Name: 在鼠标破骨细胞前体Notch信号的刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习在体外刺激小鼠破骨细胞前体中Notch信号的方法，以阐明该信号通路在破骨细胞分化过程中的作用。此技术可应用于细胞存活、增殖及其他细胞类型分化的研究。

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本研究由宾夕法尼亚大学肌肉骨骼疾病中心（5 P30 AR050950-09）、AO基金会资助项目（S-16-12A）、费城退伍军人事务医疗中心转化肌肉骨骼研究中心以及骨科手术科内部研究发展基金资助。JWA 受美国国家普通医学科学研究所机构研究与职业发展奖（IRACDA；5 K12 GM081259-08）资助的宾夕法尼亚大学研究与教学博士后机会（PENN-PORT）奖学金支持。

所有涉及脊椎动物的研究均按照宾夕法尼亚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>通过将最低必需培养基（MEM）粉末和1.9 g碳酸氢钠溶解于900 ml H2O中来配制α-MEM，并添加2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和100 ml热灭活胎牛血清。使用0.22 µm聚醚砜（PES）滤器进行除菌。</li>
	<li>通过在α-MEM中添加35 ng/ml重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）来配制巨噬细胞培养基</li>
	<li>通过在巨噬细胞培养基中添加100 ng/ml RANKL来配制破骨细胞培养基</li>
</ol>
2. 骨髓细胞分离
<ol>
	<li>每只小鼠使用一支装有10 ml α-MEM的10 ml注射器，配25⅝号针头。</li>
	<li>以1.3 L/min的流速暴露于CO2环境中10分钟，处死小鼠。在进行解剖前，CO2暴露后须通过颈椎脱位确认动物死亡。</li>
	<li>采用无菌操作技术，分离并取出胫骨和股骨。在沿后肢腹侧面做切口暴露胫骨和股骨前，先用70%乙醇对小鼠皮肤进行消毒。
	<ol>
		<li>切断膝关节以游离股骨远端，并尽可能靠近骨盆处切断股骨。取出股骨后，尽可能清除所有软组织。为取出胫骨，需切断踝关节，并尽可能去除软组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子夹住骨骼，用2.5 ml室温α-MEM冲洗骨髓至15 ml锥形管中，将同一只小鼠的骨髓冲洗液收集于同一管中。 
	注：成功的骨髓冲洗会使骨骼颜色由红色变为米色。</li>
	<li>静置使碎片沉降至管底，小心将上清液转移至新的洁净15 ml锥形管中，避免转移任何碎片。 
	注：部分细胞可能随骨髓碎片一同沉淀。若需获得更多细胞，可将骨髓冲洗液经70 µm细胞筛过滤至洁净的15 ml管中。</li>
	<li>在室温下以300 x g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>用真空抽吸法去除上清液，将细胞沉淀重悬于0.5 ml氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，37 °C孵育3分钟以裂解红细胞。</li>
	<li>直接向ACK-细胞混合液中加入10 ml PBS，并以300 x g离心5分钟。 
	注：此前呈红色的细胞沉淀此时应变为米色。</li>
	<li>用真空抽吸法去除上清液，将沉淀重悬于10 ml α-MEM中，接种至100 mm组织培养处理培养皿中。在37 °C湿润组织培养箱中过夜孵育。 
	注：此步骤无需细胞计数。在此期间，骨髓中的贴壁细胞将附着于培养皿表面，非贴壁骨髓细胞群体则保持悬浮状态。初始孵育阶段培养基中不含MCSF。</li>
</ol>
3. 破骨细胞前体的富集
<ol>
	<li>骨髓冲洗液过夜培养后，将含有非贴壁细胞的培养上清转移至50 ml锥形管中。 
	注意：含有贴壁细胞（包括骨髓间充质前体细胞）的培养皿可弃去，或根据其他实验需要加入新鲜α-MEM继续培养。 
	注意：可将这些非贴壁骨髓细胞直接用于破骨细胞的分化，方法是将细胞以4 × 105 个/cm2 的密度接种于组织培养处理过的培养皿中，置于破骨细胞诱导培养基中，每隔一天更换培养基，共培养5天。</li>
