Name: 对于未螯合钆基于核酸适配体传感器（III） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: 了解基于核酸适配体的荧光检测方法，用于检测水溶液中未螯合的钆(III)离子。该方法利用44-mer多脱氧核苷酸适配子，在钆离子存在时荧光发射增强，具有高选择性和亚微摩尔级灵敏度，可确保MRI造影剂的安全性与纯度。

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我们衷心感谢纽约哥伦比亚大学的 Milan N Stojanovic 博士提供的宝贵科学建议。本工作得到了加州州立大学东湾分校（CSUEB）以及 CSUEB 教师支持基金—个人研究者项目的资助。O.E.、T.C. 和 A.L. 得到了 CSUEB 学生研究中心（CSR）奖学金的支持。

注意：所有缓冲液和溶液的配制均使用分子生物学级水。所有一次性离心管（微量离心管和PCR管）及移液器吸头均应无DNase和RNase。使用任何化学品前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。强烈建议使用适当个人防护装备（PPE）。
1. 适配体储备液的制备
<ol>
	<li>从商业渠道购买两条聚脱氧核苷酸链。两条链均需通过高效液相色谱（HPLC）进行纯化。 
	链 1（Gd-适配体）： 
	5'-/56-FAM/AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3' 
	链 2（QS）： 
	5'-GTCCCGAGAGCCT/3Dab/-3'</li>
	<li>将每条链分别溶于水中，配制成浓度为 100 μM 的 Gd-适配体和 QS 单独储备液。</li>
	<li>将这些溶液储存于 -20 °C。目前这些溶液在 3 年内保持稳定。</li>
	<li>为尽量减少冻融循环，将储备液以 10 μL 分装储存。</li>
</ol>
2. 2倍Gd传感器溶液的制备
<ol>
	<li>配制检测缓冲液（20 mM HEPES，2 mM MgCl2，150 mM NaCl，5 mM KCl）。使用 NaOH 和 HCl 将 pH 调整至约 7.4，并通过带有 0.2 μm PES 膜的无菌一次性瓶顶过滤器过滤。将缓冲液储存于无菌瓶中。若经过滤并妥善储存（室温），该缓冲液至今已证实可稳定保存长达 2 年。</li>
	<li>取 1 μL Gd-适配体储备液（来自步骤 1.2）和 2 μL QS 储备液（来自步骤 1.2），加入 497 μL 检测缓冲液中进行稀释。使用涡旋振荡器充分混匀。此时，Gd-传感器溶液（2×）中两者的浓度分别为 200 nM 和 400 nM。 
	注意：本步骤制备的 2× Gd-传感器溶液体积为 500 μL，足以用于检测 6–7 个不同浓度的 Gd3+ 溶液以绘制校准曲线及对比剂溶液（步骤 3）。每个样品将在 384 孔板中设置两个复孔。
	<ol>
		<li>根据需检测的 Gd3+ 溶液数量，相应调整 2× Gd-传感器溶液的配制体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 2× Gd-传感器溶液分装至 9 个 PCR 管中，每管 50 μL。将 PCR 管放入热循环仪中。</li>
	<li>设置热循环仪程序：将管内溶液加热至 95 °C，保持 5 分钟，随后在约 15 分钟内缓慢冷却至 25 °C（降温速率约为 0.05–0.1 °C/s）。此加热-冷却循环旨在确保 Gd-适配体与 QS 之间实现最佳杂交。若杂交不完全，会导致淬灭不充分，从而增加传感器的背景荧光。若无热循环仪，可改用热水浴完成该过程。</li>
	<li>当溶液冷却至 25 °C 后，应立即使用，或保留在热循环仪中（最多约 2 小时）待用。若使用水浴加热，则在水温自然缓慢冷却至室温的过程中，将 PCR 管保留在水浴内。</li>
</ol>
3. 构建荧光校准曲线并检测钆对比剂溶液中未螯合 Gd3+ 的存在
<ol>
	<li>溶解 GdCl3 在测定缓冲液（与步骤2.1中相同的缓冲液）中溶解固体。</li>
	<li>通过连续稀释法，分别配制 100 μL 的 6 种不同浓度的 Gd3+ 在微量离心管中配制用于标准曲线的溶液，浓度为最终所需浓度的两倍（2x 溶液）。
	<ol>
		<li>例如，为了建立一个0（仅缓冲液，不含GdCl）的校准3）、50、100、200、400 和 800 nM 的 Gd3+，配制含有 0、100、200、400、800 和 1,600 nM 离子的溶液。务必始终包含含 0 nM Gd 的“空白”样本3+ 作为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将待测对比剂溶解于检测缓冲液中。通过连续稀释制备2至3种不同浓度的对比剂溶液。 
	注意：建议测试3种不同浓度的对比剂溶液，以确保这些浓度处于线性范围内。如果所测试的样品未显示出线性关系，则应降低所用对比剂的浓度。</li>
	<li>从步骤2.5的PCR仪中取出含有2x Gd-传感器溶液的PCR管。</li>
	<li>加入每种 Gd 50 μL3+ 将3.2步骤中的溶液加入到6个含有2x Gd传感器溶液的PCR管中。通过移液器吹打混匀。每个PCR管现在均含有目标浓度的Gd3+ 待测样本、100 nM Gd-适配体和 200 nM QS。</li>
	<li>向含有2倍Gd传感器溶液的其余PCR管中，加入50 μL步骤3.3中的对比剂溶液。用移液器上下吹打数次，充分混匀。</li>
	<li>将PCR管中的溶液在室温下孵育约5分钟，可静置长达30分钟。</li>
	<li>将每个管中的45 μL转移至384孔板中。每个PCR管对应两个复孔。</li>
	<li>在酶标仪上记录每孔的荧光值。Gd传感器设计中使用的荧光基团（FAM）的激发和发射最大波长分别为495 nm和520 nm，具体数值可参见供应商网站。根据酶标仪类型（单色器型或滤光片型），选择合适的激发和发射波长或滤光片。</li>
	<li>以钆浓度为横坐标，荧光强度（任意荧光单位，AFU）为纵坐标绘制曲线图3+.</li>
	<li>以荧光倍数变化为纵坐标、Gd 浓度为横坐标绘制曲线图3+. 通过将各浓度的相对荧光单位（AFU）除以“空白”溶液（含0 nM Gd）的AFU，计算荧光倍数变化3+）。荧光变化倍数可用于结果的标准化，以防AFU存在周期性差异（不同天数， 等等。）变异。</li>
	<li>比较含有对比剂的溶液与“空白”溶液的荧光发射，其中“空白”溶液为含有 0 nM GdCl 的溶液3 （仅缓冲液） 
	注意：GBCA 溶液的荧光强度越高，表明存在更多的未螯合钆3+，这可能需要对造影剂进行进一步纯化。未螯合钆（Gd）的含量3+ 可使用步骤3.10或3.11中构建的标准曲线估算其存在量。</li>
</ol>

