小鼠子宫内膜上皮细胞和基质细胞的分离方法用于 体外 蜕膜化

本实验的总体目标是分离并培养原代小鼠子宫内膜的基质细胞和上皮细胞，用于共培养以研究体外蜕膜化过程。该方法有助于回答生殖医学领域中的一些关键问题，例如在蜕膜化和滋养层细胞侵袭等重要过程中，上皮细胞与基质细胞之间的旁分泌信号如何传递，以及该信号通路的调控机制。这些技术可用于在上皮细胞与基质细胞共培养体系中研究蜕膜化过程。

利用该系统，可以评估两种细胞中某一种细胞分泌的信号分子是否能够影响此过程。在收获子宫之前，进行阴道涂片检查，以确定动物的周期阶段，仅选择处于动情期的小鼠。

以阴道灌洗液中存在角膜上皮细胞为特征。接下来，使用镊子和剪刀打开第一只处于动情期动物的腹部，将肠道推向一侧，以暴露两侧的子宫角。用镊子夹住一侧子宫角远离输卵管的最远端，使用解剖镊子将子宫组织从输卵管处分离，并用Dumont 5号镊子去除脂肪和结缔组织。

然后，在远离子宫体的远端切除子宫角。切除子宫角后，将其置于含有 3 毫升 HBSS 的 35 毫米培养皿中。当所有子宫角收集完毕后，将培养皿置于体视显微镜下，用镊子去除残留的脂肪组织和结缔组织。

然后，使用 Dumont 5 号镊子、解剖镊和小型弹簧剪纵向切开子宫角以暴露其管腔，并将组织置于含有新鲜 HBSS 的新培养皿中冲洗。接着，将所有子宫角转移至含有胰蛋白酶和胰酶的 15 毫升离心管中，在 4 摄氏度、50 rpm 条件下于水平摇床中孵育 60 分钟。

1小时结束后，将试管转移至实验台进行45分钟水平静置孵育，不振荡，随后在37摄氏度水浴中水平静置孵育15分钟，不振荡。水浴孵育结束后，小心倾倒上清液，并将子宫组织转移至含有冷的小鼠子宫内膜上皮细胞培养基的培养皿中，孵育5分钟以灭活胰蛋白酶活性。接着，将组织转移至含有3毫升冷的HBSS的15毫升离心管中，并涡旋震荡组织10秒，以释放上皮细胞片层。

然后，将子宫放入一个新的含有 3 毫升新鲜 HBSS 的培养皿中冲洗，并如前所述，将另外两份上皮细胞层悬液收集到两个新的 15 毫升离心管中。第三次组织涡旋后，将子宫转移至含有小鼠子宫内膜基质细胞消化液的 15 毫升锥形管中，在 37 摄氏度、200 转/分钟条件下孵育 30 分钟。通过将三种细胞悬液轻轻经 100 微米尼龙滤网吹打过滤，以去除组织碎片，从而回收上皮细胞层，随后离心收集滤过后的细胞悬液。

将沉淀物重悬于12毫升小鼠子宫内膜上皮细胞培养基中，充分混匀，然后静置5分钟，通过重力沉降分离残留的小鼠子宫内膜基质细胞。沉降结束后，用5毫升移液管小心吸取上层2毫升上清液，并将收集的细胞进行离心。随后，用移液枪轻柔吹打，将小鼠上皮细胞沉淀重悬于上皮细胞培养基中。

将细胞以适合后续分析的密度接种到胶原蛋白包被的盖玻片上。上皮细胞分离后，继续处理间质细胞，从培养箱中取出含有子宫的间质细胞消化管。30分钟孵育后（如前所示），用手轻轻振荡试管10秒，将子宫转移至含有3毫升4°C HBSS的培养皿中。

充分冲洗组织，然后向消化管中加入3毫升基质细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，并将子宫转移至含有3毫升新鲜小鼠子宫内膜基质细胞培养基的15毫升锥形管中。轻轻振荡组织管10秒。随后，将子宫转移至一皿冷的HBSS中，再将其转移至新的含有基质细胞培养基的15毫升离心管中。

第三次清洗组织并转移后，将子宫组织置于新鲜的小鼠子宫内膜基质细胞消化液中，在37摄氏度条件下孵育30分钟。消化结束后，将1至3号管以及胰酶管中的细胞悬液通过40微米尼龙滤网，并用额外的5毫升小鼠子宫内膜基质细胞培养基冲洗滤网。随后，通过离心收集细胞。

将沉淀重悬于新鲜的小鼠子宫内膜基质细胞培养基中，随后以适合后续分析的密度接种至多聚赖氨酸包被的盖玻片上。原代细胞培养的纯度可通过波形蛋白（vimentin）和细胞角蛋白（cytokeratin）的表达差异进行评估，因为波形蛋白在小鼠子宫内膜基质细胞中表达水平较高，而在小鼠子宫内膜上皮细胞中表达较低；而细胞角蛋白在小鼠子宫内膜上皮细胞中表达水平较高，在小鼠子宫内膜基质细胞中表达较低。

间质细胞表达mentin以及上皮细胞特异性表达细胞角蛋白的双重染色结果进一步证实了mentin在间质细胞中的表达。通过添加环磷酸腺苷和甲羟孕酮对间质细胞培养物诱导蜕膜化，结果显示，与对照组间质细胞培养物相比，经五天处理后催乳素mRNA水平显著升高。由于在侧向细胞培养小室中上皮细胞难以观察，可在五天蜕膜化模拟实验结束后立即进行细胞活力检测，颜色由蓝色转变为亮粉色表明存在活的上皮细胞。

采用此技术后，还可进行囊胚黏附实验等其他方法，以评估囊胚存在时上皮细胞分泌的因子是否可诱导基质细胞蜕膜化。