	<li>向非贴壁细胞悬液中加入α-MEM，调整终体积至18 ml，并加入M-CSF使其终浓度为35 ng/ml。</li>
	<li>将3 ml细胞悬液分别加入6个60 mm的悬浮培养皿中。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、湿润的组织培养孵箱中过夜培养。在此期间，M-CSF将促进巨噬细胞的分化，这些细胞甚至可贴附于未经组织培养处理的表面。</li>
	<li>过夜培养后，用3 ml新鲜巨噬细胞培养基重新换液，以去除未分化为巨噬细胞的非贴壁细胞。</li>
	<li>继续在37 °C、5 % CO2 条件下培养破骨细胞前体细胞2天，或直至细胞融合度达到约70%。</li>
</ol>
4. 破骨细胞分化
<ol>
	<li>用 5 ml PBS 清洗破骨细胞前体细胞，并在室温下加入 1 ml 海洋来源的蛋白水解/胶原水解酶处理，直至轻敲培养板可使细胞脱落。 
	注意：破骨细胞前体仅能在悬浮培养皿中培养时方可被分离；若在组织培养处理过的表面培养，前体细胞会贴附过牢而无法分离。胰蛋白酶可能激活破骨细胞前体，应避免使用。</li>
	<li>每皿加入 4 ml α-MEM 培养基，将细胞转移至 50 ml 锥形离心管中。使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞稀释至密度为 5 × 104 个细胞/ml，然后加入 M-CSF 至终浓度为 35 ng/ml，RANKL 至终浓度为 100 ng/ml。</li>
	<li>以 2.6 × 104 个细胞/cm2 的密度将细胞接种于组织培养处理过的培养板中，在 37 °C、湿润的组织培养孵箱中培养 2 天。通常在 24 孔板中进行分化，每孔接种 5 × 104 个细胞。</li>
	<li>开始分化后第 2 天，更换培养基，每孔加入 1 ml 新鲜的破骨细胞诱导培养基。 
	注意：破骨细胞分化通常在 3 天内完成。所得破骨细胞可进行 TRAP 染色，以便于定量和形态学分析。</li>
</ol>
5. 使用 Jagged1 包被表面持续激活 Notch 信号通路
<ol>
	<li>将山羊抗人 IgG Fc 抗体用 PBS 悬浮至浓度为 10 μg/ml（即 10 mg/ml 储存液按 1:1,000 稀释）。将抗体溶液以 1.3 μg/cm2 的密度加入培养表面，室温孵育 1 小时。对于 24 孔板，每孔加入 250 μl（2.5 μg）。</li>
	<li>用真空泵抽吸孔内液体，每孔加入 1 ml PBS。重复此步骤 2 次。</li>
	<li>将重组 Jagged1-Fc 融合蛋白用 PBS 悬浮至浓度为 10 μg/ml。将 Jagged1-Fc 溶液以 1.3 μg/cm2 的密度加入已包被抗体的培养表面，室温孵育 2 小时。仅包被抗体的培养表面可作为对照。</li>
	<li>用真空泵抽吸孔内液体，每孔加入 1 ml PBS。重复此步骤 2 次。在接种细胞前始终保持孔内含有 PBS，以防止表面干燥。</li>
	<li>将 2.6 × 104 个破骨细胞前体细胞/cm2 接种至包被表面。Notch 信号将连续刺激至少 3 天。</li>
</ol>
6. 使用 Jagged1 包被的微珠暂时性激活 Notch 信号通路
<ol>
	<li>在适当大小的离心管中混合以下组分：0.5 μg/cm2 Jagged1-Fc、21 μl/cm2 蛋白G琼脂糖微珠，并加入PBS至终体积为1.5 ml。为制备适用于24孔板中1个孔的足量Jagged1微珠，需混合1 μg Jagged1-Fc、40 μl 蛋白G琼脂糖微珠，并用PBS定容至1.5 ml。</li>
	<li>将离心管在4 °C下旋转孵育2小时。</li>
	<li>在300 × g离心1分钟以沉淀微珠，弃上清后用1.5 ml PBS重悬微珠。重复此洗涤步骤共3次。</li>
	<li>用130 μl/cm2的培养基重悬Jagged1微珠，并加入培养的细胞中。</li>
	<li>将细胞与微珠在37 °C、5 % CO2条件下孵育所需时间，随后用PBS或培养基多次洗涤以去除微珠。</li>
	<li>通过检测Notch靶基因转录本水平验证Notch信号通路的激活10。</li>
</ol>

