	<li>将凝胶从玻璃板上取下，置于洁净容器中，用溴化乙锭（水中浓度 0.5 µg/mL）染色 2–3 分钟。在紫外透射仪或其他凝胶成像系统上观察凝胶条带。</li>
	<li>使用洁净的剃刀切下约 150 bp 的条带，并将其放入 1.7 mL 离心管中。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用凝胶回收试剂盒提取 DNA。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用商用高灵敏度 DNA 检测试剂对最终文库的片段分布进行检测，并使用商用双链 DNA 检测试剂测定其浓度。</li>
	<li>按照生产商方案，将文库混合后进行扩增，并使用商用高通量 DNA 测序系统进行后续测序。</li>
	<li>按照生产商方案，使用 CASAVA 进行数据解复用，为每个样本生成 fastq 文件。</li>
	<li>针对每个样本的小 RNA-seq 数据分析，按照生产商方案使用 Flicker 进行小 RNA 比对。
	<ol>
		<li>去除比对至污染物（如线粒体序列、rRNA、引物等）的读段。</li>
		<li>将数据比对至成熟 miRNA 序列。</li>
		<li>将数据比对至发夹环序列（前体 miRNA）。</li>
		<li>将数据比对至其他小 RNA 序列（使用 fRNA 数据库）15。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在所有样本完成定量后，确定不同组别/样本间差异表达的 miRNA。使用在线 miRNA 靶标预测工具（如 TargetScan16、MicroCosm17 和 PicTar18）预测靶向特定 mRNA 的 miRNA，或可被特定 miRNA 靶向的 mRNA。</li>
	<li>若需进行功能注释或通路分析，可将预测的基因提交至 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）或 DAVID 工具进行分析。</li>
</ol>
4. mRNA 和 miRNA 的定量 RT-PCR（qRT-PCR）
<ol>
	<li>mRNA 的 qRT-PCR 分析
	<ol>
		<li>使用可回收小 RNA 的商品化总 RNA 提取试剂盒，按照制造商说明书从 0.2–5 × 106 个细胞中提取 RNA。包括 DNase I 处理步骤。</li>
		<li>以寡聚 dT 引物，利用第一链 cDNA 合成系统由总 RNA 合成 cDNA。</li>
		<li>使用适当的引物，通过 qRT-PCR 对 cDNA 进行定量，采用 2× 实时 PCR 预混液，反应程序如下：95 °C 预变性 15 秒，随后进行 40 个循环（94 °C 变性 10 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒）。</li>
		<li>在 72 °C 延伸步骤期间采集数据，并进行 72 至 95 °C 的熔解曲线分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>miRNA 的 qRT-PCR 分析
	<ol>
		<li>分装步骤 4.1.1 中制备的样品 RNA。</li>
		<li>将 RNA 反转录为 cDNA。使用商品化的 microRNA 反转录试剂盒，并遵循制造商说明书操作。</li>
		<li>使用 SYBR Green 实时 PCR 预混液，结合 250 nM 成熟 miRNA 特异性正向引物和通用反向引物，进行 microRNA 的实时 PCR 扩增。
		<ol>
			<li>将 2× PCR 预混液、miRNA 特异性正向引物和通用反向引物在室温下解冻，混合各溶液。</li>
			<li>按以下配方配制每孔 25 µL 反应体系（适用于 96 孔 PCR 板）： 
			2× PCR 预混液 12.5 µL 
			miRNA 正向引物（2.5 μM）2.5 µL 
			通用反向引物（2.5 μM）2.5 µL 
			无 RNase 水 5 µL</li>
			<li>向 96 孔 PCR 板中每孔加入 22.5 μL 反应混合液，再向各孔加入 2.5 μL 模板 cDNA（50 pg–3 ng）。</li>
			<li>用密封膜紧密封板，在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟。</li>
			<li>将 PCR 板放入实时荧光定量 PCR 仪中，运行以下扩增程序：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环（94 °C 变性 15 秒，55 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用电子表格软件，采用 ΔΔCt 法对 qRT-PCR 数据进行分析。将目标 miRNA 的表达水平归一化至小核/核仁 RNA（Rnu6/RNU61/2、Snord61/SNORD61、Snord68/SNORD68 和 Snord70/SNORD70）的表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计学分析
	<ol>
		<li>使用电子表格软件，通过配对和非配对 Student's t-检验计算 p 值，并将 p 值 &#60;0.05 视为具有统计学显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Allis, C. D., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+hallmarks+of+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The molecular hallmarks of epigenetic control.</a> Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643790">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).</li>
<li>Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+Peripheral+B-Cell+Differentiation+and+the+Antibody+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response.</a> Front Immunol. 6, 631(2015).</li>
<li>Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+class-switch+DNA+recombination%3A+induction%2C+targeting+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).</li>
<li>White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+upregulate+B+cell+microRNAs+that+silence+AID+and+Blimp-1+expression+for+epigenetic+modulation+of+antibody+and+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses.</a> J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).</li>
<li>Farh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+fine+mapping+of+causal+autoimmune+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants.</a> Nature. 518, 337-343 (2015).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+selective+modulation+of+microRNAs+and+mRNAs+by+histone+deacetylase+inhibitor+in+B+cells+induced+to+uUndergo+class-switch+DNA+recombination+and+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation.</a> Front. Immunol. 6, 627(2015).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Kin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fRNAdb%3A+a+platform+for+mining%2Fannotating+functional+RNA+candidates+from+non-coding+RNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Anders, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((doRiNA%3A+a+database+of+RNA+interactions+in+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案提供了诱导B细胞类别转换和浆细胞分化的全面方法；分析表观遗传调控因子（特别是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，HDI）对这些过程的影响；以及检测HDI对这些细胞中mRNA和miRNA表达的作用。其中大多数方法也可用于分析表观遗传因子对人B细胞功能及mRNA/miRNA表达的影响。qRT-PCR以及mRNA-seq/miRNA-seq方法还可用于分析从经表观遗传调控剂（如HDI）处理的小鼠体内分离的B细胞。
表观遗传修饰可能影响多种不同的细胞功能，例如细胞增殖和存活率，从而可能影响类别转换重组（CSR）及浆细胞分化。因此，应分析经或未经组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDI）处理的B细胞的增殖、存活率以及细胞周期。通过qRT-PCR分析HDI或其他表观遗传调节因子对mRNA和miRNA表达水平调控时，一个挑战在于选择合适的看家基因或小RNA作为内参。许多常用的看家基因可能在不同程度上受到表观遗传修饰剂的影响。应检测多种不同看家基因的表达水平，并用于qRT-PCR中对特定基因表达的标准化。该问题也可通过mRNA测序（mRNA-seq）和miRNA测序（miRNA-seq）加以解决，其中单个mRNA...

