Name: 鼠标子宫内膜上皮细胞和基质细胞的隔离体外蜕膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习从小鼠子宫内膜中分离和培养原代上皮细胞与基质细胞的方法，用于建立共培养系统以研究体外蜕膜化过程。该技术通过酶解消化和离心纯化实现细胞分离，为生殖医学研究提供可靠模型。

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本工作获得了佛兰德研究基金会（FWO G.0856.13N）和鲁汶大学研究委员会（OT/13/113）资助。K.D.C. 由比利时FWO资助。A.H. 由OT/13/113资助。我们感谢鲁汶大学细胞影像中心设施（http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm）提供共聚焦显微镜的使用支持。

AlexaFluor
本研究的所有动物实验均经比利时鲁汶大学（KU Leuven）伦理审查委员会批准（项目编号 P174/2013）。小鼠在标准条件下饲养， 随意 可自由获取食物颗粒和自来水，并置于受控环境条件下（23 &#177;1.5 &#176;C，相对湿度40 - 60%，12/12明暗循环。
1. 小鼠
<ol>
	<li>使用 commercially available 小鼠品系（i.e. C57Bl/6，雌性，8 - 12 周龄）。通常，4 - 5 只小鼠可获得足量细胞用于后续实验。</li>
	<li>在分离细胞前连续 3 天，每天皮下注射 100 µL 17β-雌二醇（E2）溶液（100 ng/100 µL），以标准化动物的动情周期阶段并诱导子宫内膜细胞增殖。由于进行了为期 3 天的雌二醇处理，因此无需在启动方案前检测小鼠的周期阶段。</li>
</ol>
2. 准备工作
<ol>
	<li>配制100 ng/100 µL的E2花生油溶液。按照步骤1.2中所述，为五只小鼠注射所需用量为1.5 mL。
	<ol>
		<li>将1 mg E2溶解于1 mL乙醇中，配制成1 mg/mL的储备液。</li>
		<li>用花生油将该储备液稀释1:1,000。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制500 mL含100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的1× Hank's平衡盐溶液（HBBS），后续简称为HBSS+。</li>
	<li>配制500 mL过滤后的鼠子宫内膜基质细胞（MESC）培养基用于MESC培养：含酚红、L-谷氨酰胺及4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)，HEPES）的DMEM/F12培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、0.5 µg/mL两性霉素B和100 µg/mL庆大霉素（后续简称为MESC培养基）。</li>
	<li>配制500 mL过滤后的2% MESC培养基用于MESC&#160;在蜕膜化过程中的培养：含酚红、L-谷氨酰胺和HEPES的DMEM/F12培养基，添加2% FBS、0.5 µg/mL两性霉素B和100 µg/mL庆大霉素。</li>
	<li>配制500 mL过滤后的鼠子宫内膜上皮细胞（MEEC）培养基：DMEM培养基含10% FBS、0.5 µg/mL两性霉素B、100 µg/mL庆大霉素、25% MCDB-105培养基和5 µg/mL胰岛素（后续简称为MEEC培养基）。</li>
	<li>为MESC培养准备多聚-L-赖氨酸（PLL）包被的盖玻片。
	<ol>
		<li>将25 mg PLL溶解于250 mL蒸馏水中，使用0.22 µm滤膜过滤溶液。</li>
		<li>将无菌盖玻片放入12孔板中，在每片盖玻片上加入300 µL溶解的PLL溶液。</li>
		<li>孵育30分钟后吸除溶液。板子可于4 °C保存至后续使用（最多1–2个月）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制10 mg/mL的I型胶原酶IA储备液，分装成300 µL每份，于-20 °C保存。使用前过滤。</li>
</ol>
3. 分离前24小时所需准备
<ol>
	<li>准备用于MEEC培养的胶原蛋白包被盖玻片。
	<ol>
		<li>在蒸馏水中配制0.02 M乙酸溶液（每张盖玻片1 mL）。</li>
		<li>将150 µL胶原蛋白加入12 mL的0.02 M乙酸溶液中，得到终浓度为50 µg/mL的胶原溶液。</li>
		<li>将无菌盖玻片放入12孔板中。</li>
		<li>每孔加入1 mL胶原溶液（见步骤3.1.2）。</li>
		<li>在37 °C下孵育过夜（至少12小时）。 
		细胞分离过程中：</li>
		<li>用吸液法去除盖玻片上的胶原溶液，并在无菌环境（超净工作台）中晾干。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤盖玻片两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在含有10 mL HBSS+的15 mL标准离心管中加入0.25 g胰蛋白酶，配制2.5%的胰蛋白酶溶液。在37 °C下以200 rpm振荡1小时以提高溶解度。4 °C保存。</li>
</ol>
4. 小鼠子宫内膜上皮细胞（MEEC）和小鼠子宫内膜基质细胞（MESC）的分离与培养
<ol>
	<li>在含有2.5%胰蛋白酶溶液的15 mL离心管中加入25 mg胰蛋白酶，配制成终浓度为0.25%胰蛋白酶的溶液（以下简称MESC消化液）。</li>
	<li>子宫的分离
	<ol>
		<li>通过阴道涂片检查确定动物的周期阶段。
		<ol>
			<li>固定动物，并用50 μL生理盐水轻轻冲洗阴道 &#181;L PBS 3 - 5 次。</li>
			<li>将最终冲洗液收集到载玻片上。</li>
			<li>在明场显微镜下使用10倍或20倍物镜观察材料。</li>
			<li>仅使用处于动情期的小鼠。该阶段的特征是阴道灌洗液中存在角化的上皮细胞。图1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用适当的方法（如颈椎脱位或CO2诱导性麻醉</li>
		<li>用70%乙醇喷洒尸体，以创造无菌环境。</li>
		<li>使用无菌手术器械打开腹腔，将肠道移开以暴露两侧子宫角。</li>
		<li>在输卵管远端处夹住子宫角，从输卵管处分离子宫角，并去除脂肪和结缔组织。在子宫体上方的远端切除子宫角，将其置于含 3 mL HBSS+ 的 35 mm 培养皿中。
		<ol>
			<li>对另一侧角及其他动物重复此步骤，直至收集完所有子宫角。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在体视显微镜下用HBSS+进一步清洗子宫角，并去除所有残留的脂肪或结缔组织。</li>