<ol><li>Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in development and disease.</a> Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).</li>
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<li>Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+JAGGED1+promotes+osteolytic+bone+metastasis+of+breast+cancer+by+engaging+notch+signaling+in+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells.</a> Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

方案中的关键步骤
培养与 体外 破骨细胞前体的分化为研究破骨细胞生成的分子机制以及发现促进骨再生和维持骨量的治疗靶点提供了有效的平台。在培养小鼠破骨细胞前体时，最关键的环节是维持前体细胞处于未致敏状态。作为类巨噬细胞，破骨细胞前体易于对细菌成分和促炎性细胞因子产生反应。一旦被激活，破骨细胞前体将无法高效地分化为成熟的破骨细胞。前体细胞激活的主要原因是存在炎症细胞因子（如TNFα）或胎牛血清中灭活不充分的补体成分。因此，在实验使用前必须对每批血清支持破骨细胞生成的能力进行测试。此外，所有用于破骨细胞前体培养的血清都必须经过热灭活处理，以使可能激活前体细胞的补体成分变性。
修改与故障排除
在本方法中，使用 Jagged1-Fc 刺激破骨细胞前体中的 Notch 信号通路。Jagged1 与 Fc 的融合蛋白可便于通过抗 Fc 抗体将其固定在培养表面，也可与蛋白 G 琼脂糖珠偶联。其他与 Fc 融合的 Notch 配体（如 Delta-like1-Fc）也可采用类似方式使...

哺乳动物的 Notch 信号通路与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的同源通路相似，包含四种跨膜 Notch 受体（Notch1-4）以及五种膜结合配体，分别属于 Jagged（JAG1 &amp;#38; JAG2）和 Delta样（DLL1、3、&amp;#38; 4）家族1。当信号接收细胞上的 Notch 受体与信号发送细胞上的配体结合时，Notch 信号通路被激活2。在此跨细胞激活过程中，膜结合的 Notch 配体会对膜结合的 Notch 受体施加拉伸力3,4。配体结合所产生的拉伸力诱导 Notch 受体发生构象变化，从而促进其被肿瘤坏死因子α转换酶（TACE）在胞外区切割，随后由含早老素的 γ-分泌酶复合物（γ-secretase）介导进行胞内切割。γ-分泌酶释放 Notch 胞内结构域（NICD），后者转入细胞核，与 CBF-1-Su(H)-Lag-1（CSL）、mastermind样蛋白（MAML）及细胞类型特异性因子形成转录激活复合物，驱动靶基因的表达5。
Notch 信号通路激活的力学机制导致在体外需要采用特殊的方法来激活 Notch 通路。in vitro条件下，可溶性 Notch 配体能够与 Notch 受体结合，但无法产生释放 NICD 所必需的拉伸力，同时还会竞争性抑制细胞相关 Notch 配体的结合。因此，向培养基中添加可溶性 Notch 配体可能会减弱正常的 Notch 信号传导6,7。幸运的是，若将 Notch 配体固定在适当刚性的基质上，则可诱导 NICD 的释放5,8,9,10。将细胞接种于配体包被的培养基质上，或将包被配体的微珠施加于细胞，均可激活 Notch 信号通路；具体方法的选择主要取决于所需的 Notch 刺激时机。若需在功能或分化实验的中期实现快速、短暂的 Notch 信号激活，可将 Notch 配体结合至琼脂糖微珠，加入培养细胞中，并可在任意时间通过洗涤去除。若需从培养初期即开始持续激活 Notch 信号通路，则可在细胞接种前预先用配体包被组织培养板。
本方案中，实验方法使用小鼠破骨细胞前体细胞进行，但此处描述的方法及其变体适用于多种细胞类型6,11,12,13,14破骨细胞是终末分化的造血系细胞，负责骨组织的吸收，与多种骨丢失疾病相关。15因此， 体外 破骨细胞由其单核/巨噬细胞系前体分化而来，研究该分化过程及调控其功能的分子机制，对于深入理解破骨细胞生物学特性以及开发新型骨再生治疗策略至关重要。尽管目前普遍认为Notch信号通路在破骨细胞的分化与功能中发挥促进作用，但由于Notch信号激活方式以及破骨细胞前体细胞培养与分化条件的差异，早期研究曾得出相互矛盾的结果16,17,18,19对方法学差异及遗传模型应用的深入分析已显著阐明了Notch信号在破骨细胞生成中的作用，但未来在研究Notch信号通路对其他细胞类型的影响时，采用标准化的Notch刺激与培养方法将有助于避免类似争议20,21,22,23.
培养和分化小鼠破骨细胞前体的方法有多种，与激活Notch信号通路的不同方法类似，最佳方法取决于具体的实验问题。本文将介绍我们首选的培养方法，即从小鼠长骨中冲洗出骨髓细胞后，分别培养其贴壁和非贴壁组分。该方法几乎不需要特殊设备，且所获得的细胞适用于多种分化方案，具有明显优势。