表观遗传标记或因子（如DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰以及非编码RNA（包括microRNA））通过调控基因表达来调节细胞功能1。表观遗传修饰可调控B淋巴细胞的功能，例如免疫球蛋白类别转换DNA重组（CSR）、体细胞高频突变（SHM）以及向记忆B细胞或浆细胞的分化，从而影响抗体和自身抗体的应答2,3。CSR和SHM过程高度依赖于活化诱导的胞苷脱氨酶（AID，由Aicda编码），该酶在B细胞中响应T细胞依赖性和非T细胞依赖性抗原时被强烈诱导表达4。发生类别转换和高频突变的B细胞进一步分化为浆细胞，后者以大量分泌抗体的方式发挥作用，这一过程关键依赖于B淋巴细胞诱导成熟蛋白1（Blimp1，由Prdm1编码）5。B细胞中异常的表观遗传改变可能导致异常的抗体/自身抗体应答，进而引发过敏反应或自身免疫性疾病1,4。了解miRNA等表观遗传因子如何调控B细胞内在的基因表达，不仅对疫苗研发具有重要意义，而且对于揭示潜在的异常抗体/自身抗体应答机制也至关重要。
组蛋白乙酰化和去乙酰化通常是由组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）催化的组蛋白蛋白上赖氨酸残基的修饰。这些修饰可增加或减少染色质的可及性，从而允许或阻止转录因子或蛋白质与DNA的结合，并改变基因表达5,6,7,8。HDAC抑制剂（HDI）是一类干扰HDAC功能的化合物。在此，我们使用HDI（VPA）来研究HDAC对B细胞内在基因表达谱及其作用机制的调控。
miRNA是一类长度约为18至22个核苷酸的小分子非编码RNA，其生成经历多个阶段。miRNA宿主基因被转录后形成发夹结构的初级miRNA（pri-miRNA）。这些pri-miRNA被转运至细胞质，在其中进一步加工为前体miRNA（pre-miRNA）。最终，pre-miRNA经过剪切形成成熟的miRNA。miRNA通过识别靶mRNA 3'非翻译区（3' UTR）中的互补序列发挥作用6,7。通过转录后沉默机制，miRNA调控细胞活动，如增殖、分化和凋亡10,11。由于多个miRNA可靶向同一条mRNA，而单个miRNA也可能靶向多条mRNA，因此要理解miRNA个体及其集体效应的意义，必须在特定生物学背景下全面了解miRNA的表达谱。研究表明，miRNA参与B细胞发育与外周分化过程，以及B细胞发育阶段特异性分化、抗体应答和自身免疫反应1,4,9。在Aicda和Prdm1基因的3' UTR区域，存在多个经验证或预测的进化保守位点，可被miRNA靶向8。
表观遗传调控，包括组蛋白转录后修饰和miRNA，表现出细胞类型和细胞阶段特异性的基因表达调控模式9。本文描述了定义组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDI）介导的miRNA和mRNA表达、类别转换重组（CSR）以及浆细胞分化的研究方法。这些方法包括诱导B细胞发生类别转换重组和浆细胞分化的实验方案；对B细胞进行HDI处理的方法；以及通过qRT-PCR、miRNA-seq和mRNA-seq分析miRNA和mRNA表达水平的技术流程10,11,12,8,13。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro RPMI 1640 培养基（改良型）1X 含 L-谷氨酰胺（规格：6 × 500 mL；含 L-谷氨酰胺）</td><td>费舍尔科技</td><td>MT 10-040-CV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH300</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 抗生素-抗真菌溶液 100 mL</td><td>费舍尔科技 - Hyclone</td><td>SV3007901&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>费舍尔科技</td><td>44-420-3250ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛</td><td>费舍尔科技</td><td>21008-952&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液 0.04%</td><td>GIBCO/生命技术/英维沃</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>费舍尔科技</td><td>BW10-548E&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line 计数板</td><td>费舍尔科技</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 磁力架</td><td>干细胞科技</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆底聚苯乙烯带盖试管</td><td>费舍尔科技</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 小鼠 B 细胞分离试剂盒</td><td>干细胞科技</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>BD 18 号针头 1.5 英寸短斜面 100/盒&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>&amp;nbsp;305199</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗小鼠 CD138（Syndecan-1）抗体</td><td>BioLegend&amp;nbsp;</td><td>142513 (25 ug)</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 B220 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD (1 mg)</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 APC-IgG1 200 &amp;micro;g</td><td>Biolegend</td><td>406610</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠 IgM 抗体</td><td>Biolegend</td><td>406506</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人/小鼠 CD45R (B220) (RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>费舍尔科技</td><td>MT-21-022-CM</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分，热激处理&amp;nbsp;</td><td>费舍尔科技</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>LPS 25mg（来自大肠杆菌 O55:B5 的脂多糖）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>L2880-25MG</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-4（无载体）</td><td>BioLegend</td><td>574302 (规格：10 ug)</td><td></td></tr><tr><td>丙戊酸钠盐</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD e3 II 级 A2 型生物安全柜</td><td>Baker 