综合程序，以评估在体内癌症纳米医学的性能

该程序的总体目标是评估癌症纳米药物在荷瘤、免疫功能正常的小鼠体内、组织、单细胞和亚细胞水平的行为。这种方法可以帮助回答癌症纳米医学领域的关键问题。随着时间的推移，纳米药物如何在活体动物的不同组织中定量积累？

该技术的主要优点是这种双重标记方法允许从宏观到微观层面的体内纳米药物表征。我们选择脂质体作为示例来展示我们的程序，因为脂质体目前正处于临床使用中，它们也是实验纳米药物的常用平台。要开始该程序，请溶解 20 毫克脂质混合物，其中包括 0.1% 摩尔的亲脂性阳离子荧光染料和 2 毫升氯仿。

然后，用旋转蒸发器干燥脂质。向干脂质中加入 20 毫升磷酸盐缓冲盐水。使用 3.8 毫米探针超声仪以 30 瓦的功率在冰上对混合物进行超声处理 30 分钟，始终保持混合物在 4 到 20 摄氏度之间。

将得到的脂质体纳米颗粒悬液以 4， 000 G 离心 10 分钟。丢弃沉淀，用 PBS 洗涤脂质体，使用 4000 G 的 100 千道尔顿 MWCO 离心过滤装置，将浓缩的脂质体从顶部腔室转移到新的离心管中。脂质体可以在 PBS 中储存在冰箱中长达一周。

对 50 微升纯化的脂质体悬浮液和 950 微升 PBS 的混合物进行动态光散射。测量颗粒大小并确定粒度分布。要开始放射性标记程序，将所需体积的纯化脂质体和 PBS 转移到 1.5 毫升试管中，以获得 2 毫克脂质。

在此基础上加入 1 毫居里草酸锆-89，最终体积为 100 微升，pH 值为 6.9 至 7.1。将混合物在 37 摄氏度下搅拌 2 小时。然后，用 100 千道尔顿过滤装置以 4， 000 G 离心过滤去除游离锆-89，然后用无菌 PBS 在 4， 000 G 下洗涤截留物 3 次，然后，将截留物稀释至每微升约 3 微居里注射。

使用尺寸排阻 HPLC 与辐射检测器配对，以确定放射性标记脂质体的放射化学纯度。如果放射化学纯度低于 95%，则重新配制剂量。使用动态光散射确认粒径和分布值都与非放射性标记脂质体的粒径和分布值相似。

要开始成像程序，将大约 300 微居里放射性标记的脂质体注射到受束缚的黑色素瘤小鼠的尾静脉中。注射后 2 分钟，使用 28 号胰岛素注射器从小鼠尾静脉收集 10 至 20 微升血液。将血液样本转移到预先称重的计数管中。

称量血液样本并使用 γ 计数器测量活性。计算放射性浓度，以每克注射剂量的百分比表示。注射后 15 分钟，以相同的方式收集并测量另一份血样。

然后，通过鼻锥施用 2% 异氟醚和氧气来麻醉小鼠。注射后 1 小时收集并测量第三份血样。然后，让鼠标在恢复笼中恢复，直到恢复正常活动能力。

在注射后 4 小时、8 小时、24 小时和 48 小时采集更多样品。让鼠标在两次注射之间完全恢复。将老鼠安置在专为动物提供的房间内，该房间已施用了放射性物质。

在脂质体注射后 24 或 48 小时，用 2% 异氟醚和氧气麻醉小鼠。将小鼠趴在小动物 microPET-CT 扫描仪床上。继续通过鼻锥输送 2% 异氟醚和氧气。

将兽医药膏涂抹在老鼠的眼睛上，以防止它们干燥。然后，将扫描仪平台移至仪器中。执行 15 分钟的全身 PET 静态扫描，至少有 5000 万个重合事件，能量为 250 至 700 千电子伏特，符合计时窗口为 6 纳秒。

接下来，执行 5 分钟的 CT 扫描，在 220 度上旋转 120 个步骤，每帧大约 145 毫秒。扫描完成后，立即通过二氧化碳窒息处死小鼠。通过捏住动物的爪子来确认死亡，然后进行颈椎脱位。

用 PBS 灌注组织以去除血液，并收获相关的组织样品。称量收集的组织并测量它们的活性。计算组织中放射性标记的脂质体积累，以每克注射剂量的百分比表示。

将肿瘤组织储存在冷 PBS 中。对收获的肿瘤组织进行离体流式细胞术和免疫荧光成像，以测量相对于细胞群的积累。注射锆 89 标记的纳米颗粒的荷瘤小鼠的 PET/CT 成像显示，注射后 24 小时在肿瘤组织中显着积累 nana颗粒。

纳米颗粒的血液半衰期确定约为 10 小时。注射后 24 小时的离体生物分布测量与体内 PET/CT 测量一致。然后使用免疫染色技术在单细胞水平上研究纳米颗粒积累。

流式细胞术表明，发现纳米颗粒优先在肿瘤辅助巨噬细胞中积累。肿瘤样本的免疫荧光成像也表明纳米颗粒特异性靶向内皮细胞。这项技术可以帮助研究人员确定有前途的纳米药物用于临床转化。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三天内完成。在对纳米药物进行放射标记时，采用高标准的质量控制非常重要。在此程序之后，可以标记其他纳米药物，例如纳米乳剂、聚合物纳米颗粒、胶束、抗体和抗体片段，以测量它们在荷瘤小鼠中的体内性能。