		<li>沿纵向切开子宫角以暴露子宫腔，并将子宫角转移至盛有新鲜 HBSS+ 的新培养皿中。</li>
		<li>将所有子宫角转移至含有胰蛋白酶和胰酶的15 mL离心管中。</li>
		<li>在 4 ℃ 下水平孵育 60 分钟 &#176;在轨道摇床（50 rpm）上。</li>
		<li>在23℃下水平孵育45分钟 &#176;室温（RT），不振荡。</li>
		<li>在37℃下水平孵育15分钟 &#176;C（水浴），不振荡。</li>
		<li>同时，通过溶解300 &#181;将1 mg/mL胶原酶储备液L加入2.7 mL 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中。 
		注意：从现在开始，后续的分离步骤均需在层流柜内的无菌环境中进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠子宫内膜上皮细胞（MEEC）培养
	<ol>
		<li>孵育2小时后，小心倒掉上清液。</li>
		<li>将子宫转移至含有冷MEEC培养基的培养皿中，孵育5分钟以灭活胰蛋白酶活性。</li>
		<li>将子宫转移至含有 3 mL 冷 HBSS+ 的 15 mL 离心管中。</li>
		<li>涡旋振荡10秒以释放上皮细胞片层。</li>
		<li>在干净的培养皿中用 3 mL HBSS+ 冲洗子宫。</li>
		<li>重复步骤 4.3.2&#160;4.3.4 以获得总共三个含有上皮细胞片的悬液。</li>
		<li>将子宫转移至 MESC 消化液中，在 37℃ 下孵育 30 分钟 &#176;C，同时振荡（200 rpm）（如需进一步分离MESC，请进入步骤4.4）。</li>
		<li>通过移液器将三种细胞悬液轻柔地吹打至100 &#181;m 尼龙滤网以去除组织碎片。</li>
		<li>将收集的细胞悬液在500 × g下离心5分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于12 mL MEEC培养基中，充分混匀。</li>
		<li>静置溶液5分钟，通过重力沉降分离残留的MESC。</li>
		<li>使用 5 mL 移液管小心移除上层 2 mL。</li>
		<li>以 500 × g 离心细胞悬液 5 分钟。</li>
		<li>用移液器轻轻吹打，将细胞重悬于 MEEC 培养基中。</li>
		<li>将细胞以所需密度接种于胶原蛋白包被的盖玻片上，用于后续实验（图 2a).</li>
		<li>在 37 ℃ 下孵育细胞 &#176;C，5% CO₂环境中2 孵育器中孵育至少12小时。 
		注意：对于免疫染色或荧光钙成像等功能实验，建议直接将细胞接种于盖玻片上；而当需要进行RNA或蛋白质提取时，则推荐在6孔板中接种。小鼠子宫内膜基质细胞的分离分为两轮消化，因为仅经过一次消化所获得的细胞纯度可能不足。通过两次消化可实现最佳的细胞回收率与纯度。两轮消化的操作步骤完全相同。研究者可根据需要保留两轮所收集的细胞用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠子宫内膜基质细胞（MESC）培养：1子宫内膜上皮细胞，子宫内膜基质细胞，人工蜕膜化，共培养，雌激素，原代细胞培养，蜕膜化，细胞间通讯 圆形
	<ol>
		<li>在开始第一轮消化之前，通过溶解300 &#181;将1 mg/mL胶原酶储备液L加入2.7 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中。此混合液用于步骤4.4.8。</li>
		<li>准备三个含有冷（4℃）的微型培养皿 &#176;C) HBSS+ 和 3 个 15 mL 离心管，每管含 3 mL MESC 培养基（分别标记为 X1、X2 和 X3）。</li>
		<li>孵育30分钟后，轻轻振荡含有子宫的胰蛋白酶溶液10秒。子宫内膜基质细胞（MESC）将从子宫组织上脱落并保留在胰蛋白酶溶液中。</li>
		<li>将子宫转移至第一个含有 3 mL 冷（4°C）Hanks 平衡盐溶液的培养皿中。&#176;C) HBSS+ 洗涤并充分冲洗。</li>
		<li>向最初含有子宫角的离心管（步骤 4.4.3 中的离心管）中加入 3 mL MESC 培养基，以抑制胰蛋白酶活性。</li>
		<li>将子宫从含有冷（4 °C）Hanks 平衡盐溶液的培养皿中转移至含有 10 mL 冷（4 °C）Hanks 平衡盐溶液的 50 mL 锥形离心管中 &#176;C) 将 HBSS+ 加入含有 3 mL MESC 培养基的离心管 X1 中，轻轻振荡 10 秒。</li>
		<li>重复步骤 4.4.4（转移至含有冷（4 ℃）PBS 的培养皿中） &#176;C）HBSS+）以及4.4.6（转移至试管X2和X3）各两次。 
		注意：最终，本方案将获得4种细胞悬液：1管含有胰蛋白酶溶液，3管含有MESC培养基的MESC细胞（分别标记为X1、X2和X3）。</li>
		<li>将子宫转移至新的 MESC 消化液中，具体操作如步骤 4.4.1 所述，并在 37 ℃ 下孵育 30 分钟 &#176;C，垂直方向。</li>
		<li>通过40 μm细胞筛将四种细胞悬液中的基质细胞收集起来 &#181;m 尼龙滤网。用额外的 5 mL MESC 冲洗滤网。</li>
		<li>将细胞悬液在500 × g下离心7分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于MESC中，并接种于PLL包被的盖玻片上，以进行后续实验，接种密度根据需要而定。</li>
		<li>在37℃孵育至少4–6小时或过夜 &#176;C，5% CO₂2 培养箱</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠子宫内膜基质细胞（MESC）培养：2nd&#160;轮次
	<ol>
		<li>准备三个含有冷（4℃）PBS的小培养皿 &#176;C) HBSS+ 和 3 个 15 mL 离心管，每管含 3 mL MESC 培养基（Y1、Y2 和 Y3 管）。</li>
		<li>重复步骤 4.4.3 - 4.4.7。</li>
		<li>将最后一次的细胞悬液连同子宫一起转移至40 &#181;m 尼龙滤网</li>
		<li>将试管 Y1、Y2 和 Y3 中的内容物通过尼龙滤网收集基质细胞，并用额外的 5 mL MESC 冲洗滤网。</li>
		<li>将细胞悬液以 500 x g 离心 7 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于MESC培养基中，并接种至PLL包被的盖玻片上，用于后续实验（图 2b).</li>
		<li>孵育至少 4 - 6 小时，37 &#176;C，5% CO2. 
