Name: 系统抑制剂靶向细胞内的疗效和毒性筛选结核分枝杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 了解基于荧光素酶的高通量筛选系统，用于评估化合物对巨噬细胞内结核分枝杆菌的疗效及细胞毒性。该方法节省时间且自动化程度高，可加速抗结核药物研发进程。

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本工作由BC肺癌协会和Mitacs资助。

1. 细菌菌株与培养基
<ol>
	<li>将25 g牛血清白蛋白、10.0 g葡萄糖和4.05 g氯化钠溶于460 mL去离子水中，配制白蛋白葡萄糖盐溶液（ADS）。经滤膜除菌后，于4 °C保存。</li>
	<li>将4.7 g 7H9粉末和2 mL甘油加入900 mL纯化水中，配制7H9液体培养基。在121 °C下高压灭菌10分钟，随后冷却至室温再进行后续操作。取900 mL 7H9液体培养基，加入100 mL ADS和0.5 mL Tween80，配制成7H9ADST培养基。4 °C保存。</li>
	<li>称取50 mg硫酸卡那霉素，溶于1 mL去离子水中，终浓度为50 mg/mL。过滤除菌后，于-20 °C保存。每1 L 7H9ADST培养基中加入0.5 mL卡那霉素储备液。 
	注意：该培养基应新鲜配制，因此需根据培养规模相应调整体积。</li>
	<li>培养 M. tuberculosis 在含卡那霉素的7H9ADST静置培养液中培养。每日振荡培养物，并在OD600达到1.0之前进行稀释，以避免菌体聚集。 
	&#8203;注意： M. tuberculosis 用于本方法开发的菌株是带有 pJAK2 质粒的 H37Rv12pJAK2.A 是一种基于 pMV361 载体的整合型质粒，可实现萤火虫荧光素酶基因的高水平表达 hsp60 启动子，并可使用卡那霉素进行筛选。</li>
</ol>
2. THP-1 细胞培养基与维持
<ol>
	<li>向500 mL RPMI 1640培养基中加入50 mL热灭活的胎牛血清（FBS）和5 mL 200 mM L-谷氨酰胺，配制RPMI不完全培养基（FBS终浓度约为10%，谷氨酰胺终浓度为2 mM）。</li>
	<li>按照标准操作规程维持THP-1细胞培养13。简言之，在传代期间使用RPMI不完全培养基培养THP-1细胞，并保持细胞密度在每毫升培养基0.2×10⁶至1×10⁶个细胞之间。</li>
</ol>
3. 利用表达荧光素酶的M. tuberculosis H37Rv进行高通量细胞内筛选
<ol>
	<li>使用分光光度计在600 nm波长下测定处于活跃生长期的细菌悬液的光密度。利用换算因子0.1 OD600 = 每毫升3 × 107个细菌，计算细菌浓度。</li>
	<li>用移液器将相当于感染复数（MOI）为10:1所需的细菌量转移至新的离心管中，在3,000 × g条件下离心10分钟，弃去上清液。将50 µL人血清加入450 µL RPMI1640培养基中，并根据实验需求按比例调整体积。</li>
	<li>为进行细菌的调理作用，将菌体沉淀重悬于含10%人血清的RPMI1640培养基中，使细菌密度达到每500 µL含1 × 108个细菌。将混合物在37 °C孵育30分钟。使用血细胞计数板和倒置显微镜计数，确定THP-1细胞的培养密度。</li>
	<li>将细胞在无菌离心管中以100 × g、37 °C离心10分钟。吸除上清液后，将细胞重悬于不完全RPMI培养基中，调整密度为每毫升100万个细胞。加入佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯（PMA），使其终浓度为40 ng/mL。 
	注：此混合液后续称为分化混合液。</li>
