滞后链DNA合成的动力学研究体外由T7噬菌体复制蛋白

该程序的总体目标是检查引物和滞后链 DNA 合成的动力学。这种方法可以帮助回答 DNA 复制领域的关键问题，例如 DNA 引物酶形成的引物如何转移到 DNA 聚合酶并被 DNA 聚合酶利用。该技术的主要优点是它允许识别冈崎片段合成过程中的关键步骤。

由于本实验中使用了放射性物质，因此必须遵守有关安全使用和处置放射性物质的所有机构规定。首先将 2 微升甲酰胺染料缓冲液分装到 8 个 1.5 mL 聚丙烯管中，等于要分析的时间点数。接下来，制备一种 20 微升的混合物，由缓冲液、ATP、CTP、CTP 组成，由 P32、单链 DNA 模板和基因 4 蛋白或 GP 4 引物酶解旋酶标记在 α-磷酸基

将混合物在室温下孵育 5 分钟。5 分钟后，使用移液器取出 2 微升混合物，并在之前制备的 1.5 毫升试管中的一根试管中与 2 微升甲酰胺染料缓冲液混合。这是无反应对照。

向反应混合物中加入 2 微升 0.1 摩尔氯化镁，并立即启动计时器。每隔 10 秒，手动吸取两微升反应混合物样品，并与 1.5 毫升试管中的甲酰胺染料混合。收集完所有时间点后，将样品放入加热块中，以 95 摄氏度加热 5 分钟。

将样品等分试样上样到变性凝胶上进行电泳。通过制备反应混合物开始此过程。制备 400 微升溶液 A，其中含有缓冲液、GP 四六聚体、单链 DNA 模板、dNTP、ATP、CTP 和由 P32 标记在 α-磷酸基团上的 CTP。

制备 400 微升溶液 B，含有 1 X 缓冲液和 20 毫摩尔氯化镁。接下来，设置快速淬火流仪。打开仪器，在出现主菜单后，在仪器键盘上键入 seven，将注射器驱动器移动到初始位置。

打开缓冲液注射器位置进行加载。用淬灭液填充注射器 C，然后使用 10 mL 注射器向仪器缓冲液储液槽 A 和 B 中填充缓冲液。通过推入和推出柱塞来去除气泡。

更改旋钮位置以触发。键入 2 以调整注射器驱动杆的位置。按下向下调节按钮降低注射器，直到缓冲液从出口定量环中流出。

键入 escape 以返回到主菜单。要清洗管路，请将出口管路连接到真空装置上。将采样旋钮更改为 flush。

将旋钮设置到水平位置以关闭缓冲液注射器。打开真空吸尘器，将两个冲洗定量环浸入水中 10 秒钟，然后浸入甲醇中 10 秒钟。吸空气约 15 秒，或直到干燥，以擦干线圈。

要加载样本，请将样本旋钮位置更改为 load。将溶液 A 放入 1 mL 注射器中，将注射器插入其中一个样品上样口，以同样的方式将溶液 B 放入对面的样品上样口。通过在淬火流运行的主菜单上键入一个时间点来开始收集时间点。

输入反应时间，然后按 Enter。将显示要使用的反应回路编号。切换到所需的反应回路。

如前所述清洗试管后，转动样品旋钮进行加载。将反应混合物加载到样品定量环中，直到刚好超出中央混合室。转动所有旋钮以触发，并确认所有旋钮都处于正确位置。

将 1.5 mL 试管放在出口定量环的末端。按 go 运行反应。重复试管清洗程序后，重新装入缓冲液注射器 A 和 B，直到它们碰到缓冲液注射器驱动程序。

重复每个所需时间点运行反应的步骤，但有一个例外，在淬灭零时间点对照时不要加载溶液 B。样本采集完成后，输入 escape 返回主菜单。按 7 将缓冲液注射器驱动器返回到其初始位置。

取出反应混合物注射器开始净化仪器，将样品加载旋钮转到加载位置。在真空下，用氢氧化钠、磷酸和甲醇各 10 mL 清洗每个样品定量环。按下所有三个注射器柱塞以取回反应并淬灭缓冲液。

用 5 毫升水清洗注射器至少两次。再次向注射器中注入 5 毫升水，将旋钮转到着火位置，打开真空，然后通过键盘命令将驱动器放下以排出水。如前所述清洗管路。

最后，关闭快速淬火流仪器。随后按照文本协议中的说明对样品进行分析。这些结果是通过在多次周转条件下对 GP four 催化的引物合成反应进行手动采样而获得的。

标记的前体 CTP 显示出最高的迁移率，并向凝胶底部迁移，其次是迁移速度较慢的物质，对应于 GP four 合成的染料和四核糖核苷酸。根据孵育时间和模板序列上下文，可以观察到与高级低聚物相对应的其他标记产物。当使用快速淬灭仪在时间尺度上检查GP 4催化的反应时，时间尺度从几秒到几毫秒不等，很明显引物积累不是线性的，而是显示出由实线表示的双相分布。

这表明产物形成是快速的，并且在稳态下释放是限速的。虚线表示假设的进展曲线，如果 GP 4 的引物形成不进行预稳态爆发，则会导致该曲线。单次周转引物合成实验提供了有关底物转化为产物过程中中间体物质形成和衰变的信息。

凝胶图像显示了四聚体形成的时间过程。该图显示了中间形成与时间的关系。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 90 分钟内完成。

不要忘记，使用放射性试剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如适当的屏蔽。