公司</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>大容量立式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 数字控制水浴锅：型号 205</td><td>费舍尔科技</td><td>15-462-5Q</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯试管</td><td>费舍尔科技</td><td>&amp;nbsp;14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Corning CentriStar 15 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>费舍尔科技&amp;nbsp;</td><td>05-538-59A</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管，透明</td><td>Genesee</td><td>22-282</td><td></td></tr><tr><td>高速 Easy Reader 塑料离心管 50 mL</td><td>费舍尔科技</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>ELMI SkySpin CM-6MT</td><td>ELMI</td><td>CM-6MT</td><td></td></tr><tr><td>6M 转子</td><td>ELMI</td><td>6M</td><td></td></tr><tr><td>6M.06 转子</td><td>ELMI</td><td>6M.06</td><td></td></tr><tr><td>Drummond 便携式 Pipet-Aid XP 移液控制器</td><td>Drummond 科学</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管吸头</td><td>费舍尔科技</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管吸头</td><td>费舍尔科技</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管吸头</td><td>费舍尔科技</td><td>898130-896</td><td></td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>费舍尔科技</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6 台式离心机，非制冷型</td><td>贝克曼库尔特</td><td>366802</td><td></td></tr><tr><td>GH-3.8A 转子，水平转子，ARIES 智能平衡</td><td>贝克曼库尔特</td><td>366650</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R 台式离心机，制冷型</td><td>贝克曼库尔特</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>TA-15-1.5 转子，固定角度</td><td>贝克曼库尔特</td><td>368298</td><td></td></tr><tr><td>费舍尔科技 AccuSpin Micro 17</td><td>费舍尔科技</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>费舍尔科技模拟涡旋混合器&amp;nbsp;</td><td>费舍尔科技</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini 试剂盒 (50)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（约含 0.75% 乙醇作为防腐剂，分子生物学级）</td><td>费舍尔科技</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase 试剂盒 (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 第一链合成系统 RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>175013897</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad&amp;nbsp;</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 96 孔半裙边 PCR 板，每箱 25 块</td><td>Fisher</td><td>14-230-244</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' 粘性封膜</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB-1001</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ 光学模块</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9744</td><td></td></tr><tr><td>iCycler 机箱</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8701</td><td></td></tr><tr><td>光学组件套件</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9752</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II 流式细胞仪分析仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 软件</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>安捷伦科技</td><td>G2943CA</td><td></td></tr><tr><td>S200 聚焦超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>S200</td><td></td></tr><tr><td>SPRIworks 片段文库系统 I（适用于 Illumina）</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A288267</td><td></td></tr><tr><td>cBot 簇生成工作站</td><td>illumina</td><td>SY-312-2001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 基因组测序仪</td><td>Illumina</td><td>SY-401-1001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA 文库制备试剂盒 v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 小 RNA 文库制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina 小 RNA 测序试剂盒 v3</td><td>Bioo Scientific</td><td>5132-05</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>安捷伦</td><td>G2964AA</td><td></td></tr></tbody></table>

