全面评估的综合流程 在体 内 癌症纳米药物的性能评估

本实验的总体目标是在荷瘤且免疫功能健全的小鼠体内，系统性地评估癌症纳米药物在整体、组织、单个细胞以及亚细胞水平上的体内行为。该方法有助于回答癌症纳米医学领域中的一个关键问题：纳米药物在活体动物不同组织中的随时间变化的定量蓄积情况如何？

该技术的主要优势在于，这种双标记方法能够实现从宏观到微观水平对纳米药物进行活体表征。我们以脂质体为例来演示本实验流程，因为脂质体目前已被应用于临床，同时也是实验性纳米药物常用的载体平台。实验开始时，将20毫克脂质混合物（包含0.1%摩尔比的亲脂性阳离子荧光染料）溶解于2毫升氯仿中。

然后，使用旋转蒸发仪将脂质干燥。向干燥的脂质中加入20毫升磷酸盐缓冲液。在冰上用3.8毫米探头超声仪以30瓦功率超声处理混合物30分钟，整个过程中保持混合物温度在4至20摄氏度之间。

将所得的脂质体纳米颗粒悬浮液在4,000 G条件下离心10分钟。弃去沉淀，使用100 kDa分子量截留值（MWCO）的离心过滤装置，在4,000 G下用PBS洗涤脂质体。将浓缩后的脂质体从过滤装置上层转移至新的离心管中。脂质体可在冰箱中以PBS保存最多一周。

取50微升纯化的脂质体悬浮液与950微升PBS混合，进行动态光散射检测，测量颗粒尺寸并确定粒径分布。开始放射性标记实验时，将所需体积的纯化脂质体和PBS转移至1.5毫升离心管中，使脂质总量为2毫克。

加入1毫居的草酸锆-89，使终体积为100微升，pH值为6.9至7.1。在37摄氏度下搅拌混合物2小时。然后，使用100千道尔顿的滤膜单元在4,000 × g条件下进行离心过滤，以去除游离的锆-89。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）在4,000 × g条件下洗涤截留物3次。随后，将截留物稀释至约每微升3微居，用于注射。

采用尺寸排阻高效液相色谱法（HPLC）结合放射性检测器，测定放射性标记脂质体的放射化学纯度。若放射化学纯度低于95%，则需重新配制剂量。采用动态光散射法确认粒径及其分布值与非放射性标记脂质体相似。

开始成像程序时，将约 300 微居里的放射性标记脂质体注入固定好的黑色素瘤小鼠尾静脉。注射后 2 分钟，使用 28 号胰岛素注射器从小鼠尾静脉采集 10 至 20 微升血液。将血液样本转移至预先称重的计数管中。

称取血样质量，用γ计数器测量放射性活度。计算每克组织中放射性活度占注射剂量的百分比。注射后15分钟，以相同方法采集并测量另一份血样。

然后，通过鼻罩给予2%异氟烷和氧气以麻醉小鼠。注射后一小时采集并测量第三份血样。随后，将小鼠置于恢复笼中，直至其恢复正常活动能力。

在注射后 4、8、24 和 48 小时收集额外的样本。每次注射之间应让小鼠充分恢复。将小鼠饲养在专门用于接收过放射性物质的动物的房间内。

在脂质体注射后24或48小时，使用2%异氟烷和氧气麻醉小鼠。将小鼠俯卧位放置于小型动物microPET-CT扫描仪的载物床上。通过鼻罩持续输送2%异氟烷和氧气。

将眼药膏涂抹于小鼠眼部，以防止其眼睛干涩。然后，将扫描床推入仪器内。进行为期15分钟的全身正电子发射断层扫描（PET）静态扫描，采集至少5000万个符合事件，能量范围为250至700千电子伏特，符合时间窗为6纳秒。

接下来，以120个旋转步进在220度范围内进行五分钟的CT扫描，每帧约145毫秒。扫描完成后，立即通过二氧化碳窒息法处死小鼠。通过捏压动物足爪确认死亡后，再进行颈椎脱位。

用 PBS 灌注组织以去除血液，并采集相应的组织样本。称量收集的组织并测定其放射活性。计算组织中放射标记脂质体的蓄积量，以每克组织中占注射剂量的百分比表示。

将肿瘤组织保存在低温 PBS 中。对收获的肿瘤组织进行离体流式细胞术和免疫荧光成像，以检测纳米颗粒在不同细胞群体中的富集情况。对荷瘤小鼠注射用锆-89标记的纳米颗粒后进行 PET/CT 成像，结果显示注射 24 小时后肿瘤组织中纳米颗粒有显著富集。

纳米颗粒的血液半衰期约为10小时。注射后24小时的离体生物分布测量结果与体内PET/CT测量结果一致。随后采用免疫染色技术在单细胞水平上研究了纳米颗粒的蓄积情况。

流式细胞术结果显示，纳米颗粒优先在肿瘤相关巨噬细胞中富集。肿瘤样本的免疫荧光成像也表明，纳米颗粒对内皮细胞具有特异性靶向作用。该技术可帮助研究人员筛选具有临床转化前景的纳米药物。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在三天内完成。在对纳米药物进行放射性标记时，必须严格执行高质量的质量控制标准。按照本方案，其他类型的纳米药物，如纳米乳剂、聚合物纳米颗粒、胶束、抗体及抗体片段等，均可被标记，以用于测定其在荷瘤小鼠体内的体内性能。