		注意：对于免疫染色或荧光钙成像等功能实验，建议将细胞接种于盖玻片上；而当需要进行RNA或蛋白质提取时，则推荐在6孔板中接种细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 波形蛋白/细胞角蛋白双重染色法验证纯化的MEEC和MESC培养物
<ol>
	<li>将细胞接种到盖玻片上。</li>
	<li>在轨道摇床上（50 rpm）用含钙和镁的 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 4% 多聚甲醛（PFA）（注意！）固定细胞 10 分钟，不放在摇床上。</li>
	<li>在摇床（50 rpm）上用不含钙和镁的 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>在摇床（50 rpm）上用 0.2% Triton X-100 透化细胞 10 分钟。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>用含 5% 山羊血清（GS）的 PBS 封闭 2 小时，置于摇床（50 rpm）上。</li>
	<li>在 4 °C 下，将细胞与单克隆兔抗人波形蛋白抗体（1:500）和单克隆鼠抗人广谱细胞角蛋白抗体（1:1,000）在摇床（50 rpm）上孵育。抗体用含 0.5% GS 的 PBS 稀释。</li>
	<li>在摇床（50 rpm）上用 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>在摇床上用二抗（1:1,000，溶于 0.5% GS）孵育细胞，即 Alexa Fluor 488 标记的抗兔 IgG 和 Alexa Fluor 488 标记的抗鼠 IgG。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>用含 DAPI 的水性封片剂封片，并过夜干燥。</li>
	<li>用指甲油封固载玻片，并于 4 °C 保存以备后续使用（图 2a, b）。</li>
</ol>
6. 体外 共培养系统中的蜕膜化
注意：建立24孔板中的共培养系统需要4至5只动物。请在无菌环境中继续以下实验步骤，最好在超净工作台内进行。
<ol>
	<li>在上皮细胞分离过程的离心和/或孵育步骤（如4.3所述）期间，于另一块24孔板中准备细胞培养小室。
	<ol>
		<li>加入 200 - 400 &#181;将适量的 MESC 培养基加入 24 孔板的相应孔中。</li>
		<li>使用无菌镊子将插入物放入预先加好培养基的24孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 MEEC 沉淀物（步骤 4.3.14）重悬于 MEEC 培养基中，并分装至插入式培养小室（工作体积：150 - 300 &#181;L 每孔）。将细胞在 37 &#176;C，5% CO₂环境中2 培养箱</li>
	<li>在第二轮间质细胞分离后（步骤 4.5.6），将间质细胞接种至另一块 24 孔板（与细胞培养小室兼容）中。使用 400 μL 的工作体积 &#181;每孔L细胞悬液。</li>
	<li>让基质细胞在37℃下贴壁至少4 - 6小时 &#176;C，5% CO₂2 培养箱</li>
	<li>将覆盖有上皮细胞的细胞培养小室从第一个24孔板转移至第二个覆盖有基质细胞的24孔板中。使用无菌镊子操作，或仅触碰小室的悬挂足部。</li>
	<li>在 37 ℃ 培养细胞 &#176;5% CO₂ 中 37°C2 在培养箱中培养 3 - 5 天，直至上皮细胞形成单层，间质细胞达到 80 - 90% 汇合度。此外，使用跨上皮电阻（TEER）通过伏特/欧姆上皮细胞测量仪监测上皮单层，具体方法参照 Grant 的描述 等7800-1,000 个/孔的数值足以判断上皮单层细胞已汇合。</li>
	<li>必要时，每2 - 3天使用玻璃移液管或细口移液器头更换一次培养基。先更换底部接种的基质细胞的培养基，再更换插入式培养小室中的培养基。建议使用预热至37℃的细胞培养基 &#176;C.</li>
	<li>制备诱导蜕膜化的培养基 体外 实验开始前的蜕膜化。使用400的 working volume &#181;每孔加入L stromal细胞。
	<ol>
		<li>配制以下储存液，并将分装样品置于 -20 ℃ 保存 &#176;C.