<table><tbody><tr><td>重组小鼠 M-CSF</td><td>Biolegend</td><td>576402</td><td>可从多家供应商获取，实验前需检测活性</td></tr><tr><td>重组小鼠 RANKL</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>200-04</td><td>可从多家供应商获取，实验前需检测活性</td></tr><tr><td>重组人 Jagged1-Fc</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1277-JG-050</td><td>可从多家供应商获取，实验前需检测活性</td></tr><tr><td>Protein G 琼脂糖微珠</td><td>InvivoGen</td><td>gel-agg-2</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 IgG Fc 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-001-008</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 细胞解离试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>用于分离破骨细胞前体细胞</td></tr><tr><td>酸性磷酸酶（白细胞，TRAP）检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td>用于染色已分化的破骨细胞</td></tr></tbody></table>

小鼠破骨细胞前体中notch信号通路的激活

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch 信号通路是多种生理和病理过程的关键组成部分。然而，Notch 信号通路的特性使得 体外 其作用的多变性及有时出现的矛盾性使得研究面临挑战。作为一种细胞间直接通讯的组成部分，Notch信号通路的受体和配体均结合在质膜上，因此无法被激活 体外 通过将配体简单地添加到培养基中即可激活许多其他信号通路，但Notch配体必须以固定化状态呈递给细胞。 
Notch信号激活方法的差异可导致培养细胞中产生不同的结果。尤其是在破骨细胞前体中，Notch刺激方法以及破骨细胞前体的培养与分化条件的差异，导致了关于Notch信号通路对破骨细胞分化起促进还是抑制作用的争议。尽管在不同Notch刺激条件下对破骨细胞分化进行更深入的比较 体外 并且，遗传学模型已基本解决了关于Notch信号通路与破骨细胞之间关系的争议，而建立培养细胞中Notch信号通路持续性与暂时性刺激的标准化方法，有望在未来避免此类分歧。
本方案描述了两种特异性刺激培养的小鼠破骨细胞前体中Notch信号通路的方法，尽管经过微小调整后，这些方法也应适用于任何贴壁细胞类型。第一种方法可实现Notch信号通路的持续刺激，其原理是在细胞接种前将Notch配体固定于组织培养表面。第二种方法利用与琼脂糖珠结合的Notch配体，可在细胞已贴附于培养表面后实现对Notch信号通路的短暂刺激。本方案还包括检测破骨细胞前体中Notch激活状态的方法，以及Notch信号通路激活的代表性转录标志物。

本方法旨在培养并激活破骨细胞前体中的Notch信号通路。在适当培养条件下，破骨细胞前体主要呈现细长的梭形形态，胞质光滑（图1A）。应避免破骨细胞前体发生免疫活化。一旦活化，前体细胞会铺展并变扁平，胞质呈泡沫状（图1B）。这些“煎蛋样”细胞对RANK信号具有抵抗性，无法有效分化为成熟的破骨细胞。在正确的培养与分化条件下，富集的破骨细胞前体将在三天内分化并融合形成大型TRAP阳性多核破骨细胞（图1C）。
将破骨细胞前体接种于Jagged1-Fc包被的表面后，24小时内可上调Notch信号通路靶基因的表达（图2）。Notch信号通路上调的特定基因因细胞类型而异。对于破骨细胞前体而言，Jagged1最显著上调的基因为Hes1，Hey2和Myc也有中等程度的上调，而其他Notch靶基因（如Hey1和p21）在Jagged1刺激破...

