Name: 综合程序，以评估在体内癌症纳米医学的性能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解癌症纳米药物在体内的综合评估方法，使用双标记技术在荷瘤免疫活性小鼠中进行系统、组织、单细胞及亚细胞水平的定量分析。该方法有助于筛选具有临床转化潜力的纳米药物候选物。

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作者谨向西奈山伊坎医学院的 Helene Salmon 博士和 Miriam Merad 博士致谢，感谢他们提供 B16-F10-YFP 细胞以及在黑色素瘤小鼠模型方面的专业建议。作者还感谢纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSK）的动物影像核心设施、放射化学与分子影像探针核心设施以及分子细胞学核心设施所提供的支持。本研究由美国国立卫生研究院基金资助：NIH 1 R01 HL125703（W.J.M.M.）、R01CA155432（W.J.M.M.）、K25 EB016673（T.R.）和 P30 CA008748（MSK 中心基金）。作者同时感谢 MSK 分子影像与纳米技术中心（CMINT）提供的经费支持（T.R.）。

该实验流程包括纳米颗粒的双放射性和荧光标记、体内 PET-CT 成像、离体 生物分布测定，以及离体 免疫染色和流式细胞术分析。所有动物实验均经纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 双标记脂质体的制备
注意：可在吸入含 2% 异氟烷的氧气进行麻醉后，将 300,000 个 B16-F10 细胞注射到 C57BL/6 小鼠背部侧 flank 以诱导同源 B16 黑色素瘤肿瘤。手术过程中需在无菌环境中使用无菌试剂和器械。术后应仔细观察动物，直至其从麻醉中恢复。只有当动物完全恢复意识和活动能力后，方可将其放回笼中。携带异种移植肿瘤的动物应饲养在无菌动物房中。体积为 300 mm3 的肿瘤最适合用于纳米颗粒表征，因其具有显著的增强渗透与滞留效应（EPR），可促进纳米颗粒的富集。详细实验方案如下。
<ol>
	<li>在圆底烧瓶中，将20 mg脂质混合物溶解于2 mL含有1,2-二棕榈酰- sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC），胆固醇，1,2-二硬脂酰基- sn二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000），二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-去铁胺（DSPE-DFO） 8，以及摩尔比分别为61.3%、33.4%、5%、0.2%和0.1%的1,1-二碘十二烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚羰花青-5,5-二磺酸（DiIC12[5]-DS）。 
	注意：该脂质组成与目前临床使用的多柔比星脂质体配方非常相似 2. 我们实验所制备的脂质体将高度模拟 体内 临床纳米医学的性能</li>
	<li>使用旋转蒸发仪在室温下去除有机溶剂，形成脂质薄膜。加入20 mL PBS，使用3.8 mm超声探头在30 W功率下超声30分钟，期间置于冰上充分冷却，以制备脂质体纳米颗粒。</li>
	<li>以 4,000 × g 离心脂质体溶液 10 分钟，去除聚集体，并使用离心过滤法（截留分子量（MWCO）：100 kDa）用 PBS 洗涤纳米颗粒，以去除游离脂质和残留有机溶剂。浓缩保留在滤膜上方室中的脂质体，并将其转移至新离心管中。脂质体可在 PBS 中于冰箱内保存最多 1 周，再进行后续步骤。</li>
	<li>为进行质量控制，采用动态光散射（DLS）对脂质体进行表征。具体而言，将50 µL脂质体与950 µL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，然后将混合液转移至粒径测定比色皿中。将比色皿放入分析仪，测定颗粒尺寸及其尺寸分布。预期颗粒尺寸为90–120 nm，多分散系数（PDI）为0.1–0.2。</li>
	<li>用于放射性标记时，将相当于2 mg脂质的纯化脂质体与1 mCi放射性同位素在pH为6.9至7.1的磷酸盐缓冲液（PBS）中混合 89在1.5 mL离心管中，37 °C下反应2 h（总体积：约100 µL），去除未反应的游离物 89通过离心过滤（截留分子量 = 100 kDa）浓缩 Zr，步骤与 1.3 相似。用无菌 PBS 洗涤截留物，并将其稀释至所需体积。放射化学产率应为 80 - 95%。 
	警告！ 操作放射性物质受到严格监管。相关机构必须获得资质认证，并提供必要的设施、人员培训以及对放射性物质使用的严格监控。研究人员在接触放射性物质时，必须接受充分培训，并穿戴个人防护装备以及佩戴剂量计戒指或徽章。</li>
	<li>通过尺寸排阻放射性高效液相色谱法测定放射性标记脂质体的放射化学纯度，通常应高于98% 10放射化学纯度低于95%表明步骤1.5中的洗涤不充分。</li>