<ol><li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li>
<li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrogenic+systemic+fibrosis%3A+a+concise+review+for+cardiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Tex.+Heart+Inst.+J%22%5BJournal%5D)">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li>
<li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+contrast+agents%3A+basic+chemistry+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">MRI contrast agents: basic chemistry and safety.</a> J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).</li>
<li>Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+gadolinium-based+MRI+contrast+agents+in+biological+and+environmental+samples%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).</li>
<li>Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+gadolinium-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+in+human+serum+at+37+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C.</a> Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).</li>
<li>Loreti, V., Bettmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+MRI+contrast+agent+Gd-DTPA+by+SEC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li>
<li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li>
<li>Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA-based+assay+for+detecting+unchelated+gadolinium%28III%29+ions+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).</li>
<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li>
<li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li>
<li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+gadolinium+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li>
<li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

使用基于适配体的钆传感器，可观察到荧光发射强度的增加，其与未螯合的 Gd3+ 浓度成正比。为了最大限度减少样品用量，该检测可在384孔微孔板中进行，每孔总样品体积为45 μL。在此设计中，选择荧光素（FAM）和二甲基偶氮苯（dabcyl，Dab）主要基于试剂成本；若需调整发射波长，可选用其他荧光基团与淬灭基团的组合11。
需要注意的是，为了获得传感器的最佳检测效果，一个关键步骤是在检测缓冲液中加热至 95 °C 并缓慢冷却（步骤 2.4），以实现 Gd-适配体与 QS 链之间的最佳杂交。如实验方案中先前所述，若无热循环仪，可在水浴中完成 95 °C 的孵育。另一个需要控制的关键参数是缓冲液的组成；建议使用步骤 2.1 中列出的检测缓冲液来溶解对比剂，也可使用去离子水。然而，应避免使用可能含有干扰物质的溶液。例如，含有磷酸根阴离子的缓冲液会与未螯合的 Gd3+ 配位，形成不溶性的磷酸钆沉淀12。该沉淀物不会与传感器发生反应，从而导致假阴性结果。
<p class="jove_content...