Notch 信号通路是一种依赖细胞间直接接触的细胞通讯形式。要有效诱导 Notch 信号通路 体外，Notch 配体必须以固定化状态呈递给细胞。本方案描述了相关方法 体外 小鼠破骨细胞前体中 Notch 信号通路的激活

小鼠破骨细胞前体中Notch信号通路的激活

Notch 信号通路是多种生理和病理过程的关键组成部分。然而，Notch 信号通路的特性使其在体外研究中具有挑战性。

本实验的总体目标是观察在破骨细胞分化过程的不同时间点激活 Notch 信号通路所产生的影响。该方法有助于回答细胞生物学领域的一些关键问题，例如：Notch 信号通路在细胞过程中所起的作用如何随时间变化？该技术的主要优势在于其灵活性，可被调整应用于其他细胞类型或 Notch 配体。尽管该方法可用于研究破骨细胞分化，也可应用于其他过程，如细胞存活、增殖，或其他细胞类型的分化。开始操作时，将小鼠固定于仰卧位，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。接着，沿一侧后肢的腹侧面做切口，暴露胫骨和股骨。接着通过膝关节做切口，游离股骨远端。在靠近骨盆的股骨末端处切断骨骼，取出股骨，并清除附着的软组织。在踝关节处切断，取下胫骨，并去除软组织。然后，用镊子夹住腿骨，将其置于一个15毫升的锥形管上方，将连接在10毫升注射器上的25又八分之五号针头插入骨的未切割端，通过骨的切割端将2.5毫升室温α-MEM培养基冲洗至管中。当所有骨髓被完全冲出后，骨骼将变为透明的浅褐色。每根骨骼的骨髓收集完毕后，静置使任何大块碎片沉降至管底，随后将不含碎片、含有骨髓细胞的上清液转移至一个新的15毫升离心管中。通过离心沉淀细胞。然后在0.5毫升ACK裂解缓冲液中于37°C裂解红细胞3分钟。孵育结束后，加入10毫升PBS恢复等渗状态，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于10毫升新鲜的Alpha MEM中用于接种。在100毫升经组织培养处理的培养皿中，放入小鼠。并将细胞在37摄氏度、湿润的组织培养孵育箱中孵育过夜。富集破骨细胞前体后，用 5 毫升 PBS 洗涤细胞，并在室温下加入 1 毫升细胞解离试剂处理 3 至 5 分钟，直至轻轻敲击培养皿即可使破骨细胞前体脱落。接着，向培养皿中加入 4 毫升 Alpha MEM 培养基，将细胞转移至 15 毫升锥形管中。计数后，用 Alpha MEM 将前体细胞稀释至浓度为 5 × 10⁴ 个细胞/毫升。加入MCSF和RANKL进行处理，随后立即将1毫升细胞接种至24孔组织培养板的每个孔中。在37摄氏度、加湿的组织培养孵箱中继续孵育。两天后，更换为1毫升新鲜的破骨细胞诱导培养基，以继续诱导分化。为了持续模拟Notch信号，使用250微升的PBS溶液中的山羊抗人IgG Fc抗体包被24孔板的一个孔。室温孵育1小时后，用1毫升PBS洗涤三次，去除未结合的抗体。接着，在孔中加入PBS中的Jagged1-Fc融合蛋白，室温孵育2小时。孵育结束后，用新鲜的PBS洗涤孔板三次，方法如前所述。第三次洗涤后，吸除PBS，并立即在涂覆表面上每平方厘米接种2.6×10⁴个破骨细胞前体。然后将培养板转移至组织培养孵育箱中，持续激活Notch信号通路，最长可达三天。为暂时激活Notch信号，首先将1微克Jagged1-Fc与40微升Protein G Agarose磁珠加入1.5毫升PBS中，在4摄氏度下

stimulation-of-notch-signaling-in-mouse-osteoclast-precursors

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在鼠标破骨细胞前体Notch信号的刺激

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学习在体外刺激小鼠破骨细胞前体中Notch信号的方法，以阐明该信号通路在破骨细胞分化过程中的作用。此技术可应用于细胞存活、增殖及其他细胞类型分化的研究。

小鼠破骨细胞前体中Notch信号通路的激活

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