靶向细胞内目标抑制剂的药效与细胞毒性筛选系统 结核分枝杆菌

本实验方案的总体目标是提供一种多维度评估方法，用于研究化合物对结核分枝杆菌在人类巨噬细胞内存活的影响。该方法基于一种以荧光素酶为基础的药效检测。当与细胞毒性及最低抑菌浓度（MIC）测定相结合时，可为结核病药物研发中命中化合物（HIT compounds）的结构优化提供有价值的信息。

本方法的主要优势在于节省时间和劳动力。它用基于荧光素酶的检测替代了菌落形成单位（CFU）检测。通常，初次接触该技术的研究人员在手动移液操作中难以保持一致性，而自动化操作则可避免此类问题。

一致的移液技术至关重要。在完全培养基中用RPMI培养THP1细胞。传代时，维持细胞密度为每毫升培养基0.2×10⁶至1×10⁶个细胞。

使用分光光度计测量处于活跃生长期的细菌悬液在600 nm处的光密度（OD600）。然后根据换算系数计算细菌密度，即0.1 OD600相当于每毫升3×10⁷个细菌。用移液器吸取足够量的细菌，使感染复数（MOI）达到10:1，并转移至新的离心管中。

然后在 3,000 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀细菌。为进行细菌的调理作用，将 50 微升人血清加入 450 微升 RPMI 1640 培养基中，并用此混合液将细菌沉淀重悬，使菌液密度为每 500 微升培养基含 1 × 10⁸ 个细菌。将该混合物在 37 °C 条件下孵育 30 分钟。

接下来，使用血细胞计数板和倒置显微镜测定 THP1 细胞培养密度。然后，在无菌离心管中，于 37 °C 下以 100 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞重悬于完全培养基 RPMI 中，调整细胞密度至每毫升一百万个细胞。

加入PMA至终浓度为40纳克/毫升，此为分化培养基。将经调理的结核分枝杆菌与THP1分化培养基按感染复数（MOI）10:1混合。

将最终混合液以每孔100微升分装至96孔白色平底板中。随后将板置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，于37摄氏度孵育过夜，以进行分化与感染。次日，用100微升RPMI培养基洗涤各孔两次。

然后加入用完全培养基稀释至所需浓度的化合物。将培养板孵育三天。使用多通道移液器时，应注意缓慢而稳定地按压移液器按钮，并始终将移液器吸头置于每孔内的相同位置，以尽量减少对THP1细胞的扰动。

孵育结束后，吸去各孔中的培养基，向每孔加入50 µL荧光素酶检测试剂。然后使用透明粘性板封膜密封培养板。在22 °C孵育5分钟，随后使用发光仪以每孔1秒的读数时间获取检测信号。

为诱导 THP1 细胞分化，在按本视频前述方法制备分化培养基后，将 100 微升分化培养基加入细胞接种好的透明 96 孔板的每孔中。将细胞置于含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中，37 摄氏度孵育过夜。次日，吸除各孔中的培养基，并用 RPMI 1640 培养基洗涤两次。

向孔中加入100 µL用RPMI不完全培养基稀释的化合物。然后，将细胞孵育三天。将0.5克MTT溶解于100 mL PBS中，配制成5 mg/mL的储存液。

然后将溶液过滤除菌。在三天培养期结束前2.5小时，向每孔细胞中加入25 µL MTT溶液，并完成培养过程。通过将250 mL DMF与250 mL去离子水混合，配制50% NN二甲基甲酰胺（DMF）溶液。

按如下步骤配制 MTT 裂解缓冲液：取 100 克 SDS 置于 500 毫升瓶中，加入 300 毫升 50% DMF。使用低温加热使 SDS 溶解。

加入10毫升纯乙酸和12.5毫升1摩尔盐酸。然后用50% DMF加至500毫升刻度线。处理期结束时，向每孔加入100微升提取缓冲液。

在含5%二氧化碳的湿润培养箱中，37摄氏度孵育混合物过夜。次日，在570纳米处读取吸光度。进行刃天青（resazurin）检测时，将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在7H9 ADST培养基中培养至对数中期。

用7H9 ADST将培养物稀释至OD600为0.01。用7H9 ADST将化合物稀释至测试浓度的两倍，并将每种稀释后的化合物各100微升分装到透明96孔板的每个孔中。

将100微升稀释后的细菌悬液转移至每个孔中。将板置于37摄氏度的加湿培养箱中孵育五天。将10毫克刃天青溶解于100毫升去离子水中。

并将溶液过滤除菌。向各孔中加入30微升刃天青溶液，然后将细胞培养48小时。

细菌的生长通过颜色由蓝色变为粉红色来指示。根据正文方案进行定量分析。该散点图显示了针对利福平不同浓度处理结核分枝杆菌和THP-1细胞所测得的原始发光数据，单位为相对发光单位。

在此图中，显示了处理孔与未处理孔相比的相对光单位减少百分比及发光情况。利福平在浓度为 0.1 微克/毫升时，能够使细胞内结核分枝杆菌的相对光单位（RLU）减少 99.9%。该结果与此前通过菌落形成单位（CFU）测定所得结果相似。

在此图中，展示了MTT法检测中使用不同浓度G1-1H所引起的细胞毒性。10 微摩尔和三微摩尔的浓度明显低于IC 50 cutoff值。该图显示了不同浓度的抗生素阿帕拉霉素对结核分枝杆菌还原刃天青作用的影响。

肉汤中的 MIC90 为每毫升 2.5 至 5 微克，略高于先前报道的每毫升 1.5 微克，但仍处于可接受范围内。

如本实验所示，对于孵育时间较长的所有实验，蒸发效应变得显著，因此必须注意保持孵育箱内充分湿润，以避免结果不一致。一旦掌握该技术，可在短短四天内获得可靠的细胞内数据。

在进行该实验操作时，务必注意轻柔处理THP1细胞，若未使用自动化设备，则加样操作应保持一致。完成本实验流程后，可进一步采用高内涵筛选等其他方法，以确定筛选出的化合物是具有抑菌还是杀菌作用。该方案建立后，为结核病药物研发领域的研究人员提供了在人源巨噬细胞内快速评估化合物对MTB活性的有效途径。

请注意，操作结核分枝杆菌具有危险性。在处理该微生物时，应采取预防措施并使用适当的设备。