	<li>放射性标记后，通过动态光散射法测定纳米颗粒的粒径。粒径和多分散系数（PDI）应与步骤1.4中的测量结果处于相同范围内。 10. 
	注意：如果流式细胞仪或荧光显微镜不允许使用放射性样品，可采用非放射性 natZr-草酸盐可用于在步骤1.5中标记脂质体。这些非放射性脂质体与其放射性对应物具有相同的特性。本方案的示意图如下所示： 图2.</li>
</ol>
2. 体内 双标记脂质体的PET-CT成像与生物分布
<ol>
	<li>通过尾静脉向束缚状态的黑色素瘤小鼠（C57BL/6，雌性，10 - 16 周龄）注射约 100 µL 双标记脂质体，放射性活度约为 300 µCi，剂量约为每公斤体重 10 mCi 89Zr。</li>
	<li>为测定半衰期，使用 28 G 胰岛素注射器从吸入含 2% 异氟烷氧气麻醉下的动物尾静脉采血。在注射后 2 分钟、15 分钟、1 小时、4 小时、8 小时、24 小时和 48 小时，将血液（10 - 20 µL）收集至预先称重的试管中。通过差重法测定血液质量，使用γ计数器测定放射性活度，并以每克组织占注射剂量的百分比（%ID/g）计算放射性浓度。 
	注意：该操作应在配备麻醉系统、恢复笼、加热装置和生物安全柜的房间内进行。确保动物在转移回饲养笼前已完全恢复并恢复正常活动能力。携带肿瘤的动物应饲养在专用于接受放射性物质处理动物的房间内。</li>
	<li>注射 脂质体后 24 或 48 小时，在小动物 MicroPET-CT 扫描仪中对小鼠进行成像10。将麻醉后的动物俯卧位水平放置，并维持麻醉状态。通过鼻罩给予 2% 异氟烷-氧气混合气体。扫描前涂抹眼药膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>进行全身静态 PET 扫描，记录至少 5000 万个符合事件，持续时间约 15 分钟。能量窗和符合时间窗分别设置为 350–700 keV 和 6 ns。随后进行 5 分钟的计算机断层扫描（CT）。X 射线管电压设为 80 kV，电流为 500 µA；CT 扫描采用 120 个旋转步进，总旋转角度为 220 度，每帧约 145 ms10。</li>
	<li>PET-CT 扫描后，立即通过二氧化碳窒息法处死小鼠，并通过捏压动物足爪确认死亡。确认死亡后，实施颈椎脱位。</li>
	<li>通过先剪开右心房，再向左心室注入 20 mL PBS 的方式冲洗小鼠组织中的血液，随后收集肿瘤、肝脏、脾脏、肺、肾、肌肉等相关组织16。</li>
	<li>称量组织，通过γ计数测定其放射性活度8 , 9，并以每克组织占注射剂量的百分比（%ID/g）计算组织中放射性蓄积量。</li>
</ol>
3. 离体 流式细胞术与免疫染色
注意：通过尾静脉向黑色素瘤小鼠注射约 100 µL 荧光脂质体，剂量为每公斤体重 0.5 mg 染料。如果流式细胞仪和荧光显微镜不允许使用放射性样品，则必须使用非放射性脂质体。
<ol>
	<li>在注射后24小时处死小鼠，步骤同2.5，并取出肿瘤组织，须将其保存于冷的PBS中。</li>
	<li>进行流式细胞术时，请遵循以下步骤 17:
	<ol>
		<li>在流式细胞术缓冲液（含0.5% BSA和1 mM EDTA的PBS）中配制酶混合液，包含纯化的胶原酶I和II（4 U/mL）、透明质酸酶（60 U/mL）以及DNase I（60 U/mL）。</li>
		<li>将100 mg肿瘤组织与200 µL酶混合液缓冲液加入1.5 mL离心管中，用精细剪刀将组织剪成小块。向管中再加入1.3 mL酶混合液，混匀后转移至6孔板中。</li>
		<li>将6孔板置于37 °C培养箱内的水平摇床上，以60 rpm振荡60分钟。</li>
		<li>用流式细胞术缓冲液将组织匀浆洗涤3次，以获得单细胞悬液。</li>
		<li>使用特异性针对包括 CD45、CD11b、Ly6C、CD11c、CD64、CD3、MHCII 和 CD31 等生物标志物的抗体混合物对细胞进行染色（所有抗体稀释比为 1:200；克隆信息见材料清单电子表格）。利用适当的流式细胞术分析软件，鉴定相关细胞类型，并测定每种细胞群体中 DiIC12(5)-DS 的平均荧光强度（MFI）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行免疫染色时，请遵循以下步骤：
	<ol>
		<li>将肿瘤放入装有最佳切割温度介质（OCT）的包埋盒中，并在干冰上冷冻。</li>
		<li>从肿瘤组织制备6-µm的冷冻切片，并将其置于组织学玻片上；切片应覆盖肿瘤的最大横截面，以提供最具代表性的组织信息。</li>
		<li>染色生物标志物（ 例如， CD31用于内皮细胞）的目标物与相应抗体 例如， 抗CD31抗体（克隆号MEC13.3）。用多聚甲醛固定切片，用与二抗种属来源相匹配的血清进行封闭，4 °C孵育一抗12小时，随后室温孵育二抗2小时，最后用PBS洗涤并加盖盖玻片。使用Leica直立共聚焦SP5显微镜对染色切片进行成像。 13 , 16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露事项。

