分析长期光照后黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞的突触调节

本实验方案的总体目标是了解单个神经元在不同激活条件下突触的动态变化。该方法有助于回答突触可塑性领域中的关键问题，例如揭示神经元活动成熟过程中突触分子组成的变化。该技术的主要优势在于，它能够对突触的多个方面进行半自动化分析，包括突触的数量、分布以及突触分子组分的富集水平。

本实验中，在果蝇羽化后六小时内将其收集至普通小瓶中。将收集用的小瓶放入透明亚克力架中。在设定为 25 摄氏度的小型培养箱内，将架子置于 LED 面板前的特定距离处，使光照强度平均为 1000 lux。

随后，在以下任一条件下饲养果蝇一至三天：持续黑暗、12小时光照后接12小时黑暗，或持续光照。之后，采用标准技术解剖并染色脑组织。为固定果蝇脑组织，用移液器吸取封片介质，并在显微镜载玻片中央位置分别滴加两滴2 µL的封片介质，两滴相距约2 cm。

将盖玻片置于每个液滴上，使盖玻片之间留出约 0.2 mm 的缝隙。然后向盖玻片及其缝隙中加入 15 µL 封片介质。在解剖显微镜下，用微量移液器将脑组织放入缝隙中。

然后将脑组织腹面朝上放置。最后盖上盖玻片，并使用透明指甲油沿边缘密封。随后可利用标准成像技术对脑组织进行成像，以重建三维图像。

在此情况下，使用STAR方法记录了具有活跃Brp表达的细胞中的GFP发光信号。在本示例中，R7和R8感光细胞轴突使用抗chaoptin抗体进行免疫标记，并通过RFP标记的二抗进行观察。为了定量分析Brp GFP斑点的数量、分布及去定位程度，首先加载由图像序列重建的脑部三维图像。

Brp 簇集点以白色显示。现在，找到目标区域。在此情况下，通过追踪在进入 M3 脒层入口处抗 antennapedia 阳性轴突的变细部分来定位 R8 轴突的终末。

在每个R8轴突末端，使用斑点检测模块识别Brp GFP puncta。选择“添加新斑点”，然后在算法设置中选择“仅分割感兴趣区域”。定义分析区域后，将源通道设置为Brp GFP，然后将估计的XY直径设置为0.35微米。

然后，在斑点检测中勾选背景减除。接着，选择“质量”作为筛选类型，荧光点将自动被筛选。单击“完成”以结束此步骤。

对数据集中的所有 R8 轴突重复进行斑点检测。接下来需要识别的区域是轴突细胞质。首先，使用表面功能生成表面对象。

然后，选择添加新表面，在算法设置下，打开仅分割感兴趣区域。接下来，手动选择感兴趣区域。随后，设置计算周长。

为找到作为源的感光通道，请选择平滑选项。对于阈值，请选择绝对强度。启用分割接触对象选项。

将种子点直径设置为 0.5 微米，并使用默认的滤波器设置进行质量和体素数量调节。随后，滤波器将自动应用。现在，进入编辑模式，删除在感兴趣区域外生成的表面部分。

在此情况下，其他轴突。在对数据集中的所有R8轴突重复进行轴突区域检测后，所有Brp puncta和R8轴突被识别为一组点状对象，而相应的细胞质区域则被识别为表面对象。

现在，手动定义每根轴突的方向和空间位置。这对于后续定量分析每个神经元在髓质神经 Neuropil 中 Brp GFP 的密度至关重要。为此，首先定义它们的起点和终点。

选择添加新的测量点，然后选择编辑，接着选择要操作的表面对象的顶部表面。为定义起始点，需在M1层R轴突的所有表面对象上放置测量点。这些点应按照系统化且可重复的顺序放置。

接下来，定义终点。再次选择添加新的测量点、编辑和物体表面。然后，按照相同的系统顺序，在M3层R轴突的底部放置测量点。

为了定量分析 Brp 的背景强度，需分析两个 R7 轴突的细胞质区域。选择“添加新表面”并手动定义 R7 轴突区域，方法与 R8 轴突相同。使用相同的设置，但不要启用“分割接触对象”选项。

保持关闭。接下来，在定义的 R7 轴突区域内添加一个虚拟的斑点对象。选择“添加新斑点”，并选择跳过自动创建，然后手动编辑。

然后，选择物体的中心，并单击表面物体，将虚拟斑点放置在R7轴突内部。接着，对第二个R7轴突重复进行表面和斑点检测步骤。然后，像处理R8轴突一样，定义R7轴突的起始和终止端点。

进行此分析时，务必确保已安装正确的软件。打开包含斑点数据、表面数据以及两个测量点对象的数据集，每个测量点对象包含相同数量的测量点。检查数据。

用于计算的两个测量点对象必须具有相同数量的测量点。定义好斑点、轴突区域以及起始点和终点后，启动插件。首先，检查元数据，特别是体素尺寸。

从编辑中打开图像属性，然后在几何坐标的体素下检查三个维度及其对应的微米数值。接下来，选择一个通道进行强度分析。本例中选择显示 Brp GFP 的通道。

然后定义结果文件的名称。接着将分组数（bins）设置为10，并将轴突长度设为100%。随后通过设置点状结构半径为0.35微米、周围胞质区域为50微米来定义 puncta 的区域。最后执行突触检测命令，并对输出结果进行统计学分析。

按照所述实验方案，分析了暴露于持续黑暗、持续光照或正常明暗循环条件下的果蝇R8突触中Brp GFP 簇状信号的数量。在持续光照条件下饲养的果蝇中，R8光感受器细胞的Brp 簇状信号数量显著减少。簇状信号的分布通过自定义插件进行计算。

R8 突触从 M1 层到 M3 层沿轴突全长分布，但在 M1 层和 M3 层的密度更高。类似地，计算了斑点的去定位水平。在所有条件下，去定位水平均未发生变化，但 Brp GFP 的去定位水平与其他报告基因（如 Brp-short-cherry）不同，后者在持续光照下明显扩散。

在活性区（AZ）解聚后，Brp短片段可能存在不适当的加工过程。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析单个神经元中的突触可塑性特征。此类可塑性特征包括突触数量、其分布情况，以及突触形成后特定分子组分富集标记的情况。