		<ol>
			<li>准备 250 &#181;M 螺内酯 17-乙酸酯（MPA）溶于乙醇</li>
			<li>制备 100 mM 储存液 8-Bromoadenosine 3&#8242;,5&#8242;- 超纯水中的 cAMP。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备含有1的蜕膜化培养基 &#181;M MPA 和 0.5 mM cAMP 加入含 2% FBS 的 MESC 培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻吸出孔中的培养基，并将诱导蜕膜化培养基加入到基质细胞中。如需设置对照条件，则使用含2% FBS的MESC培养基。</li>
	<li>从细胞培养小室中移除培养基，并加入 300 &#181;L 的 MEEC 培养基加入细胞中。</li>
	<li>将细胞在37℃培养箱中孵育5天 &#176;5% CO₂ 中 37°C2.</li>
	<li>第五天后，通过RT-qPCR评估基质细胞中蜕膜化的程度（见下文）。</li>
	<li>使用基于刃天青的活力检测试剂验证上皮细胞的活力。
	<ol>
		<li>在MEEC培养基中配制1:10的活率检测试剂溶液。</li>
		<li>将细胞培养小室转移至新的24孔板中。</li>
		<li>加入 150 - 300 &#181;将 L 的活力检测试剂 - MEEC 溶液加入细胞中。</li>
		<li>在 37 ℃ 培养 &#176;C，5% CO₂2 至少孵育4 - 5小时或过夜，并通过观察颜色变化（蓝色变为紫色/粉红色）评估细胞活力。 
		注意：研究人员也可选择使用小鼠催乳素特异性ELISA来评估蜕膜化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 通过qRT-PCR验证蜕膜化
注意：为通过qRT-PCR验证蜕膜化，建议将所有测试条件设置为重复样本，以获得足量细胞用于RNA分析。 
定量RT-PCR操作步骤参照De Clercq et al.8中所述。 
简要步骤如下：
<ol>
	<li>使用商业化的RNA提取试剂盒分离总RNA。
	<ol>
		<li>分别采用商业化方法，按照制造商提供的操作说明评估RNA的浓度和质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以1 µg总RNA为起始材料，根据制造商的操作说明合成cDNA。</li>
	<li>使用商业化试剂盒，按照制造商的操作说明进行qRT-PCR反应。
	<ol>
		<li>所有样品均设三个重复孔。</li>
		<li>使用商业化的TaqMan预混液以及针对目标内参基因和催乳素（prl8a2）的特异性TaqMan探针进行反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突披露。

蜕膜化是子宫内膜基质细胞在孕酮依赖下分化为圆形分泌性蜕膜细胞的过程。在人类中，该过程于月经周期的黄体期自发发生，并起始于围绕血管细胞的基质细胞，形成前蜕膜。然而在啮齿类动物中，囊胚的存在是诱导蜕膜化的必要条件。蜕膜化仅在与子宫内膜上皮细胞接触后才发生，这一事实表明上皮细胞会分泌重要因子，以诱导下方基质层的蜕膜化。尽管应认识到蜕膜化启动过程存在上述差异，但人类蜕膜化在胚胎着床后变得更加强烈的事实提示，其中可能涉及相似的机制。体外细胞培养常用于研究特定分子在蜕膜化过程中的作用。然而，可获取的人体组织在数量和可用性方面通常受限，并伴随诸多变异因素，例如&#160;周期阶段、妊娠次数以及子宫内膜异位症或子宫腺肌症等妇科疾病的存在。使用易于获取且不受动情周期阶段限制的小鼠组织可在很大程度上避免上述问题。使用小鼠组织的另一显著优势在于可利用基因修饰动物，并能够开展大量实验。目前，文献中已报道多种不同的组织分离方案，但在实验动物的年龄及动情周期使用时间点方面存在较大差异。
本研究提出了一种新的子宫内膜基质细胞与上皮细胞原代共培养方法，该方法通过在细胞分离前每日注射雌激素以实现标准化的动情周期。此外，已知雌激素可诱导上皮细胞和基质细胞增殖，从而进一步提高每次分离的细胞产量。本文所述的分离方案基于 Grant et al.7 的方法，但增加了进一步优化步骤，以提高不同细胞培养物的产量、纯度和活性。首先，HBSS 始终添加抗生素以防止原代培养物污染。在分离小鼠子宫内膜上皮细胞（MEEC）过程中，进行了温度适应（37 °C 下 15 分钟），以提高首次消化时上皮细胞的收获量。接着，在胰蛋白酶消化后，通过加入含胎牛血清（FBS）的培养基以抑制其酶活性，新增了这一步骤来调节酶活性。此外，MEECs 经过滤膜过滤时所用滤网孔径大于常规描述（100 µm），因为这些细胞常以细胞簇或细胞片层形式存在。而且，通过利用重力沉降法将 MEECs 与 MESCs 分离的额外步骤，减少了基质细胞的污染。最后，将 MEECs 接种于胶原蛋白包被的盖玻片上，以增强细胞在玻璃盖玻片上的贴附能力，因为实验表明其在未包被或聚-L-赖氨酸（PLL）包被的玻璃盖玻片上贴附效果不足。在 MESCs 的分离过程中，添加胶原酶（1 mg/mL）以改善消化效果。此外，该消化步骤重复进行两次，以避免残留 MEECs 的污染。所有这些附加步骤最终获得了高纯度且活性良好的均一细胞群体培养物。
通过使用波形蛋白（vimentin）作为间质标记物和细胞角蛋白（cytokeratin）作为上皮标记物，采用免疫染色和qRT-PCR对细胞群体的纯度进行了评估。显然，在MEEC和MESC中观察到波形蛋白与细胞角蛋白呈现出相反的表达模式。然而，可以注意到在MEEC培养物中，波形蛋白和细胞角蛋白的相对mRNA表达水平相似。其他研究团队也发表了类似结果，即培养中的上皮细胞会获得波形蛋白的表达9。更为重要的是在不同细胞群体的免疫组织化学染色中所观察到的波形蛋白与细胞角蛋白在蛋白表达水平上的差异。双重免疫染色显示，EEC对细胞角蛋白呈阳性，而ESC对波形蛋白呈阳性。在免疫染色中使用这些标记物是一种 established 方法，并被标准地用于鉴定细胞类型10。
尽管已对MESC的蜕膜化进行了大量研究，但该模型中上皮细胞的存在仍可能改变蜕膜化的结果。首先，已有研究表明，若MEEC在MESC条件培养基中或共培养环境下生长至单层，其单层上皮细胞的跨上皮电阻（TEER）会得到改善，这是由于MESC分泌的因子所致。7。此外，Pierro 等11 提供了证据表明，受17影响的上皮细胞增殖&#946;-雌二醇的作用可能由间质细胞分泌的因子介导，而上皮细胞也可释放调节间质细胞蜕膜化的因子12,13总体而言，上皮-间质共培养环境显然提供了一种更为生理性的条件，能够实现旁分泌相互作用与细胞间通信。利用插入式共培养系统对两种不同细胞类型进行培养的方法此前已有描述。14,15 并适用于小鼠原代细胞。通过检测催乳素mRNA水平作为蜕膜化的读出指标，该技术可提供高度可重复的蜕膜化评估手段，从而能够研究蜕膜化过程中上皮细胞与间质细胞之间的相互关系。来自小鼠子宫内膜上皮细胞（MEEC）的旁分泌信号可能改变间质细胞中蜕膜化的程度。此外，该模型允许特异性调控上皮细胞侧，而不直接影响间质细胞。因此，MEEC与MESC的共培养体系为评估激素、细胞因子等分子的作用提供了理想的工具， 等等。 以上皮细胞为作用对象，以间质细胞蜕膜化作为检测指标。该共培养系统的另一优势在于，研究者可利用来自转基因动物的细胞，分别探究特定蛋白在上皮或间质细胞区室中对蜕膜化过程的参与作用。此外，该技术将有助于研究胚泡黏附过程，以评估在胚泡存在的情况下，上皮细胞分泌的旁分泌因子是否足以诱导下方间质细胞发生蜕膜化。滋养层细胞侵袭过程中的一个重要步骤与细胞外基质降解相关，该过程由蛋白水解酶的作用所介导。所提出的该技术可作为一项 体外 用于研究囊胚、上皮细胞与支持性间质之间的相互作用的模型。