磁共振成像（MRI）在临床诊断中的重要性日益增加，但该技术受限于其固有的灵敏度，这推动了新型钆基对比剂（GBCA）研究的迅速发展1。GBCA 是一类用于提高图像质量的分子，通常具有三价钆离子（Gd3+）与多齿配体配位的化学结构。这种配位作用至关重要，因为未螯合的 Gd3+ 具有毒性，已在部分肾病或肾功能衰竭患者中被证实与肾源性系统性纤维化的发展有关2。因此，检测水相中游离离子的存在对于确保 GBCA 的安全性具有关键作用。GBCA 溶液中出现未螯合的 Gd3+ 通常是由于配体与离子之间的反应不完全、配合物解离，或被其他生物金属阳离子置换所致3。
在目前用于检测 Gd3+ 存在的多种技术中，基于色谱法和/或光谱法的技术在通用性和适用性方面居于领先地位4。这些方法的优势包括高灵敏度和高准确性、能够分析多种样品基质（包括人血清5、尿液和毛发6、废水7以及对比剂制剂8），以及可同时定量多种 Gd3+ 配合物（Telgmann et al. 的综述文章中总结了2013年之前的相关研究）4。其唯一缺点是其中一些方法需要特定仪器设备（如电感耦合等离子体质谱）4，而部分实验室可能无法获得。在新型钆基对比剂（GBCA）的发现、研究及概念验证阶段，一种相对更便捷、快速且成本较低的基于光谱学的方法（如紫外-可见吸收或荧光）可能成为有价值的替代方案。基于上述应用需求，已开发出一种用于水溶液中 Gd3+ 的荧光适体传感器9。
适配体（Gd-aptamer）是一种由44个碱基组成的单链DNA分子，其特定的碱基序列通过配体系统性进化指数富集（SELEX）技术筛选获得9为了将适体改造为荧光传感器，将荧光团连接至该链的5'末端，随后通过13个互补碱基与淬灭链（QS）杂交图1）。QS 在 3' 末端标记有暗淬灭分子。在不存在 Gd 的情况下3+，该传感器（Gd-传感器）由Gd-适配体与QS以1:2的摩尔比组成，由于荧光团向淬灭剂的能量转移，荧光发射极弱。加入水溶液Gd后3+ 将使QS从Gd-适配体上解离，导致荧光发射增强。
<img alt="显示荧光素被dabcyl淬灭及Gd3+置换导致发射的Gd传感器示意图" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1.该传感器（Gd传感器）由一条44个碱基长的适配体（Gd-适配体）标记荧光素（一种荧光基团）和一条13个碱基长的淬灭链（QS）标记dabcyl（一种非荧光淬灭剂）组成。在无游离Gd3+时，传感器的荧光信号极低；当加入Gd3+后，淬灭链被置换，荧光发射显著增强。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
目前，有一种常用的基于光谱学的方法用于检测水溶液中的钆3+该检测方法利用了二甲酚橙分子，该分子在与离子螯合后，其最大吸收波长会从433 nm转变为573 nm。10这两个吸收峰最大值的比值可用于定量未螯合钆的含量3+适体传感器是二甲酚橙检测法的一种替代方法（也可作为补充），因为这两种方法在反应条件（如所用缓冲溶液的pH值和组成）、靶标选择性、定量线性范围以及检测模式方面均存在差异。9.

<table><tbody><tr><td>Gd-适配体</td><td>IDTDNA</td><td>在订单表中输入序列及荧光标记信息</td><td>可使用发射波长不同的荧光染料。该适配体也可从其他公司订购。</td></tr><tr><td>淬灭链</td><td>IDTDNA</td><td>在订单表中输入序列及淬灭基团修饰信息</td><td>可选用不同淬灭基团以实现从荧光染料到淬灭基团的最佳能量转移。该适配体也可从其他公司订购。</td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td></td><td></td><td>无特定生产厂家要求，DEPC处理或未处理的水均可使用</td></tr><tr><td>无水氯化钆(III)</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>有毒</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化镁</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP359</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SA49</td><td>有毒且具腐蚀性</td></tr><tr><td>384孔低裙边黑色平底聚苯乙烯NBS板</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>需使用适用于荧光检测的微孔板。</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 一次性无菌瓶顶过滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>瓶顶配备0.2微米PES膜</td></tr><tr><td>一次性无菌250 mL离心瓶</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>可使用更大或更小容量的瓶子</td></tr><tr><td>1.5 mL微量离心管</td><td></td><td></td><td>无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR管</td><td></td><td></td><td>无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可</td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td>无特定生产厂家要求</td></tr><tr><td>适当规格的无滤芯移液器吸头</td><td></td><td></td><td>无特定生产厂家要求，只要无DNA酶和RNA酶即可</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>其他厂家的酶标仪同样适用</td></tr></tbody></table>