方案中的关键步骤：
高质量的双标记脂质体是长期获得一致结果的关键。游离的荧光染料或89Zr离子可能产生完全不同的靶向模式，必须在纯化步骤中彻底去除。此外，如果免疫系统对实验性癌症纳米药物的疗效具有显著影响，则应优先使用免疫健全的小鼠模型，例如本方案中全程采用的C57BL/6小鼠中的B16-F10黑色素瘤模型。如果肿瘤微环境或特定的基因突变组合是主要影响因素，则患者来源的肿瘤异种移植模型将是理想的选择。
修饰与故障排除：
我们的实验方法为评估纳米药物在荷瘤动物体内的in vivo性能提供了一种简单且可靠的方式。该方法可作为构建特定实验的基础，用于表征适用于不同应用场景的癌症纳米药物。例如，研究人员可在同一动物上于多个时间点进行PET-CT扫描，从而确定纳米材料的定量in vivo药代动力学参数17；也可通过分析其他组织（如大肠、小肠、胰腺、脑、皮肤、胸腺、胃或唾液腺）来获取纳米材料...

纳米医学正在改变癌症治疗研发的范式1受到先前癌症纳米药物（如脂质体和白蛋白纳米疗法）在临床上产生的巨大影响的启发2,3在过去十年中，已研制出许多新型制剂。然而，近期对这些癌症纳米药物临床转化成功率的分析表明，其中仅有少数获得了临床应用的批准4,5新癌症纳米药物在临床转化中的一个主要障碍是，与直接使用游离治疗化合物相比，其对治疗指数的提升十分有限6因此，对 体内 在临床前动物模型中，系统性、组织和细胞水平上评估纳米药物的性能，对于筛选出具有最佳治疗指数、可用于未来临床转化的候选药物至关重要。
纳米材料可通过放射性标记，利用正电子发射断层扫描（PET）成像在活体动物中进行定量表征，PET成像在所有临床成像模式中具有极佳的灵敏度和可重复性7例如， 89Zr标记的长循环纳米药物已在小鼠癌症模型中得到表征8,9,10以及其他疾病模型中11此外，可利用以下方法对纳米药物的血液半衰期和生物分布进行广泛评估 离体 个体组织中的放射性测量8因此，放射性标记可实现对纳米药物在全身和组织水平上的定量评估。
重要的是，由于放射性信号的空间分辨率有限，放射性标记的纳米药物通常无法在单细胞或亚细胞水平上进行分析。因此，荧光标记可作为评估纳米颗粒的一种补充手段，结合流式细胞术和荧光显微镜等光学成像技术进行研究。12为此，可对带有放射性同位素和荧光标记的纳米颗粒进行定量评估 体内 通过核成像和 离体 通过放射性计数进行检测，也可通过光学成像在细胞水平上进行广泛表征。
此前，我们已开发出模块化的方案，用于将放射性标记和荧光标记引入多种纳米颗粒中，包括高密度脂蛋白（HDL）11、脂质体9,10、聚合物纳米颗粒、抗体片段以及纳米乳剂10,13。这些标记后的纳米颗粒可在不同层次上对相关动物模型进行定量表征，从而指导这些纳米材料针对特定应用的优化。在本研究中，我们以脂质体纳米颗粒——目前最成熟的纳米药物平台14——为例，展示制备双标记纳米颗粒并对其进行系统表征的完整流程，所用模型为经典的同源黑色素瘤B16-F10小鼠模型15。根据研究结果，我们相信该纳米颗粒表征方法可推广应用于其他癌症纳米药物在相应小鼠模型中的评价。