然而，目前关于上皮细胞的来源仍知之甚少，这些细胞既可以是腔面上皮细胞，也可以是腺上皮细胞。因此，有必要进一步表征上皮细胞的遗传和分子特征。此外，该方法在上皮细胞极化方面的知识尚有限。目前，尚未考虑上皮细胞的极化问题。然而，已有研究描述了顶端膜与基底膜在膜蛋白表达上的差异。上皮层极化的异常可能会影响上皮细胞与间质细胞之间的旁分泌相互作用。不过，已有获取极化上皮细胞的方法被报道，可将其整合到本研究所述的技术中15,16。
综上所述，本方案介绍了一种成功建立小鼠子宫内膜上皮细胞和间质细胞原代培养的技术。通过qRT-PCR以及波形蛋白和细胞角蛋白的免疫染色验证，该技术可获得高纯度的细胞培养物。最终建立的上皮细胞与间质细胞共培养体系，可用于研究在蜕膜化过程中由MEEC和/或MESC介导的旁分泌信号作用。

人类子宫内膜是子宫的内层，会经历每月周期性的剥脱与修复，为可能的妊娠做准备。它由单层排列在子宫腔表面的上皮细胞以及其下方的基质组织构成，基质的厚度随卵巢激素雌激素和孕激素的波动而变化。在黄体期，排卵后孕激素的激增会诱导子宫内膜基质细胞分化为更大、更圆的蜕膜细胞，这一过程称为蜕膜化1,2。在人类中，这种现象会自发发生，形成前蜕膜，而在胚胎着床时则更加显著。蜕膜化的一个功能性结果是子宫暂时变得对胚胎着床具有接受性，这一时间段被称为“着床窗口期”。在胚胎着床早期，围绕着床胚胎的已蜕膜化的子宫内膜基质细胞将形成一道屏障，防止有害物质进入胚胎3。在妊娠期间，这种蜕膜在胎盘形成之前为发育中的胎儿提供营养，并最终构成胎盘的母体部分4。
伦理和实际因素限制了人类研究在探讨蜕膜化过程中的设计，促使研究者采用动物模型。由于啮齿类动物属于血绒毛膜胎盘组，其子宫内膜也会在胎盘形成之前经历蜕膜化过程。5在啮齿类动物中，蜕膜化过程的启动依赖于子宫腔内囊胚的存在，表明需要额外的刺激才能触发蜕膜反应。6这意味着与胚泡直接接触的子宫内膜上皮细胞与下方的基质细胞之间存在复杂的相互作用。然而，通过机械刮擦或在激素预处理的子宫内注入油类等刺激手段，可人工诱导蜕膜化。尽管如此 在体内 利用人工蜕膜化模型的研究使我们能够加深对蜕膜化复杂信号过程的理解，并开展机制层面的深入研究， 例如， 上皮细胞与基质细胞之间必不可少的相互通讯研究仍存在局限。因此， 体外 蜕膜化研究可用于操控重要通路并研究基本生物学过程。为此，可从人或啮齿类动物的子宫内膜建立原代子宫内膜基质细胞培养体系。利用啮齿类动物可采用基因修饰动物模型，以探究特定目标蛋白在蜕膜化过程中的作用。然而，为避免动情周期带来的复杂性，常使用未成熟、青春期前的小鼠；而在其他研究中，则从小鼠动情周期各个阶段采集子宫组织，导致细胞培养体系存在异质性。此外，蜕膜化过程已在不同实验方案中被研究。 例如，&#160;通过（i）在培养基中添加激素（雌激素、孕激素或环磷酸腺苷（cAMP）），或（ii）从假孕第4.5天的小鼠中分离蜕膜细胞，后者需要额外进行阴栓检查并使用输精管结扎的雄性小鼠。这些局限性表明，建立一种标准化方法以研究蜕膜化过程具有必要性 体外 蜕膜化。在本研究中，建立了一种用于研究 体外 从成年非（假）妊娠小鼠开始的蜕膜化过程将被展示。该方法中，每日注射17&#946;-雌二醇（E2）可诱导子宫内膜细胞增殖，从而获得更高产量的均一且纯化的细胞群体。此外，共培养系统的应用可实现对上皮-间质间相互作用的研究，并能够在不同层面上调控蜕膜化过程。

<table><tbody><tr><td>适用于24孔板的ThinCert组织培养插件；1 &amp;micro;m孔径；透明</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662610</td><td>也可提供用于其他多孔板和/或不同孔径的插件。其他供应商：Merck Millipore。&lt;br/&gt; https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/&lt;br/&gt;0110_0110_0090_0030/13408/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc细胞培养处理的24孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475</td></tr><tr><td>8-溴腺苷-3&amp;prime;,5&amp;prime;-环磷酸单钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7880</td><td>用Milli Q水配制100 mM的储存液。分装后于-20 &amp;deg;C保存。&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&amp;amp;region=BE&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>醋酸甲羟孕酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1629</td><td>用乙醇配制250 &amp;micro;M的储存液。分装后于-20 &amp;deg;C保存。&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&amp;amp;region=BE&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>花生油</td><td>超市</td><td></td><td>使用在任何超市均可购得的标准烹饪用花生油</td></tr><tr><td>PrestoBlue细胞活力检测试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1</td></tr><tr><td>HBSS 1x，无钙，无镁，无酚红</td><td>Gibco</td><td>14175-046</td><td>尽可能冷藏保存。实验过程中使用冷的HBSS+。&lt;br/&gt; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>17-&amp;beta; 雌二醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875</td><td>先用乙醇配制1 mg/mL的储存液，再用花生油稀释（1:1,000）。&lt;br/&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>细胞培养液过滤器 Stericup，0.22 &amp;micro;m，聚醚砜，500 mL，辐射灭菌</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063</td></tr><tr><td>DMEM/F12，含酚红，含L-谷氨酰胺，含HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057</td></tr><tr><td>胎牛血清，经认证，热灭活，符合欧盟标准，南美来源</td><td>Gibco</td><td>10500-056</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064</td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018</td></tr><tr><td>庆大霉素（50 mg/mL）</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037</td></tr><tr><td>DMEM，低糖，含丙酮酸，无谷氨酰胺，无酚红</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5921</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>MCDB-105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td>用Milli Q水溶解，用NaOH调节pH至7，过滤后使用。