	<li>将调理后的M. tuberculosis与THP-1分化混合液按MOI为10:1的比例混合，并将最终混合液以每孔100 µL分装至96孔平底白色板中。定期轻轻搅拌混合液以确保均匀性。将板置于含5% CO2的湿润化培养箱中，在37 °C下过夜培养，使细胞分化与感染同时进行。</li>
	<li>用每孔100 µL的RPMI培养基洗涤孔内物质两次。加入用不完全RPMI培养基稀释至所需浓度的待测化合物，继续孵育3天。</li>
	<li>吸除各孔中的培养基。每孔加入50 µL荧光素酶检测试剂。使用透明粘性板封膜密封板孔。在22 °C孵育5分钟后，使用化学发光仪进行检测，每孔读数时间为1秒。</li>
</ol>
4. 使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法进行细胞毒性分析14
<ol>
	<li>在透明的96孔板中，使用含40 ng/mL PMA的RPMI不完全培养基对THP-1细胞进行分化。维持细胞密度为每毫升100万个，并每孔加入100 µL。在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育过夜，以完成分化过程。</li>
	<li>吸除孔中的培养基，并用RPMI 1640洗涤两次。向各孔中加入用RPMI不完全培养基稀释的待测化合物，继续孵育3天。</li>
	<li>将0.5 g MTT溶解于100 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成5 mg/mL的储存液。经无菌过滤后避光保存于-20 °C；建议现用现配。</li>
	<li>在3天孵育期结束前2.5小时，向每孔加入25 µL MTT溶液，并继续完成孵育。</li>
	<li>通过将250 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）与250 mL去离子水混合，配制50% DMF溶液。</li>
	<li>按以下步骤配制MTT萃取缓冲液：称取100 g SDS置于500 mL试剂瓶中，加入300 mL 50% DMF。低温加热使SDS充分溶解，随后加入10 mL纯乙酸和12.5 mL 1 M HCl，最后用50% DMF定容至500 mL；最终缓冲液组成为50% DMF、20% SDS、2.5%乙酸和2.5% 1 M盐酸。</li>
	<li>处理期结束后，向每孔加入100 µL萃取缓冲液（使用前加热至45 °C以溶解可能析出的晶体）。在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育过夜，随后在570 nm波长处测定吸光度。 
	&#8203;注意：细胞毒性检测最好与使用同一批次及相同代次THP-1细胞的胞内筛选实验平行进行。</li>
</ol>
5. 使用刃天青分析法进行液体培养基中的活性分析3
<ol>
	<li>将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在7H9ADST培养基中培养至对数中期（~ 0.5 - 0.8 OD600）。用7H9ADST培养基将菌液稀释至0.01 OD600。将待测化合物用7H9ADST培养基稀释至测试浓度的2倍，然后向每孔加入100 µL稀释后的化合物。</li>
	<li>向每孔中加入100 µL稀释后的细菌悬液。将培养板置于37 °C、湿润的培养箱中孵育5天。将10 mg刃天青（resazurin）溶于100 mL去离子水中，过滤除菌。</li>
	<li>每孔加入30 µL刃天青溶液，48小时后观察颜色变化；细菌生长表现为颜色由蓝色变为粉红色。 
	注意：也可通过检测激发波长530 - 560 nm、发射波长590 nm处的荧光，或在570 nm和600 nm处的吸光度进行定量分析15。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明本研究不存在任何竞争性经济利益。