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avantilipids</td><td>850355</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avantilipids</td><td>880120P</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-DFO</td><td>自制</td><td>110634</td><td>Perez-Medina &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;，JNM，2014</td></tr><tr><td>DiIC12[5]-DS</td><td>AAT Bioquest</td><td>22051</td><td></td></tr><tr><td>离心过滤器</td><td>Vivaproducts</td><td>VS2061</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Buchi</td><td>R-100</td><td></td></tr><tr><td>放射性高效液相色谱</td><td>岛津高效液相色谱仪，配备2台LC-10AT泵</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr-草酸盐</td><td>MSKCC</td><td>自行合成</td><td>TR19/9 可变束流回旋加速器（Ebco Industries Inc.）</td></tr><tr><td>微型PET-CT</td><td>西门子</td><td>Inveon Micro-PET/CT</td><td></td></tr><tr><td>γ计数器</td><td>PerkinElmer</td><td>2470-0150</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术</td><td>BD 生物科学</td><td>Fortessa</td><td>任何多参数流式细胞仪均可满足要求</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16-YFP 黑色素瘤细胞</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>鲑鱼 &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;，免疫学，2016</td></tr><tr><td>Ly6C（克隆 HK1.4）--APC-Cy7</td><td>128025</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>MHCII (M5/114/152)--APC</td><td>107613</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (30-F11)--BV510</td><td>103137</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td><td>139313</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70)--BV605</td><td>101237</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2)--BV711</td><td>100241</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3)--PE</td><td>561073</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td><td>117327</td><td>BD 生物科学</td><td></td></tr><tr><td>CD31（13.3）无荧光染料</td><td>550274</td><td>BD 生物科学</td><td></td></tr></tbody></table>

全面评估的综合流程 在体 内 癌症纳米药物的性能评估

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

受先前癌症纳米药物在临床应用中取得成功的启发，研究人员在过去十年中开发出了大量新型制剂。然而，仅有少数纳米药物获得临床应用批准，而大多数处于临床开发阶段的纳米药物却产生了令人失望的结果。阻碍新型癌症纳米药物成功实现临床转化的主要障碍之一，在于对其体内性能缺乏准确的理解。本文介绍了一种严谨的方法，通过整合正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）、放射性定量分析、流式细胞术和荧光显微镜技术，从系统性、组织、单细胞及亚细胞水平上表征纳米药物在荷瘤小鼠体内的体内行为。利用该方法，研究人员可在相关的癌症小鼠模型中准确评估新型纳米制剂。这些方案有望识别出最具前景、具有高转化潜力的癌症纳米药物，或有助于优化纳米药物以推动未来的临床转化。

图1展示了实验流程的总体概述。图2展示了步骤110中所述双标记脂质体的示意图合成流程。图3展示了步骤2中所述放射性纳米颗粒的代表性PET-CT图像（图3a）、PET成像的放射性定量结果（图3b）、血液半衰期（图3c）以及生物分布（图3d）。在图3a中，脂质体在肿瘤部位高度富集，该结果通过图3b中的成像定量结果得以证实。此外，脂质体在图3c中显示血液半衰期约为10 h。离体生物分布实验进一步确认了脂质体在肿瘤中的高积累。最后，图4展示了用于在单细胞水平分析纳米颗粒积累时识别肿瘤内相关细胞的典型设门流程（图4a...

对...的了解不足 体内 纳米药物的性能阻碍了其临床转化。用于评估的程序 体内 在荷瘤免疫活性小鼠中，癌症纳米药物在系统、组织、单细胞及亚细胞水平的行为特征被详细描述。该方法可帮助研究人员甄选具有临床转化前景的癌症纳米药物。