避光保存。&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&amp;amp;region=BE&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1882</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>盖玻片，玻璃，18 mm &amp;Oslash;</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td><td>1001/18</td><td>http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&amp;amp;tx_rmproducts_pi1[g]=937&lt;br/&gt;&amp;amp;tx_rmproducts_pi1[p]=3504&lt;br/&gt;&amp;amp;tx_rmproducts_pi1[v]=20088&lt;br/&gt;&amp;amp;cHash=abd12065683fe74b00eaa&lt;br/&gt;5e562824d06</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>梭菌胶原酶IA型</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2674</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>DPBS，无钙，无镁</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094</td></tr><tr><td>牛胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7409</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>使用前恢复至室温。&lt;br/&gt; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>细胞筛，40 &amp;micro;m网孔，一次性</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>细胞筛，100 &amp;micro;m网孔，一次性</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Millex-GP注射器滤器，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m，聚醚砜，33&amp;nbsp;mm，γ射线灭菌</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1</td></tr><tr><td>冰乙酸（100%）</td><td>Merck Millipore</td><td>1.00063</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063</td></tr><tr><td>胶原蛋白I型</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>354236</td><td>来源于大鼠尾腱。&lt;br/&gt; https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&amp;amp;&lt;br/&gt;productid=354236%28&lt;br/&gt;Lifesciences%29#&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>猪胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3292</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>35 mm组织培养皿，聚苯乙烯，无菌</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630</td></tr><tr><td>无水乙醇，分析纯，NORMAPUR ACS，符合欧洲药典试剂标准</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821296</td><td>https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP</td></tr><tr><td>单克隆兔抗人波形蛋白（D21H3）&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Tech</td><td>#5741</td><td>使用稀释比为1/500。&lt;br/&gt; http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>单克隆鼠抗人广谱角蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2562</td><td>使用稀释比为1/1,000。&lt;br/&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>4%多聚甲醛PBS溶液</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&amp;amp;region=BE&amp;amp;gclid=&lt;br/&gt;Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw&lt;br/&gt;BEiQAI8rq&lt;br/&gt;879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f&lt;br/&gt;8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k&lt;br/&gt;8P8HAQ</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>山羊抗兔Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11034</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