分析突触调制果蝇曝光时间延长后，光光感受器

该实验程序的总体目标是了解不同激活条件下单个神经元的突触动力学。这种方法可以帮助回答突触可塑性领域的关键问题，例如揭示神经元活动成熟后突触分子组成的变化。该技术的主要优点是它允许对突触的多个方面进行半自动分析，包括它们的数量、分布和突触后分子成分的富集水平。

对于此实验，在羽化后 6 小时内将果蝇收集到正常小瓶中。将收集瓶装入透明的亚克力架中。在设置为 25 摄氏度的小型培养箱中，将架子放置在与 LED 面板保持精确距离的位置，其中光照平均为 1000 勒克斯。

然后，使用以下条件之一进行后飞 1 到 3 天，持续黑暗、12 小时的光照后 12 小时的黑暗，或持续光照。然后，使用标准技术解剖和染色大脑。要安装苍蝇脑，请在微量移液管中加入安装介质，并在显微镜载玻片的中心放置两个 2 微升的液滴，相距约 2 cm。

将盖玻片放在每滴和约 0.2 毫米之间的间隙上。然后将 15 微升封固剂沉积在盖玻片上并放入间隙中。在解剖显微镜下，将大脑放入微量移液器的间隙中。

然后将大脑放在腹侧朝上的位置。最后，贴上盖玻片并使用透明指甲油沿边缘密封。然后可以使用标准技术对大脑进行成像，以重建 3D 图像。

在这种情况下，使用星号法在具有活性 Brp 表达的细胞中记录 GFP 发光。同样在这个例子中，R7 和 R8 感光器轴突用 anticiaoptin 进行免疫定位，这是使用 RFP 标记的二抗观察的。为了量化 Brp GFP puncta 的数量、分布和离域水平，首先加载由图像堆栈制成的大脑的重建 3D 图像。

Brp puncta 显示为白色。现在，找到感兴趣的区域。在这种情况下，R8 轴突的末端是通过在进入 M3 延髓层的入口点跟踪抗 ciaoptin 正轴突变薄来定位的。

在每个 R8 轴突末端，使用点检测模块识别 Brp GFP 点。选择 Add new spots（添加新点），然后在算法设置中选择 segment only area of interest（仅分割感兴趣区域）。定义分析区域后，将源通道设置为 Brp GFP，然后将估计的 XY 直径设置为 0.35 微米。

然后，在点检测中勾选背景减法。接下来，选择 quality 作为过滤器类型，点子会自动过滤。单击 finish 完成此步骤。

对数据集中的所有 R8 轴突重复点检测方法。下一个要识别的区域是轴突细胞质。首先，使用 surface 函数生成 surface 对象。

然后，选择 add new surfaces，并在算法设置下，切换 segment only area of interest。现在，手动选择感兴趣的区域。接下来，设置计算周长。

要查找作为源的感光通道，请选择 smooth 选项。对于阈值，请选择 absolute intensity（绝对强度）。启用 split touching objects 选项。

将座椅点直径设置为 0.5 微米，并使用质量和体素数量的默认过滤器设置。然后，将自动应用筛选器。现在，转到 edit 并删除在感兴趣区域之外生成的表面块。

在这种情况下，其他轴突。在对数据集中的所有 R8 轴突重复轴突区域检测后，所有 Brp 点和 R8 轴突都被识别为一组点状对象。相应的细胞质区域被识别为表面物体。

现在，继续手动定义每个轴突的方向和空间。这对于以后沿延髓神经细胞中每个神经元的 Brp GFP 密度的定量很重要。为此，请首先定义它们的起点和终点。

选择 add new measurement points（添加新测量点），然后选择 edit（编辑），然后选择 select surface of object （选择对象的表面）以处理表面对象的顶部。要定义起点，请将测量点放在 M1 层中 R 轴突的所有表面对象上。将这些点按系统可重现的顺序放置。

接下来，定义端点。再次选择 Add new measurement points， edit， and surface of object（添加新测量点、编辑和对象表面）。然后，重复相同的系统顺序，将测量点放在 M3 层中 R 轴突的底部。

为了量化 Brp 背景强度，分析两个 R7 轴突的细胞质区域。选择 添加新表面 并手动定义 R7 轴突的区域，就像对 R8 轴突所做的那样。使用相同的设置，但不打开 Enable split touching objects （启用分割触摸对象） 选项。

不要这样做。接下来，在定义的 R7 轴突区域内添加一个虚拟点对象。选择 添加新地点，然后选择 跳过自动创建，然后手动编辑。

然后，选择物体中心并单击表面物体，将虚拟点物体放置在 R7 轴突内。现在，对第二个 R7 轴突重复表面和点检测步骤。然后定义 R7 轴突的起点和终点，就像对 R8 轴突所做的那样。

对于此分析，请确保安装了正确的软件。打开包含点数据、表面数据和两个测量点对象的数据集，每个对象包含相同数量的测量点。检查数据。

两个 Measurement Point 对象必须具有相同数量的 Measurement Point 才能进行计算。定义点、轴突区域以及起点和终点后，启动插件。首先，检查元数据，特别是体素大小。

从编辑中打开图像属性，然后在几何坐标下检查体素和微米的 3 个维度。接下来，选择用于强度分析的通道。在这种情况下，将选择显示 Brp GFP 的频道。

然后定义结果的文件名。接下来，将 bin 的数量定义为 10，并将轴突长度设置为 100%然后通过将光斑半径设置为 0.35 微米，将周围的细胞质区域设置为 50 微米来定义点的区域。最后，执行突触检测命令，然后对输出进行统计分析。

按照所描述的方案，在暴露于恒定黑暗、恒定光照或正常光照/黑暗循环的果蝇的 R8 突触中分析 Brp GFP 点状。在恒定光照下保持的果蝇的 R8 光感受器中，Brp 点的数量显着减少。点的分布是使用自定义插件计算的。

R8 突触分布在从 M1 层到 M3 层的轴突轴上，但它们在 M1 和 M3 层的密度更高。同样，计算了点的离域水平。它们在所有条件下都保持不变，但 Brp GFP 的离域水平与其他报告基因不同，例如 Brp-short-cherry 在恒定光照下变得明显消解。

从 AZ 拆解后，可能存在对 Brp 短片段的不当处理。看完这个视频后，你应该对如何分析单个神经元中的突触塑性有一个很好的了解。这种可塑性特性包括突触数、它们的分布以及突触后特定分子成分的富集标记。