马卵母细胞中染色体分离、组蛋白乙酰化及纺锤体形态的分析

本实验方法的总体目标是：首先，从形态学和生物化学角度对马卵母细胞进行表征；其次，比较同一动物体内和体外处理的配子。该实验方法有助于回答单排卵物种卵母细胞生物学和生育力方面的关键问题，还可能提高配子操作过程的安全性。

该方法的开发旨在克服卵母细胞样本来源受限的问题，尤其是来自单排卵物种的样本。OPU 操作流程将由列日大学的斯特凡·德勒兹（Stefan Deleuze）教授、本人实验室的实验室主管塞西尔·杜埃（Cecile Douet）以及法国国家农业、食品与环境研究院（INRA）中央卢瓦尔河谷中心马科动物单元负责人法布里斯·雷尼耶（Fabrice Reigner）进行演示。每日需使用超声波对一群成年母马的卵巢卵泡直径进行评估。

寻找直径大于33毫米的优势卵泡。一旦找到，准备注射1,500单位人绒毛膜促性腺激素，以诱导卵母细胞成熟为优势卵泡。接着，定位颈静脉沟，并用酒精擦拭注射部位。

然后，为使静脉隆起，在注射部位下方两到三厘米处施加一定力度。将针头几乎平行于颈部刺入，轻轻回抽以确认针头已在静脉内，随后注射激素。准备用于阴道检查的超声探头。

然后，将针头连接至吸引系统。在hCG注射后35小时，准备卵母细胞采集（OPU）所需的仪器，并对母马进行镇静。良好的镇痛效果对于动物和操作人员的安全至关重要。

一只不感到疼痛或不适的动物将允许对卵巢进行操作，从而使穿刺和冲洗更易于实施。插入针状探头后，一名操作者需调整卵巢位置以对准探头，同时另一名操作者操控针头。在超声图像中定位优势卵泡。

然后，使用针头穿刺阴道壁及优势卵泡的壁层。一旦进入卵泡腔，即吸取卵泡液。旋转针头以刮取卵泡壁，使卵丘-卵母细胞复合体附着于针头。

然后，将液体倒入一个大型培养皿中。在体视显微镜下寻找卵丘-卵母细胞复合体（COC）。同时，用含有肝素的温育杜尔贝科改良磷酸盐缓冲液（Dulbecco's modified PBS）冲洗卵泡。

可能需要冲洗数次才能收集到卵丘-卵母细胞复合体（COC）。找到COC后，更换为双腔针头，从所有直径在5至25毫米之间的卵泡中收集未成熟的COC。这些卵丘-卵母细胞复合体将用于体外成熟。

当一侧卵巢的所有卵泡均完成抽吸后，重复相同操作，从另一侧卵巢收集未成熟的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。随后对COCs进行筛选，仅保留具有多层完整卵丘细胞且胞质呈棕色、细颗粒状的COCs。

丢弃其余物品。操作结束后，给母马注射 15,000 单位苄青霉素以预防感染。随后，将母马安置在安静、清洁的马厩中至少两小时，直至其恢复。

在开始OPU之前，将一瓶添加物补充的HEPES缓冲TCM-199预热至37摄氏度。接着，准备IVM培养基。将500微升添加物补充的碳酸氢钠缓冲TCM-199分别加入四孔板的各孔中。

然后，将培养皿置于38.5摄氏度下孵育至少两小时。将回收的未成熟COCs转移至一个含有2毫升预温HEPES TCM-199的3.5厘米培养皿中。将COCs在培养皿的不同区域间移动，以轻柔洗去周围的碎片。

现在，将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至体外成熟（IVM）培养基中，在38.5摄氏度条件下培养28小时。为对成熟的COCs进行染色体计数，需将其在含100微摩尔浓度单星素（monastrol）的培养基中、38.5摄氏度条件下孵育1小时。接着，用含有0.5%透明质酸酶的HEPES缓冲TCM-199液处理COCs，以去除卵丘细胞。

在设定为 38 摄氏度的加热台上监测此反应。约五分钟后，移除所有细胞。通过轻柔吹打去除最后几个顽固的细胞。

接下来，使用含0.2%蛋白酶的HEPES缓冲TCM-199培养基去除透明带。同样在加热载物台上监测此反应，反应完成大约需要五分钟。

然后，在含有4%多聚甲醛的DPBS中于38.5摄氏度固定卵母细胞15分钟，随后在4摄氏度继续固定45分钟。固定结束后，将卵母细胞在三孔DPBS中含0.1%聚乙烯醇的溶液中依次转移洗涤。每孔使用约0.5毫升溶液。

然后，将卵母细胞转移至含有0.3% Triton X-100的PBS孔中，在室温下孵育10分钟。为阻断非特异性信号，用含1% BSA和10%正常驴血清的DPBS孵育细胞，在室温下孵育至少30分钟。

30分钟后，加入一抗，并在4°C条件下孵育细胞过夜。次日，洗涤卵母细胞，并在室温避光条件下加入二抗孵育1小时。加入二抗后，再次洗涤卵母细胞。

然后，在封片前，将双面胶带条贴在载玻片上，作为盖玻片的支撑。现在，将卵母细胞以每张载玻片3至4个的密度置于含有20 µM YO-PRO-1的非硬化抗荧光淬灭封片剂液滴中进行封片。让卵母细胞沉降约10分钟，然后盖上盖玻片。

从优势卵泡经OPU获取的32个卵丘-卵母细胞复合体（COCs）中，有28个处于减数第二次分裂中期（metaphase II）。通过体外成熟培养，从非优势卵泡收集的44个COCs中有37个发育至减数第二次分裂中期。随后对两组的染色体情况进行比较。体外成熟的卵母细胞常出现非整倍体，主要表现为多倍体；而在体内成熟的卵母细胞中未观察到此现象。

接下来，测量了纺锤体从极到极的长度以及纺锤体最大处的直径。体外成熟卵母细胞的长度和宽度均显著大于体内成熟卵母细胞。在相同样本中，检测了组蛋白H4K16乙酰化的整体水平。

结果符合预期。体外成熟卵母细胞中 H4K16 的乙酰化水平显著低于体内成熟卵母细胞。一个训练有素的团队可在一次上午的卵母细胞采集术（OPU）中处理五匹母马，其排卵前卵母细胞的回收率达到 80%，未成熟卵母细胞的回收率为 50% 至 60%。

在OPU过程中，始终监测动物的状况和健康状况，并随时准备在需要时提供适当的兽医护理。该实验方法也可应用于其他物种的卵母细胞，尤其适用于样本获取困难的情况，例如人类。根据我们的结果，必须开展研究以更好地了解染色体正确分离和表观遗传修饰所需的培养条件。

总体目标是提高兽医学和人类生育治疗中的体外成熟效率。