一种基于适配体的游离钆(iii)传感器

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

一种检测游离三价钆离子（Gd³⁺）存在的方法3+) 在水溶液中的表现被展示。Gd3+ 由于配体与离子反应不完全或发生解离，基于钆的对比剂样品中常含有游离钆离子。鉴于该离子具有毒性，其检测至关重要。本文介绍了用于检测 Gd³⁺ 的适体传感器（Gd-sensor）的设计与使用方法。3+ 描述了该传感器在响应离子浓度增加时会产生荧光变化，其检测限达到纳摩尔级别（信噪比为3时约为100 nM）。该检测可在384孔微孔板中、于常温pH条件（~7 - 7.4）的水相缓冲液中进行。该传感器对其他生理相关的金属离子（如钠离子、钾离子和钙离子）反应较弱，但对Gd不具有特异性。3+ 与其他三价镧系元素（如铕(III)和铽(III)）相比具有优势。然而，镧系元素在对比剂或生物系统中并不常见，因此该传感器可用于选择性测定未螯合的Gd3+ 在水相条件下。

在存在未螯合 Gd3+ 的情况下，Gd 传感器溶液典型的荧光变化如图 2所示。荧光信号可表示为荧光倍数变化（图 2A）或以任意单位（AFU）表示的原始荧光读数（图 2B）。两种作图方法得到的校准曲线非常相似，对 Gd3+ 的线性响应范围在低于 1 μM 的浓度下，信号在 > 3 μM 时达到饱和。检测限约为 100 nM，信噪比为 3。
在含有目标钆基对比剂（GBCA）的溶液中，与“空白”溶液相比，游离Gd3+的存在将导致传感器的荧光信号增强。图3展示了两种不同批次Gd-DOTA复合物溶液的荧光变化结果，用以代表典型实验数据。Gd-DOTA（钆特酸）是一种钆（Gd3+）与有机配体DOTA形成的络合物，存在于商用对比剂中。较高纯度的批...

描述了使用多脱氧核苷酸（44-mer 适配体）分子在水溶液中检测游离钆(III)离子的方法。通过传感器荧光发射的增强来检测该离子的存在。

一种基于适配体的游离钆(III)传感器

一种用于检测水溶液中是否存在未螯合三价钆离子（Gd3+）的方法被展示。Gd3+ 常存在于样品中……

本荧光检测法的总体目标是检测含有磁共振成像造影剂的水溶液中是否存在有毒的未螯合钆离子。该方法可通过提供一种手段来确保所合成造影剂的高度一致性，从而促进基于钆的MRI造影剂的发展。该技术的主要优势在于能够以相对较高的选择性检测亚微摩尔浓度的未螯合毒性钆离子，且对其他生物金属阳离子的干扰具有较强抗性。开始此实验步骤时，按照文本方案中的说明配制测定缓冲液。使用氢氧化钠和盐酸将 pH 值调节至 7.4。随后，使用带有 0.2 微米 PES 膜的无菌一次性瓶顶过滤器过滤缓冲液。接下来，将497 µL的检测缓冲液转移至一个新的微量离心管中。加入1 µL制备好的钆适体储备溶液和2 µL制备好的QS储备溶液。将该2X钆传感器溶液各50 µL分别加入9个PCR管中。此后，将试管放入热循环仪中。设置热循环仪将样品加热至 95 °C，持续 5 分钟，然后在 15 分钟内将溶液缓慢冷却至 25 °C。需要注意的是，在加入钆离子溶液之前，必须先将 2X 钆传感器溶液加热至 95 °C，再缓慢冷却至室温。首先，将固体三氯化钆溶解于检测缓冲液中，配制所需浓度的三价钆储备液。通过连续稀释法，按照文本方案配制六份体积为100微升的三价钆溶液。随后，将待测的对比剂溶解于检测缓冲液中。采用连续稀释法配制三种不同浓度。然后，从PCR仪中取出含有2倍钆传感器溶液的PCR管，将每种钆三溶液各取50微升转移至不同的PCR管中。用移液器将每种溶液上下吹打数次以混匀。然后，分别将50 µL每种对比剂溶液转移至剩余的PCR管中。再次通过上下吹打数次进行混匀。将全部九种溶液在室温下孵育五分钟。随后，将每种溶液各45微升以复孔形式转移至384孔板中。然后，按照文本方案中所述记录并分析荧光数据。本研究采用基于荧光的方法检测水溶液中未螯合的三价钆离子。通过将荧光团连接至适体，构建荧光传感器。随后，该传感器与一条带有暗淬灭分子标记的淬灭链杂交。加入三价钆离子后，会将淬灭链从适配体上置换下来，从而导致荧光发射增强。通过使用100纳摩尔的钆适配体和200纳摩尔的淬灭链获得校准曲线，并以原始荧光值或荧光倍数变化作图。两条曲线均显示，在三价钆离子浓度低于1微摩尔时呈线性响应，而在浓度超过3微摩尔时信号达到饱和。随后对两种不同批次的钆特酸进行分析，浓度范围为0毫摩尔至20毫摩尔。尽管高纯度样品在此浓度范围内荧光发射无明显增加，但在含有未螯合钆离子（Gd³⁺）的样品中，当浓度低至5毫摩尔时即可观察到显著变化。在进行该操作时，需确保微孔板各孔中无气泡，以免影响荧光读数。通过该方法，我们能够检测含对比剂溶液中即使微量的钆离子。这将是一种测定对比剂纯度的有效方法。进行该操作时，接触化学品可能存在危险，因此采取佩戴个人防护装备等预防措施至关重要。

