系统抑制剂靶向细胞内的疗效和毒性筛选结核分枝杆菌

该方案的总体目标是提供化合物如何影响人巨噬细胞内结核分枝杆菌存活的多维评估。该方法以基于荧光素酶的功效测定为中心。当与细胞毒性相结合时，MIC 测定可以为 TB 药物开发中 HIT 化合物的修饰提供有用的信息。

我们方法的主要优点是节省时间和劳动力。它正在用基于荧光素酶的检测取代 CFU 集落形成单位检测。通常，刚接触这项技术的人会难以与手动移液而不是自动化保持一致性。

一致的移液技术至关重要。在完全培养基的 RPMI 中培养 THP1 细胞。同时在两次传代之间保持每毫升培养基 0.2 至 100 万个细胞的细胞密度。

使用分光光度计测量活性生长的细菌悬浮液的 OD 600 。然后使用 0.1 OD600 的转换因子计算细菌密度，等于每毫升第 7 个细菌的三倍 10。将足够的细菌移出，使 MOI 为 10：1 放入新的离心管中。

然后以 3， 000 倍 G 沉淀细菌 10 分钟。为了调理细菌，将 50 微升人血清添加到 450 微升 RPMI 1640 中，并用它以每 500 微升培养基 10 倍至第八个细菌的密度重悬细菌沉淀。让混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

接下来，使用血细胞计数器和倒置显微镜，确定 THP1 细胞培养密度。然后，在无菌离心管中，在 37 摄氏度下以 100 倍 G 的浓度沉淀细胞 10 分钟。吸出上清液，并以每毫升 100 万个细胞的密度在 RPMI 中以 100 万个细胞/毫升的密度重悬细胞。

添加 PMA 至终浓度为 40 ng/mL。这就是差异化混合。调理性调理结核分枝杆菌与 THP1 分化混合物的联合 MOI 为 10：1。

并将最终混合物以每孔 100 μL 的浓度分装在 96 孔白色平底板中。然后让分化和感染在 37 摄氏度下在含有 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育过夜。第二天，使用 100 微升 RPMI 清洗孔两次。

然后加入稀释至所需浓度的化合物，并在完全培养基中加入 RPMI。将板孵育三天。使用多通道移液器时，请记住练习缓慢而稳定的柱塞动作，并始终将移液器吸头落在每个孔内的同一位置，以尽量减少对 THP1 细胞的干扰。

孵育后，从孔中吸出培养基，并向每个孔中加入 50 μL 荧光素酶检测试剂。然后使用透明胶板密封剂密封板。将板在 22 摄氏度下孵育 5 分钟，然后使用光度计获得每孔 1 秒的读数。

为了区分 THP1 细胞，按照本视频前面部分所示制备分化混合物后，将 100 μL 分化混合物分配到透明的 96 孔细胞板的每个孔中。将细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳加湿培养箱中孵育过夜。第二天，从孔中吸出培养基，并使用 RPMI 1640 洗涤两次。

向孔中加入 100 微升在 RPMI 中稀释的化合物。然后，将细胞孵育三天。将 0.5 克 MTT 溶解在 100 毫升 PBS 中，制成每毫升 5 毫克的储备液。

然后对溶液进行过滤消毒。在三天孵育期结束前两个半小时，向每个细胞孔中加入 25 微升 MTT 溶液并完成孵育期。通过将 250 毫升 DMF 与 250 毫升去离子水混合来制备 50%NN 二甲基甲酰胺或 DMF。

按如下方式准备 MTT 提取缓冲液。将 100 克 SDS 放入 500 毫升瓶中，并加入 300 毫升 50% DMF。用小火让 SDS 溶解。

加入 10 毫升纯乙酸和 12.5 毫升 1 摩尔盐酸。然后，使用 50% DMF 将瓶子装满至 500 毫升标记。在处理期结束时，向每个孔中加入 100 微升提取缓冲液。

将混合物在 37 摄氏度下在含 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育过夜。第二天，读取 570 纳米处的吸光度。为了进行刃天青测定，在 7H9 ADST 中培养结核分枝杆菌至中锁期。

用 7H9 ADST 将培养物稀释至 OD 600 为 0.01。使用 7H9 ADST 将化合物稀释至测试浓度的两倍。并将 100 μL 每种稀释的化合物分装到透明 96 孔板的每个孔中。

将 100 微升稀释的细菌悬浮液转移到每个孔中。将板在 37 摄氏度下在加湿培养箱中孵育 5 天。将 10 毫克刃天青溶解在 100 毫升去离子水中。

并对溶液进行过滤消毒。向孔中加入 30 微升刃天青溶液。然后将细胞孵育 48 小时。

细菌生长由从蓝色变为粉红色的颜色表示。根据文本协议进行定量分析。该散点图显示了以相对发光单位测量的原始发光数据，用于处理结核分枝杆菌和 THP1 细胞上各种浓度的利福平。

在此图中，显示了与未处理井相比，处理过的井中的减少百分比和发光百分比。利福平能够以 0.1 μg/mL 的浓度减少细胞内结核分枝杆菌中 99.9% 的相对轻单位或 RLU。与之前发表的从 CFU 确定的结果类似。

在该图中，说明了 MTT 测定中使用的 G1-1H 浓度增加引起的细胞毒性。浓度为 10 和 3 微摩尔明显低于 IC 50 临界值。该图显示了不同浓度的抗生素阿普兰霉素对结核分枝杆菌转化刃天青的影响。

肉汤中的 MIC90 在每毫升 2.5 至 5 微克之间。这略高于之前公布的每毫升 1.5 微克的值。但它仍然在可接受的范围内。

如此处所示，对于孵育时间较长的所有实验，蒸发变得非常重要。因此，必须注意保持培养箱的湿度良好，以避免不一致。一旦掌握，这项技术可以在短短四天内提供可靠的细胞内数据。

在尝试此过程时，重要的是要记住对 THP1 细胞要温和，如果尝试在没有自动化的情况下尝试，请与移液保持一致。在此程序之后，可以使用其他方法（如高内涵筛选）来确定 hit 化合物是否具有抑菌或杀菌作用。开发后，该方案为结核病药物发现领域的研究人员快速评估化合物对人巨噬细胞内 MTB 的疗效铺平了道路。

不要忘记，与结核微生物打交道是危险的。处理这种微生物时，请使用预防措施和适当的设备。