全基因组分析 hdac 抑制剂对诱导 b 细胞发生类别转换 dna 重组及浆细胞分化过程中 microrna 和 mrna 的调控作用

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

抗体反应通过多种B细胞内在的关键过程实现，包括体细胞高频突变（SHM）、类别转换DNA重组（CSR）以及浆细胞分化。近年来研究表明，表观遗传修饰或因子（如组蛋白去乙酰化和微小RNA（miRNA））可与B细胞的遗传程序相互作用，从而调控抗体反应；而表观遗传因子的功能障碍则被发现可导致自身抗体反应的发生。分析B细胞在表观遗传调节剂作用下全基因组miRNA和mRNA的表达情况，对于理解B细胞功能及抗体反应的表观遗传调控机制具有重要意义。本文中，我们展示了一种诱导B细胞进行类别转换重组和浆细胞分化的实验方案，对这些B细胞使用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂（HDI）处理，并分析mRNA和miRNA表达水平的方法。在该方案中，我们直接利用下一代mRNA测序（mRNA-seq）和miRNA测序（miRNA-seq）技术对互补DNA（cDNA）序列进行分析，将测序读段比对至基因组，并结合定量反转录（qRT）-PCR进行验证。通过这些方法，我们明确发现，在诱导发生类别转换重组和浆细胞分化的B细胞中，作为表观遗传调控因子的HDI可选择性地调节miRNA和mRNA的表达，并影响类别转换重组及浆细胞分化过程。