&amp;amp;&lt;br/&gt;resultPage=1&amp;amp;&lt;br/&gt;resultsPerPage=15&amp;amp;&lt;br/&gt;autocomplete=&amp;amp;&lt;br/&gt;searchMode=keyword&amp;amp;&lt;br/&gt;productTypeSelect=antibody&amp;amp;&lt;br/&gt;targetTypeSelect&lt;br/&gt;=antibody_secondary&amp;amp;&lt;br/&gt;species=ltechall&amp;amp;keyword=&lt;br/&gt;488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor&amp;amp;reg;%20488\%22$;;</td></tr><tr><td>山羊抗鼠Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11032</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&amp;amp;&lt;br/&gt;resultPage=1&amp;amp;&lt;br/&gt;resultsPerPage=15&amp;amp;&lt;br/&gt;autocomplete=&amp;amp;&lt;br/&gt;priorSearchTerms=&amp;amp;&lt;br/&gt;searchMode=keyword&amp;amp;&lt;br/&gt;productTypeSelect=antibody&amp;amp;&lt;br/&gt;targetTypeSelect=&lt;br/&gt;antibody_secondary&amp;amp;&lt;br/&gt;species=ltechall&amp;amp;&lt;br/&gt;keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;</td></tr><tr><td>含DAPI的VECTASHIELD封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html</td></tr><tr><td>DPBS，含钙和镁</td><td>Gibco</td><td>14040174</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133</td></tr></tbody></table>

小鼠子宫内膜上皮细胞和基质细胞的分离方法用于 体外 蜕膜化

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

蜕膜化是子宫内膜基质细胞在孕酮依赖下发生的分化过程，是成功胚胎植入的先决条件。尽管已有大量研究致力于揭示蜕膜化的潜在机制，但与胚胎直接接触的上皮细胞与下方基质细胞之间的精确信号交流仍不清楚。因此，通过同时考虑上皮细胞和基质细胞的方式来研究蜕膜化，有助于加深我们对蜕膜化分子机制的理解。为此，体内人工蜕膜化模型在生理上最具相关性；然而，细胞间通讯的可操控性有限。目前，常采用子宫内膜基质细胞的体外培养体系来研究多种信号分子对蜕膜化的调控作用。传统上使用人或小鼠的子宫内膜基质细胞。然而，人源样本的可获得性通常非常有限。此外，使用小鼠组织时，培养方法存在较大差异。本研究提出了一种经过验证且标准化的方法，利用连续三天经雌激素处理的成年完整小鼠，获得纯化的子宫内膜上皮细胞（EEC）和基质细胞（ESC）培养物。该方案经过优化，以提高细胞的得率、活力和纯度，并进一步扩展用于EEC与ESC共培养体系中对蜕膜化的研究。该模型可能适用于探究两类细胞在蜕膜化过程中的重要作用，并评估EEC或ESC在细胞间通讯中分泌的关键信号分子的贡献。

实验方案总体概述
图1A 展示了本实验方案的总体概述。通过连续三天每天注射雌二醇（E2，100 ng）使动物同步化，以标准化动情周期的阶段。动情周期可通过阴道灌洗液评估，分为动情前期、动情期、动情间期和动情后期。根据灌洗液中脱落细胞的比例可确定周期所处的阶段，这些细胞会随激素水平变化而发生改变。雌激素水平升高将促使动物进入动情期。该阶段可通过灌洗液中仅存在角化上皮细胞且无白细胞来明确识别（图1B）。在第4天，采集处于动情期动物的子宫，并分离子宫内膜上皮细胞（MEEC）和子宫内膜基质细胞（MESC）（图1C）。在含2% FBS的培养基中加入0.5 mM cAMP和1 µM 甲羟孕酮（MPA），经5天培养即可诱导蜕膜化。
MEEC 和 MESC 培养物的质量控制
可通过波形蛋白（vimentin）和细胞角蛋白（cytokeratin）表达的差异来评估原代细胞培养物的纯度。波形蛋白是一种中间纤维，表达于间充质细胞中，因此在子宫内膜基质细胞中表达。细胞角蛋白是上皮组织细胞骨架中的一种中间纤维。图2A展示了通过qRT-PCR检测的小鼠子宫内膜上皮细胞（MEEC）和小鼠子宫内膜基质细胞（MESC）中波形蛋白和细胞角蛋白的mRNA表达水平。波形蛋白在MESC中表达水平较高，而在MEEC中较低（高出2.2倍，p &lt; 0.001），而细胞角蛋白在MEEC中表达水平较高，在MESC中较低（高出36倍，p &lt; 0.001）。进行了波形蛋白/细胞角蛋白双重染色，结果显示基质细胞表达波形蛋白，而上皮细胞表达细胞角蛋白（图2B, C）。免疫染色实验以不加一抗作为阴性对照（图2D, E）。这些免疫组织化学染色结果表明，两种子宫内膜细胞培养物（MEEC和MESC）的纯度均可达90%。
MEEC/MESC 共培养体系中的蜕膜化
分离后，将小鼠子宫内膜上皮细胞和间质细胞接种于共培养系统中，以模拟子宫内膜环境。培养细胞直至上皮细胞在细胞培养小室中形成单层（TEER值为800–1,000/孔），同时间质细胞达到亚融合状态。通过添加0.5 mM cAMP和1 µM MPA诱导间质细胞发生蜕膜化。孵育五天后，采用qRT-PCR检测间质细胞中催乳素mRNA水平，作为蜕膜化的指标（图3A）。经激素处理的细胞中催乳素水平显著表达，而在对照培养基中孵育的细胞中则未检测到表达（p &lt; 0.01）。
由于上皮细胞在细胞培养小室内部难以观察，因此在五天培养期结束后立即进行了细胞活力检测（图3B）。向孔板中加入正常生长培养基与活力检测试剂的混合液，孵育至少8–12小时。颜色由蓝色变为亮粉色，表明存在有活力的上皮细胞。需要注意的是，只有在活细胞存在时才会发生颜色变化。
