Legionella pneumophila 外膜囊泡：从巨噬细胞中分离及其促炎潜力的分析

本研究的总体目标是以标准化方法纯化嗜肺军团菌的外膜囊泡（OMVs），并分析其对人和小鼠巨噬细胞中细菌复制的影响。该方法有助于解答外膜囊泡研究领域中的关键问题。例如，OMV制备的标准化流程有助于研究其在宿主-病原体相互作用中的影响。

该技术的主要优势在于，它将提供一种标准化的方案，用于研究嗜肺军团菌外膜囊泡（OMVs）对人或小鼠巨噬细胞的影响，从而增进我们对嗜肺军团菌致病性的理解。当我们思考OMVs可能具有的促炎潜力，以及这种潜力如何影响感染进程时——由于嗜肺军团菌在宿主细胞内和细胞外均可释放OMVs——我们首次提出了该方法的设想。本实验操作将由本实验室的技术员Kerstin Hoffmann和博士后研究员Analina Young进行演示。

首先，在无菌条件下，将嗜肺军团菌核心B株接种于BCYE琼脂平板上，于37摄氏度培养三天。取预培养平板上的嗜肺军团菌接种至10毫升YEB培养基中，使OD600为0.3，并于37摄氏度在摇床中培养六小时。取100微升菌液涂布于血琼脂平板，以验证液体培养物的纯度。

将血琼脂平板在37摄氏度下孵育过夜。将剩余的液体培养物加入90毫升新鲜YEB培养基中，并在旋转摇床上孵育培养物，直至其OD600达到3.0至3.5。在4,000 g条件下离心液体培养物20分钟，使细菌形成沉淀。

然后将上清液转移至新的离心管中。弃去细菌沉淀，并再次离心样品，随后重复离心步骤一次。接下来，将剩余的上清液连续过滤除菌两次。

然后将去除了细菌的上清液转移至超速离心管中，在4°C条件下于100,000 g离心3小时。弃去上清液。接着用无菌PBS重悬OMV沉淀，并将其合并。

重复超速离心步骤，以去除污染性蛋白质和游离的脂多糖（LPS）。然后，弃去上清液，并用无菌棉签将超速离心管内壁干燥。最后，用500 µL无菌PBS重悬外膜囊泡（OMV）沉淀。

然后分别取20 µL划线接种至血琼脂和BCYE琼脂平板，以排除所制备囊泡的细菌污染。将血琼脂平板孵育过夜，BCYE琼脂平板孵育三天。按照生产商说明书使用BCYE检测法对所获得的外膜囊泡（OMV）制备物中的蛋白含量进行定量。

根据文本方案将THP-1细胞分化为巨噬细胞后，使用500微升新鲜培养基替换分化培养基，并在37摄氏度下继续孵育细胞24小时。如需用OMVs处理THP-1细胞或小鼠BMDM细胞，请将预先制备的OMVs解冻，并加入适量至细胞中。在37摄氏度下用OMVs孵育巨噬细胞至少20小时，以感染经预处理或未经处理的THP-1细胞（使用嗜肺军团菌野生型core B菌株）或小鼠BMDM细胞（使用该菌株的鞭毛缺失突变体），期间不更换培养基。

以感染复数（MOI）0.5加入细菌，相当于每孔1×10⁵个嗜肺军团菌。将细胞培养物分别孵育24小时和48小时。为裂解细胞，加入皂苷至终浓度为0.1%，并孵育细胞5分钟。

然后用移液器吹打重悬裂解后的巨噬细胞，并将悬液转移至反应容器中。使用无菌 PBS 对嗜肺军团菌悬液进行系列稀释。随后取50微升所需稀释度的菌液划线接种于BCYE琼脂平板上，将平板置于37℃培养三天。

通过肉眼观察并计数形成的菌落，并根据文本方案进行计算。在本实验中，研究了嗜肺军团菌外膜囊泡（L.pneumophila OMVs）的促炎潜力，经PMA分化的THP-1细胞表现出时间和剂量依赖性的IL-8和IL-6分泌增加。此处，利用CXCL-1 ELISA检测法，在具有不同遗传背景的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中分析了不同Toll样受体对嗜肺军团菌外膜囊泡识别的影响。

来自野生型小鼠的鼠源BMDM在OMV刺激后分泌CXCL-1，而TLR2/4双基因敲除小鼠的鼠源BMDM分泌量显著减少。为研究嗜肺军团菌OMV对THP-1巨噬细胞内细菌复制的影响，细胞先与OMV预孵育20小时，随后再感染嗜肺军团菌。THP-1来源巨噬细胞经OMV预刺激后，在感染24小时时可剂量依赖性地降低细菌复制，但在后期时间点则导致CFU数量翻倍。

如本实验所示，用OMVs预先刺激小鼠BMDM后，来自野生型动物的小鼠BMDM中CFU数量增加十倍，而TLR2基因敲除和TRIF/MyD88缺陷型巨噬细胞在OMV预孵育后未表现出嗜肺军团菌复制的增加。在进行该操作时，重要的是要牢记在无菌条件下操作，并检测纯化的OMVs是否存在细菌污染。否则，后续分析将无法得出明确结果。

通过该实验步骤，还可进一步采用纳米颗粒追踪分析等其他方法，以回答更多科学问题，例如哪种军团菌突变株产生更多或更少的外膜囊泡（OMVs），或探究不同应激条件对OMVs分泌的影响。该技术建立后，为外膜囊泡研究领域的科研人员探索OMVs在体外乃至体内对宿主-病原体相互作用的影响奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何纯化OMVs，并了解如何开始分析其对巨噬细胞后续感染的影响。

在调整孵育和生长时间后，该方案可适用于不同的革兰氏阴性菌及其相应宿主细胞。请注意，嗜肺军团菌对人类具有极强的感染性，因此在处理嗜肺军团菌及执行本实验步骤时，务必在无菌操作台内进行操作。