根据我们的方案，将纯化的B细胞与LPS（3 µg/mL）和IL-4（5 ng/mL）共同培养96小时，可诱导30–40%的类别转换重组（CSR）至IgG1，并实现约10%的浆细胞分化。经HDI（500 µM VPA）处理后，CSR至IgG1的比例下降至10–20%，而浆细胞分化率降至约2%（图1）。通过检测重组后Iμ-Cγ1和成熟VHDJH-Cγ1转录本数量的减少，进一步证实了HDI对CSR的抑制作用，这些转录本是CSR完成的标志性产物。qRT-PCR结果显示，对CSR/SHM至关重要的Aicda基因，以及对浆细胞分化起重要作用的Prdm1和Xbp1基因，其表达均被VPA抑制（图2）。
HDI 对 B 细胞中 mRNA 表达的调控具有高度选择性。通过 LPS 和 IL-4 刺激的 B 细胞...

表观遗传因素可与遗传程序相互作用，从而调控基因表达并调节B细胞功能。通过结合 体外 B细胞刺激、qRT-PCR以及高通量microRNA测序和mRNA测序方法，可用于分析B细胞中miRNA和基因表达的表观遗传调控。

全基因组分析 HDAC 抑制剂对诱导 B 细胞发生类别转换 DNA 重组及浆细胞分化过程中 microRNA 和 mRNA 的调控作用

抗体反应通过多种关键的B细胞内在过程实现，包括体细胞高频突变（SHM）、类别转换DNA……

本实验的总体目标是诱导B淋巴细胞发生抗体类别转换和浆细胞分化，并通过分析B细胞中组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC抑制剂）mRNA和microRNA的表达，研究其对上述过程的调控作用及表观遗传机制。该方法有助于解答B细胞抗体应答领域中的关键科学问题，例如免疫球蛋白类别转换和浆细胞分化的表观遗传调控。该技术的主要优势在于提供一种简便的方法来调控B细胞功能，并明确表观遗传调控因子对microRNA和mRNA表达变化的影响。按照文本方案对无特定病原体的 C57BL6J 小鼠实施安乐死后，对皮肤进行消毒，使用经高压灭菌的镊子和解剖剪在肋骨下方剪开皮肤，以暴露位于腹部左侧、肝脏下方的脾脏。轻轻夹住脾脏，剪断所有相连组织后取出器官。随后将脾脏放入含有 1,000 µL 完全 RPMI 1640 培养基的 1.5 毫升微量离心管中。接下来，将一个70微米的细胞筛插入50毫升聚丙烯圆锥形离心管中，并将微型离心管中的脾脏组织倒入细胞筛上。用15毫升聚丙烯圆锥形离心管的管尖轻轻将脾脏组织压过筛网。然后用15至20毫升完全培养基冲洗细胞筛。在 350 × g 条件下离心细胞 5 分钟。弃去上清液。用 1 毫升 ACK 裂解缓冲液重悬细胞沉淀，并孵育 1 分钟。然后加入 4 mL ACK，混悬液在室温下孵育 4 分钟以去除脾脏悬液中的红细胞，期间偶尔振荡。接着加入 25 mL 完全培养基以终止裂解反应。在 350 × g 离心 5 分钟沉淀细胞。弃去上清液，加入一毫升完全培养基重悬细胞沉淀。然后使用血细胞计数板对活细胞进行计数。在无菌的五毫升聚苯乙烯圆底试管中，用完全培养基制备浓度为每毫升1 × 10⁸个细胞、体积为0.25至二毫升的细胞悬液。向样品中加入正常大鼠血清。接着，向离心管中加入每毫升50微升的分离试剂盒混合液。然后通过轻轻吹打2至3次混匀细胞，并在室温下孵育10分钟。每毫升加入 75 µL 链霉亲和素包被的磁珠至离心管中。轻轻吹打混匀 2 至 3 次，室温孵育 2.5 分钟。用完全 RPMI 1640 培养基将体积补足至 2.5 mL，再轻轻吹打混匀 2 至 3 次。将打开的试管放入磁铁中，室温孵育两分半钟。随后将含有未结合B细胞的上清液倒入新的15毫升锥形管中。使用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数。将纯化的B细胞重悬于完全RPMI 1640培养基中，终浓度为每毫升0.3 × 10⁶个细胞。随后，向48孔板的各孔中加入1毫升上述浓度的纯化B细胞悬液，其中包含来自大肠杆菌（E. coli）的3微克/毫升LPS、5纳克/毫升IL-4，以及0或500微摩尔的HDI。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下孵育60小时，用于qRT-PCR及高通量mRNA和miRNA测序分析；或孵育96小时，用于流式细胞术分析。培养96小时后，通过反复吹打将细胞从每个孔中脱离。将细胞悬液转移至1.5