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对于未螯合钆基于核酸适配体传感器（III）

我们展示了镧系金属配合物的金属化、纯化及表征方法。此处描述的配合物可与大分子偶联，从而通过磁共振成像实现对这些分子的示踪追踪。...

镧系配合物的制备、纯化及表征：用于磁共振成像对比剂的研究

在小鼠前列腺癌模型中，利用靶向肿瘤间质中凝结的血浆蛋白的小肽类磁共振成像（MRI）对比剂，展示磁共振癌症分子成像技术。...

利用小分子CLT1肽靶向对比剂进行前列腺癌的MR分子成像

提供了一种基于可调节严格度磁珠筛选方法的小分子靶标结构转换型适体选择方案。具有结构转换特性的适体有利于需要通过构象变化来指示靶标存在的检测方法，例如文中所述的金纳米粒子检测法。...

一种用于比色法金纳米粒子检测的构象转换型适体筛选方法

本方案描述了生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒的合成及其作为多模态分子成像探针的应用。该纳米颗粒具有核-壳结构，其中位于纳米颗粒核心内的钆或锰离子可产生磁共振成像（MRI）对比效应。生物功能化外壳则包含用于荧光成像的荧光团以及用于分子靶向的靶向配体。...

用于多模态分子成像应用的生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒

研究了用于现场检测小分子的适体-金纳米粒子比色法的设计与开发。此外，验证了一种基于智能设备的比色应用程序（app），并建立了该检测方法的长期储存条件，以满足现场使用需求。...

基于适配体-金纳米粒子比色法检测技术的设计与开发及其在野外现场的应用

一种分离EOB-DTPA并随后与天然Ga(III)络合的方法 68本文介绍了Ga，以及对所有化合物的全面分析和标记效率的研究。 体外 稳定性与...

EOB-DTPA 的 Ga(III) 配合物及其 68Ga 放射性标记类似物的研究

本方案描述了一种树状磁共振成像（MRI）对比剂的制备与表征方法，该对比剂携带基于环烯的巨环螯合物，可配位顺磁性钆离子。通过一系列MRI实验...

制备与 体外 用于磁共振成像的树状大分子对比剂的表征

邻苯二甲酸酯结合DNA适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用

在此，我们介绍一种获取 68镓掺杂的氧化铁纳米颗粒 通过 快速微波驱动合成。该方法可制备 PET/(T1)MRI 纳米颗粒，标记效率高于 90%，放射化学纯度达 99%，合成时间仅需 20...

68Ga 掺杂铁氧化物纳米颗粒的合成用于双模正电子发射断层扫描/(T1)磁共振成像

本方案展示了使用一种快速、三步式、基于适配体的指数扩增检测方法来检测目标物。涵盖了样本制备、信号扩增和显色发育步骤，以实现对该体系的应用，特异性识别茶碱而非咖啡因的存在。...

基于适体的靶标检测结合三阶段G-四链体等温指数扩增反应

我们描述了一种荧光检测方法，可快速且低成本地验证新化合物是否具有螯合铁的能力。该方法通过检测化合物能否竞争性地取代弱铁螯合荧光探针钙黄绿素（Calcein）与铁的结合，从而在发生螯合反应时产生可量化的荧光增强信号。...

一种可量化且低成本的无细胞荧光方法，用于验证新型化合物的铁螯合能力

了解基于核酸适配体的荧光检测方法，用于检测水溶液中未螯合的钆(III)离子。该方法利用44-mer多脱氧核苷酸适配子，在钆离子存在时荧光发射增强，具有高选择性和亚微摩尔级灵敏度，可确保MRI造影剂的安全性与纯度。

一种基于适配体的游离钆(III)传感器

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