本研究的目的是利用人类细胞内感染模型，建立一种简单且成本效益高的高通量筛选方法 M. tuberculosis结核病是一种由肺泡巨噬细胞感染引起的疾病，其特征为 M. tuberculosis由于生物安全问题，过去的研究曾采用细菌和宿主细胞的生物模型。然而，已有研究表明，替代性细菌和非人类模型在药物研发中对苗头化合物向先导化合物转化的成功率预测能力较差，表明药物筛选最好在感染了目标病原体的人类细胞中进行 M. tuberculosis19,20,21,22.
在本方法中，我们对目前最先进的用于人巨噬细胞样THP-1细胞系的筛选方案进行了改进和优化。为了实现高通量检测，我们对感染流程引入了多项技术改进。首要改进是用基于荧光素酶的报告系统取代了菌落形成单位（CFU）测定中的所有步...

Mycobacterium tuberculosis 是结核病（TB）的致病菌，在全球范围内是导致发病和死亡的主要原因之一。药物敏感性结核病是一种可治疗的疾病，需联合使用多种抗生素治疗6个月。尽管该病可治，2015年全球结核病死亡人数仍估计达150万1。在过去10年中，人们对耐药性M. tuberculosis的流行情况日益关注。耐多药结核病（MDR-TB）定义为对至少异烟肼（INH）和利福平（RMP）耐药的结核病，且大多数MDR-TB菌株也对部分二线抗结核药物耐药，从而限制了治疗选择。耐药性带来的影响使合并感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的患者治疗面临更大挑战；2015年，全球有40万患者死于HIV相关结核病1。令人失望的是，在过去40年中，美国食品药品监督管理局仅批准了一种用于治疗MDR-TB的新型结核病药物——贝达喹啉2。为了在对抗结核病和耐多药结核病的斗争中保持领先，迫切需要在开发更有效且疗程更短的结核病疗法方面取得进展。
传统上，结核病药物筛选是在液体培养基中的体外（in vitro）生长条件下进行的，即将化合物加入正在生长的菌液中，通过在固体培养基上计数菌落形成单位（CFU）来评估其杀灭微生物的效果。由于CFU计数费时、费力且成本较高，已开发出多种间接方法以缓解这一问题。这些方法包括刃天青（Alamar Blue）活性检测法3、通过表达绿色荧光蛋白（GFP）的细菌检测荧光强度4、通过表达荧光素酶的细菌检测发光强度5，以及测定总三磷酸腺苷（ATP）含量6,7。
典型的结核病以肺部M. tuberculosis感染为特征，细菌在肺泡巨噬细胞的吞噬体内部定植并复制8。简单的液体培养表型筛选可能适用于胞外病原体；然而，从历史角度来看，通过该方法鉴定出的抗M. tuberculosis化合物在后续感染模型验证步骤中往往未能达到预期效果。我们建议，结核病药物筛选最好在胞内宿主细胞感染模型中进行。尽管如此，胞内模型在高通量筛选（HTS）开发中仍存在诸多技术和生物学障碍。其中一个主要障碍是感染过程的复杂性，表现为多个操作步骤以及中间洗涤步骤中去除胞外细菌的繁琐流程。第二个主要障碍是耗时较长，因为通常通过培养平板上的菌落形成单位（CFU）计数来检测细菌生长，这一过程需要超过3周才能完成。已有研究提出，采用自动化荧光显微镜结合荧光标记细菌的方法可替代CFU计数。然而，该方案需要较高的初期设备投入，许多研究实验室难以负担。一种简单、低成本且与疾病高度相关的高通量筛选方法将显著促进药物发现进程。
本研究中，我们报道了一种新型的模块化高通量筛选（HTS）系统，旨在提供一种快速、高度可扩展且经济的检测方法，适用于测定化合物对胞内M. tuberculosis的活性。该系统由三个模块组成：(i) 胞内感染模型，(ii) 细胞毒性，以及 (iii) 液体培养检测。综合最终结果可全面描述化合物的特性，并提供有关其潜在作用机制的附加信息。该筛选系统已在多个项目中应用，针对不同作用机制的化合物库进行了研究，包括药物协同作用分析9、自噬诱导能力研究10，以及抑制M. tuberculosis分泌的毒力因子（未发表数据）。此外，也对作用机制未知的化合物进行了研究11。该方法的一个改进版本已被我们的工业合作伙伴采用，作为筛选抗胞内M. tuberculosis新化合物的主要筛选手段11。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>吐温80</td><td>菲舍尔科技</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，pH7</td><td>安必胜</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>右旋葡萄糖</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>菲舍尔科技</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M 盐酸（HCl）</td><td>菲舍尔科技</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>菲舍尔科技</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>刃天青</td><td>阿尔法埃萨</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;M. tuberculosis&lt;/em&gt; H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔平底白色板</td><td>康宁</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>95孔平底透明板</td><td>康宁</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>透明板封膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Biomate 3</td><td></td></tr><tr><td>微孔板分光光度计</td><td>Biotek</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>发光检测仪</td><td>应用生物系统</td><td>Tropix TR717</td><td></td></tr></tbody></table>

靶向细胞内目标抑制剂的药效与细胞毒性筛选系统 结核分枝杆菌

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病（TB）的致病菌，也是全球发病和死亡的主要原因之一。随着耐多药结核病（MDR-TB）的传播日益广泛，迫切需要开发针对M. tuberculosis感染的新型治疗策略。传统上，化合物的评估主要基于其在液体培养基中体外（in vitro）生长条件下的抗菌活性；然而，对于M. tuberculosis等胞内病原体而言，液体培养中的表型筛选条件与人体内的实际疾病环境存在显著差异，因此结果往往具有误导性。由于M. tuberculosis感染的复杂性、感染程度的变异性以及复制速度缓慢，传统上在巨噬细胞内筛选有效抑制剂一直较为困难。在本研究中，我们报告了一种新方法，可快速评估化合物在巨噬细胞感染模型中对M. tuberculosis存活能力的影响。通过结合细胞毒性检测和液体培养中M. tuberculosis存活率检测，我们建立了一个能够对目标化合物进行综合分析的筛选系统。该系统能够在低成本条件下生成定量数据，适用于大多数实验室，并且具有高度可扩展性，可适应大规模工业环境的需求。