受先前癌症纳米药物在临床应用中取得成功的启发，研究人员在过去开发出了大量新型制剂……

本实验的总体目标是在荷瘤且免疫功能健全的小鼠体内，系统性地评估癌症纳米药物在整体、组织、单个细胞以及亚细胞水平上的体内行为。该方法有助于回答癌症纳米医学领域中的一个关键问题：纳米药物在活体动物不同组织中的随时间变化的定量蓄积情况如何？该技术的主要优势在于，这种双标记方法能够实现从宏观到微观水平对纳米药物进行活体表征。我们以脂质体为例来演示本实验流程，因为脂质体目前已被应用于临床，同时也是实验性纳米药物常用的载体平台。实验开始时，将20毫克脂质混合物（包含0.1%摩尔比的亲脂性阳离子荧光染料）溶解于2毫升氯仿中。然后，使用旋转蒸发仪将脂质干燥。向干燥的脂质中加入20毫升磷酸盐缓冲液。在冰上用3.8毫米探头超声仪以30瓦功率超声处理混合物30分钟，整个过程中保持混合物温度在4至20摄氏度之间。将所得的脂质体纳米颗粒悬浮液在4,000 G条件下离心10分钟。弃去沉淀，使用100 kDa分子量截留值（MWCO）的离心过滤装置，在4,000 G下用PBS洗涤脂质体。将浓缩后的脂质体从过滤装置上层转移至新的离心管中。脂质体可在冰箱中以PBS保存最多一周。取50微升纯化的脂质体悬浮液与950微升PBS混合，进行动态光散射检测，测量颗粒尺寸并确定粒径分布。开始放射性标记实验时，将所需体积的纯化脂质体和PBS转移至1.5毫升离心管中，使脂质总量为2毫克。加入1毫居的草酸锆-89，使终体积为100微升，pH值为6.9至7.1。在37摄氏度下搅拌混合物2小时。然后，使用100千道尔顿的滤膜单元在4,000 × g条件下进行离心过滤，以去除游离的锆-89。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）在4,000 × g条件下洗涤截留物3次。随后，将截留物稀释至约每微升3微居，用于注射。采用尺寸排阻高效液相色谱法（HPLC）结合放射性检测器，测定放射性标记脂质体的放射化学纯度。若放射化学纯度低于95%，则需重新配制剂量。采用动态光散射法确认粒径及其分布值与非放射性标记脂质体相似。开始成像程序时，将约 300 微居里的放射性标记脂质体注入固定好的黑色素瘤小鼠尾静脉。注射后 2 分钟，使用 28 号胰岛素注射器从小鼠尾静脉采集 10 至 20 微升血液。将血液样本转移至预先称重的计数管中。称取血样质量，用γ计数器测量放射性活度。计算每克组织中放射性活度占注射剂量的百分比。注射后15分钟，以相同方法采集并测量另一份血样。然后，通过鼻罩给予2%异氟烷和氧气以麻醉小鼠。注射后一小时采集并测量第三份血样。随后，将小鼠置于恢复笼中，直至其恢复正常活动能力。在注射后 4、8、24 和 48 小时收集额外的样本。每次注射之间应让小鼠充分恢复。将小鼠饲养在专门用于接收过放射性物质的动物的房间内。在脂质体注射后24或48小时，使用2%异氟烷和氧气麻醉小鼠。将小鼠俯卧位放置于小型动物microPET-CT扫描仪的载物床上。通过鼻罩持续输送2%异氟烷和氧气。将眼药膏涂抹于小鼠眼部，以防止其眼睛干涩。然后，将扫描床推入仪器内。进行为期15分钟的全身正电子发射断层扫描（PET）静态扫描，采集至少5000万个符合事件，能量范围为250至700千电子伏特，符合时间窗为6纳秒。接下来，以120个旋转步进在220度范围内进行五分钟的CT扫描，每帧约145毫秒。扫描完成后，立即通过二氧化碳窒息法处死小鼠。通过捏压动物足爪确认死亡后，再进行颈椎脱位。用 PBS 灌注组织以去除血液，并采集相应的组织样本。称量收集的组织并测定其放射活性。计算组织中放射标记脂质体的蓄积量，以每克组织中占注射剂量的百分比表示。将肿瘤组织保存在低温 PBS 中。对收获的肿瘤组织进行离体流式细胞术和免疫荧光成像，以检测纳米颗粒在不同细胞群体中的富集情况。对荷瘤小鼠注射用锆-89标记的纳米颗粒后进行 PET/CT 成像，结果显示注射 24 小时后肿瘤组织中纳米颗粒有显著富集。纳米颗粒的血液半衰期约为10小时。注射后24小时的离体生物分布测量结果与体内PET/CT测量结果一致。随后采用免疫染色技术在单细胞水平上研究了纳米颗粒的蓄积情况。流式细胞术结果显示，纳米颗粒优先在肿瘤相关巨噬细胞中富集。肿瘤样本的免疫荧光成像也表明，纳米颗粒对内皮细胞具有特异性靶向作用。该技术可帮助研究人员筛选具有临床转化前景的纳米药物。一旦掌握，该技术若操作得当，可在三天内完成。在对纳米药物进行放射性标记时，必须严格执行高质量的质量控制标准。按照本方案，其他类型的纳米药物，如纳米乳剂、聚合物纳米颗粒、胶束、抗体及抗体片段等，均可被标记，以用于测定其在荷瘤小鼠体内的体内性能。

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癌症研究

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全面评估的综合流程在体内癌症纳米药物的性能评估

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