genome-wide-analysis-hdac-inhibitor-mediated-modulation-micrornas

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

HDAC 抑制剂介导的 B 细胞 rna 和基因的基因组分析--诱导进行类开关 DNA 重组和血浆细胞分化

本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。...

染色质免疫沉淀（ChIP）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）实验流程，用于对在组蛋白结合结构域上存在差异的蛋白质亚型进行全基因组定位分析。我们将其应用于ChIP-Seq分析，以鉴定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶的作用靶点。...

使用染色质免疫共沉淀进行全基因组分析以鉴定亚型特异性基因靶点

抗原暴露后，活化的B细胞亚群会经历一种称为类别转换重组（CSR）的过程，以产生具有不同效应功能的抗体同种型。本报告所述方案解释了如何诱导并分析类别转换重组。 体外...

纯化小鼠B细胞中类别转换重组的诱导与评估

在本实验方案中，我们描述了一种新型的BrdU-ChIP-Slot-Western技术，用于检测与新合成或新生DNA相关的蛋白质及组蛋白修饰。...

使用BrdU-ChIP-Slot-Western技术检测哺乳动物细胞中与新生DNA结合的蛋白质

本方法通过超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）分析多种底物，用于在HeLa细胞中鉴定组蛋白去乙酰化酶（HDAC）亚型特异性抑制剂。该方法无需使用抗体，可在活细胞环境中反映HDAC1和HDAC6的活性，与单一亚型的无细胞检测方法相比具有优势。...

使用超高效液相色谱-质谱法同时测定HeLa细胞中HDAC1和HDAC6活性

本研究介绍了一种利用成熟小鼠T细胞系进行染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方案。该方案适用于研究特定组蛋白修饰在特定启动子区域或全基因组范围内的分布情况。...

小鼠T细胞系中的染色质免疫沉淀（ChIP）

本文介绍了一种从芽殖酵母Saccharomyces...

组蛋白修饰的染色质免疫沉淀（ChIP）实验——以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为材料

染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。...

利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

利用多步骤培养系统，我们报道了一种体外B细胞向浆细胞分化的模型。...

人正常记忆B细胞体外分化为长寿命浆细胞模型

组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为赖氨酸乙酰转移酶）抑制剂（如CBP/p300）是治疗癌症的潜在药物。然而，目前亟需严谨的方法来验证这些抑制剂的有效性。三种体外验证方法包括：使用重组乙酰转移酶进行HAT活性检测、通过免疫印迹法检测细胞培养物中的组蛋白乙酰化水平，以及染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）。...

验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的实验方法

本文提供了一种利用慢病毒介导的shRNA转导技术，通过建立稳定的基因敲低细胞系，筛选参与树突状细胞（DC）发育的潜在转录因子的实验方案。 体外...

通过短发夹RNA介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外

学习HDAC抑制剂介导的B细胞RNA和基因基因组分析方法，用于研究抗体类别转换重组和浆细胞分化机制。该技术利用体外B淋巴细胞刺激、qRT-PCR和高通量测序，为免疫学研究提供有效框架。

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