高通量细胞内筛选 M. tuberculosis 表达荧光素酶基因
图2A 和 表1 包含光度计收集的原始数据，以相对发光单位（RLU）表示，显示利福平浓度递增对结核病药物作用的影响 M. tuberculosis 在 THP-1 细胞内。 图 2A 是不同浓度利福平的原始发光值（RLU）的散点图。误差线表示均值的标准误差（SEM）。 图2B 显示了处理孔与未处理孔相比发光强度的降低百分比。数据表明，利福平能够降低发光强度 &gt; 99.9% 的 RLU 来自细胞内 M. tuberculosis 在浓度为 0.1 µg/mL。这与先前发表的 MIC 值在 0.1 至 0.4 µg/mL16每个孔中产生的发光信号表明了荧光...

我们开发了一种模块化的高通量筛选系统，用于发现针对Mycobacterium tuberculosis的新化合物，该系统可靶向胞内生长和液体培养基中生长的细菌，同时评估化合物对哺乳动物宿主细胞的细胞毒性。

结核分枝杆菌是结核病（TB）的致病菌，在全球范围内是导致发病和死亡的主要原因之一。随着其传播范围的不断扩大……

本实验方案的总体目标是提供一种多维度评估方法，用于研究化合物对结核分枝杆菌在人类巨噬细胞内存活的影响。该方法基于一种以荧光素酶为基础的药效检测。当与细胞毒性及最低抑菌浓度（MIC）测定相结合时，可为结核病药物研发中命中化合物（HIT compounds）的结构优化提供有价值的信息。本方法的主要优势在于节省时间和劳动力。它用基于荧光素酶的检测替代了菌落形成单位（CFU）检测。通常，初次接触该技术的研究人员在手动移液操作中难以保持一致性，而自动化操作则可避免此类问题。一致的移液技术至关重要。在完全培养基中用RPMI培养THP1细胞。传代时，维持细胞密度为每毫升培养基0.2×10⁶至1×10⁶个细胞。使用分光光度计测量处于活跃生长期的细菌悬液在600 nm处的光密度（OD600）。然后根据换算系数计算细菌密度，即0.1 OD600相当于每毫升3×10⁷个细菌。用移液器吸取足够量的细菌，使感染复数（MOI）达到10:1，并转移至新的离心管中。然后在 3,000 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀细菌。为进行细菌的调理作用，将 50 微升人血清加入 450 微升 RPMI 1640 培养基中，并用此混合液将细菌沉淀重悬，使菌液密度为每 500 微升培养基含 1 × 10⁸ 个细菌。将该混合物在 37 °C 条件下孵育 30 分钟。接下来，使用血细胞计数板和倒置显微镜测定 THP1 细胞培养密度。然后，在无菌离心管中，于 37 °C 下以 100 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞重悬于完全培养基 RPMI 中，调整细胞密度至每毫升一百万个细胞。加入PMA至终浓度为40纳克/毫升，此为分化培养基。将经调理的结核分枝杆菌与THP1分化培养基按感染复数（MOI）10:1混合。将最终混合液以每孔100微升分装至96孔白色平底板中。随后将板置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，于37摄氏度孵育过夜，以进行分化与感染。次日，用100微升RPMI培养基洗涤各孔两次。然后加入用完全培养基稀释至所需浓度的化合物。将培养板孵育三天。使用多通道移液器时，应注意缓慢而稳定地按压移液器按钮，并始终将移液器吸头置于每孔内的相同位置，以尽量减少对THP1细胞的扰动。孵育结束后，吸去各孔中的培养基，向每孔加入50 µL荧光素酶检测试剂。然后使用透明粘性板封膜密封培养板。在22 °C孵育5分钟，随后使用发光仪以每孔1秒的读数时间获取检测信号。为诱导 THP1 细胞分化，在按本视频前述方法制备分化培养基后，将 100 微升分化培养基加入细胞接种好的透明 96 孔板的每孔中。将细胞置于含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中，37 摄氏度孵育过夜。次日，吸除各孔中的培养基，并用 RPMI 1640 培养基洗涤两次。向孔中加入100 µL用RPMI不完全培养基稀释的化合物。然后，将细胞孵育三天。