<img alt="蜕膜化时间线、MEEC与MESC分离、共培养、细胞图像；显微镜结果。" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案总体概述。（A）分离方案示意图，起始于连续三天的雌激素注射。第3天应完成必要的准备工作。第4天通过阴道灌洗评估动情期（以星号表示）。采用不同的消化步骤分离MESC和MEEC。第6天或细胞达到融合状态时，可在共培养系统中通过向培养基中添加cAMP和MPA并孵育五天（第6–11天）诱导蜕膜化。（B）动情期的代表性图像，特征为阴道灌洗液中存在角化上皮细胞（放大倍数10倍）。（C）MESC和MEEC的代表性图像（放大倍数20倍，比例尺：100 µm）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MESC和MEEC的波形蛋白和细胞角蛋白分析的基因表达图谱及荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：MEEC和MESC中波形蛋白和细胞角蛋白的免疫染色及定量RT-PCR分析。（A）波形蛋白和细胞角蛋白的信使RNA水平，用于指示细胞培养的纯度。RNA水平相对于管家基因ACTB和TBP的几何平均值进行相对定量。数据以均值±标准误表示。MESC培养物中的波形蛋白/细胞角蛋白双染色（B）和MEEC培养物中的双染色（C）。左侧插图为63倍放大图像。MESC（D）和MEEC（E）的阴性对照，省略一抗（比例尺：50 µm）。***：经双因素方差分析（Two-way ANOVA）结合Bonferroni多重检验校正，p &lt;0.001。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<img alt="催乳素表达图谱、细胞培养及蜕膜化研究分析的显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：通过RT-PCR验证蜕膜化。（A）检测间质细胞中催乳素mRNA表达水平以评估蜕膜化程度。RNA水平相对于管家基因PGK1和TBP的几何平均值进行相对定量。在对照培养基或蜕膜化培养基中培养的细胞的倍数变化以均值±标准误（SEM）表示。（B）间质细胞在蜕膜化刺激前（上图）和刺激后（下图）的代表性图像。右侧插图为蜕膜化后间质细胞的放大图像。蜕膜化的特征是出现多核细胞，由黑色箭头指示。（C）实验结束后对插入膜上的上皮细胞活力进行评估的代表性图像。在加入活力检测试剂（Prestoblue）后立即拍摄（0 h），并在次日早晨（ON）再次拍摄。**：经Mann-Whitney U检验，p &lt;0.01。ON：过夜培养。比例尺：100 µm。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究提出了一种标准化且经过验证的小鼠原代子宫内膜基质细胞和上皮细胞的分离与培养方法，可用于共培养系统以研究 体外 蜕膜化

蜕膜化是一种依赖于孕酮的子宫内膜基质细胞分化过程，是成功胚胎植入的先决条件。尽管已有大量研究致力于揭示蜕膜化的潜在机制，但与胚胎直接接触的上皮细胞与下方基质细胞之间的具体信号交流仍不甚清楚。因此，采用同时考虑上皮细胞与基质细胞的研究方法，有助于加深对蜕膜化分子机制的理解。为此，体内人工蜕膜化模型在生理学上最具相关性，但其对细胞间通讯的调控能力有限。目前，体外培养的子宫内膜基质细胞被广泛用于研究多种信号分子对蜕膜化的调节作用。传统上采用人或小鼠的子宫内膜基质细胞进行研究，但人源样本的获取常受到限制。此外，使用小鼠组织时，细胞培养方法存在较大差异。本研究提供了一种经过验证且标准化的方法，利用连续三天经雌激素处理的成年完整小鼠，获得高纯度的子宫内膜上皮细胞（EEC）和基质细胞（ESC）培养物。该方案经过优化，可提高细胞得率、活力和纯度，并进一步拓展用于EEC与ESC共培养体系中蜕膜化过程的研究。该模型有助于探究两种细胞类型在蜕膜化中的协同作用，并评估EEC或ESC在细胞间通讯过程中分泌的关键信号分子的功能。

本实验的总体目标是分离并培养原代小鼠子宫内膜的基质细胞和上皮细胞，用于共培养以研究体外蜕膜化过程。该方法有助于回答生殖医学领域中的一些关键问题，例如在蜕膜化和滋养层细胞侵袭等重要过程中，上皮细胞与基质细胞之间的旁分泌信号如何传递，以及该信号通路的调控机制。这些技术可用于在上皮细胞与基质细胞共培养体系中研究蜕膜化过程。利用该系统，可以评估两种细胞中某一种细胞分泌的信号分子是否能够影响此过程。在收获子宫之前，进行阴道涂片检查，以确定动物的周期阶段，仅选择处于动情期的小鼠。以阴道灌洗液中存在角膜上皮细胞为特征。接下来，使用镊子和剪刀打开第一只处于动情期动物的腹部，将肠道推向一侧，以暴露两侧的子宫角。用镊子夹住一侧子宫角远离输卵管的最远端，使用解剖镊子将子宫组织从输卵管处分离，并用Dumont 5号镊子去除脂肪和结缔组织。然后，在远离子宫体的远端切除子宫角。切除子宫角后，将其置于含有 3 毫升 HBSS 的 35 毫米培养皿中。当所有子宫角收集完毕后，将培养皿置于体视显微镜下，用镊子去除残留的脂肪组织和结缔组织。然后，使用 Dumont 5 号镊子、解剖镊和小型弹簧剪纵向切开子宫角以暴露其管腔，并将组织置于含有新鲜 HBSS 的新培养皿中冲洗。接着，将所有子宫角转移至含有胰蛋白酶和胰酶的 15 毫升离心管中，在 4 摄氏度、50 rpm 条件下于水平摇床中孵育 60 分钟。1小时结束后，将试管转移至实验台进行45分钟水平静置孵育，不振荡，随后在37摄氏度水浴中水平静置孵育15分钟，不振荡。水浴孵育结束后，小心倾倒上清液，并将子宫组织转移至含有冷的小鼠子宫内膜上皮细胞培养基的培养皿中，孵育5分钟以灭活胰蛋白酶活性。接着，将组织转移至含有3毫升冷的HBSS的15毫升离心管中，并涡旋震荡组织10秒，以释放上皮细胞片层。然后，将子宫放入一个新的含有 3 毫升新鲜 HBSS 的培养皿中冲洗，并如前所述，将另外两份上皮细胞层悬液收集到两个新的 15 毫升离心管中。第三次组织涡旋后，将子宫转移至含有小鼠子宫内膜基质细胞消化液的 15 毫升锥形管中，在 37 摄氏度、200 转/分钟条件下孵育 30 分钟。通过将三种细胞悬液轻轻经 100 微米尼龙滤网吹打过滤，以去除组织碎片，从而回收上皮细胞层，随后离心收集滤过后的细胞悬液。将沉淀物重悬于12毫升小鼠子宫内膜上皮细胞培养基中，充分混匀，然后静置5分钟，通过重力沉降分离残留的小鼠子宫内膜基质细胞。沉降结束后，用5毫升移液管小心吸取上层2毫升上清液，并将收集的细胞进行离心。随后，用移液枪轻柔吹打，将小鼠上皮细胞沉淀重悬于上皮细胞培养基中。将细胞以适合后续分析的密度接种到胶原蛋白包被的盖玻片上。上皮细胞分离后，继续处理间质细胞，从培养箱中取出含有子宫的间质细胞消化管。30分钟孵育后（如前所示），用手轻轻振荡试管10秒，将子宫转移至含有3毫升4°C HBSS的培养皿中。充分冲洗组织，然后向消化管中加入3毫升基质细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，并将子宫转移至含有3毫升新鲜小鼠子宫内膜基质细胞培养基的15毫升锥形管中。轻轻振荡组织管10秒。随后，将子宫转移至一皿冷的HBSS中，再将其转移至新的含有基质细胞培养基的15毫升离心管中。第三次清洗组织并转移后，将子宫组织置于新鲜的小鼠子宫内膜基质细胞消化液中，在37摄氏度条件下孵育30分钟。消化结束后，将1至3号管以及胰酶管中的细胞悬液通过40微米尼龙滤网，并用额外的5毫升小鼠子宫内膜基质细胞培养基冲洗滤网。随后，通过离心收集细胞。将沉淀重悬于新鲜的小鼠子宫内膜基质细胞培养基中，随后以适合后续分析的密度接种至多聚赖氨酸包被的盖玻片上。原代细胞培养的纯度可通过波形蛋白（vimentin）和细胞角蛋白（cytokeratin）的表达差异进行评估，因为波形蛋白在小鼠子宫内膜基质细胞中表达水平较高，而在小鼠子宫内膜上皮细胞中表达较低；而细胞角蛋白在小鼠子宫内膜上皮细胞中表达水平较高，在小鼠子宫内膜基质细胞中表达较低。间质细胞表达mentin以及上皮细胞特异性表达细胞角蛋白的双重染色结果进一步证实了mentin在间质细胞中的表达。通过添加环磷酸腺苷和甲羟孕酮对间质细胞培养物诱导蜕膜化，结果显示，与对照组间质细胞培养物相比，经五天处理后催乳素mRNA水平显著升高。由于在侧向细胞培养小室中上皮细胞难以观察，可在五天蜕膜化模拟实验结束后立即进行细胞活力检测，颜色由蓝色转变为亮粉色表明存在活的上皮细胞。采用此技术后，还可进行囊胚黏附实验等其他方法，以评估囊胚存在时上皮细胞分泌的因子是否可诱导基质细胞蜕膜化。

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