将0.5克MTT溶解于100 mL PBS中，配制成5 mg/mL的储存液。然后将溶液过滤除菌。在三天培养期结束前2.5小时，向每孔细胞中加入25 µL MTT溶液，并完成培养过程。通过将250 mL DMF与250 mL去离子水混合，配制50% NN二甲基甲酰胺（DMF）溶液。按如下步骤配制 MTT 裂解缓冲液：取 100 克 SDS 置于 500 毫升瓶中，加入 300 毫升 50% DMF。使用低温加热使 SDS 溶解。加入10毫升纯乙酸和12.5毫升1摩尔盐酸。然后用50% DMF加至500毫升刻度线。处理期结束时，向每孔加入100微升提取缓冲液。在含5%二氧化碳的湿润培养箱中，37摄氏度孵育混合物过夜。次日，在570纳米处读取吸光度。进行刃天青（resazurin）检测时，将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在7H9 ADST培养基中培养至对数中期。用7H9 ADST将培养物稀释至OD600为0.01。用7H9 ADST将化合物稀释至测试浓度的两倍，并将每种稀释后的化合物各100微升分装到透明96孔板的每个孔中。将100微升稀释后的细菌悬液转移至每个孔中。将板置于37摄氏度的加湿培养箱中孵育五天。将10毫克刃天青溶解于100毫升去离子水中。并将溶液过滤除菌。向各孔中加入30微升刃天青溶液，然后将细胞培养48小时。细菌的生长通过颜色由蓝色变为粉红色来指示。根据正文方案进行定量分析。该散点图显示了针对利福平不同浓度处理结核分枝杆菌和THP-1细胞所测得的原始发光数据，单位为相对发光单位。在此图中，显示了处理孔与未处理孔相比的相对光单位减少百分比及发光情况。利福平在浓度为 0.1 微克/毫升时，能够使细胞内结核分枝杆菌的相对光单位（RLU）减少 99.9%。该结果与此前通过菌落形成单位（CFU）测定所得结果相似。在此图中，展示了MTT法检测中使用不同浓度G1-1H所引起的细胞毒性。10 微摩尔和三微摩尔的浓度明显低于IC 50 cutoff值。该图显示了不同浓度的抗生素阿帕拉霉素对结核分枝杆菌还原刃天青作用的影响。肉汤中的 MIC90 为每毫升 2.5 至 5 微克，略高于先前报道的每毫升 1.5 微克，但仍处于可接受范围内。如本实验所示，对于孵育时间较长的所有实验，蒸发效应变得显著，因此必须注意保持孵育箱内充分湿润，以避免结果不一致。一旦掌握该技术，可在短短四天内获得可靠的细胞内数据。在进行该实验操作时，务必注意轻柔处理THP1细胞，若未使用自动化设备，则加样操作应保持一致。完成本实验流程后，可进一步采用高内涵筛选等其他方法，以确定筛选出的化合物是具有抑菌还是杀菌作用。该方案建立后，为结核病药物研发领域的研究人员提供了在人源巨噬细胞内快速评估化合物对MTB活性的有效途径。请注意，操作结核分枝杆菌具有危险性。在处理该微生物时，应采取预防措施并使用适当的设备。

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免疫学与感染

系统抑制剂靶向细胞内的疗效和毒性筛选<em&gt;结核分枝杆菌</em

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一种用于评估药物对a疗效的检测方法 结核分枝杆菌 感染模型

本视频展示了一种在液体培养基中进行的实验方法，用于测定杀菌性抗生素对结核分枝杆菌（Mycobacterium...

评估测试化合物在肉汤中抗分枝杆菌的效果

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高通量、实时、双读数检测细胞内抗菌活性与真核细胞毒性

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本文介绍了一种通过表型筛选鉴定潜在抗结核药物候选物的实验方案，包括4-氨基喹啉类化合物的化学合成、其对结核分枝杆菌最低抑菌浓度的测定，以及在哺乳动物细胞系中对其细胞毒性的评估。...

潜在抗结核候选物的鉴定：合成、最低抑菌浓度测定及哺乳动物细胞毒性评估的逐步指南

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