小鼠原代肝细胞培养物中炎症反应的诱导

本实验的总体目标是成功分离具有功能活性的小鼠肝细胞，用于研究在肝脏急性期反应介质作用下，炎症性细胞因子（如CRP和IL6）的表达与分泌情况。该方法有助于解答关于肝细胞功能以及肝脏来源细胞因子在慢性肾病所致持续性炎症环境中所起作用的关键问题。该技术的主要优势在于，它为肝脏代谢组学、炎症反应以及药物效应的分析提供了一种简便、快速且可重复性高的可靠工具。

首先，将肝脏灌注培养基和肝脏消化培养基置于37摄氏度水浴中预热。按照图示设置灌注泵，然后使用肝脏灌注培养基小心地预先充满泵的管路系统。

尽量避免系统中产生气泡。准备好体视显微镜以进行灌注操作。随后，按照文本方案麻醉一只供体小鼠，将麻醉后的动物置于吸水垫上。

使用胶带固定小鼠的四肢。接着，剃除并消毒小鼠腹部的毛发。然后使用尖端锋利但末端钝的手术剪，从耻骨开始沿腹中线向上至肝脏头侧边界进行腹腔剖开术。

在膈肌尾侧位置沿腹壁两侧切开。使用无菌棉签将肠道轻柔移至右侧，暴露下腔静脉（IVC）。用尖端精细的手术剪，在膈肌上方两侧剪开膈肌，切口横向穿过，打开胸腔。

然后使用5-0外科丝线结扎胸腔下腔静脉。使用带护套的静脉导管穿刺肾下下腔静脉。连接灌注泵并开始灌注肝脏。

如果操作得当，肝脏应立即开始变白并肿胀。接下来，用精细的手术剪剪断门静脉，以确保血液和灌注液的充分引流。当用约30毫升肝脏灌注液完成灌注后，停止灌注泵。

切换至肝脏消化液并重新启动泵。灌注完成后，移除套管。轻柔地暴露肝脏的中央区域，并找到连接肝叶的结缔组织。

抓住中央连接纤维，仔细解剖固定肝脏的所有组织，然后轻柔地取出肝脏。立即将器官转移至含有15毫升肝脏消化液的50毫升聚丙烯锥形管中。

在细胞培养罩内操作时，将肝脏从50毫升聚丙烯锥形管转移至无菌组织培养皿中。使用无菌镊子轻轻撕裂肝脏的四个叶。若操作得当，由于肝细胞从肝脏中被分离出来，消化液应变得浑浊。

使用一个25毫升的无菌移液管尖端，将浑浊的消化液通过70微米的尼龙细胞滤网过滤至一个新的50毫升聚丙烯锥形管中，以去除未消化的组织颗粒和细胞碎片。将合并后的滤液在4°C下以50 × g离心2分钟，然后吸除含有过量细胞碎片的上清液，并加入25毫升冷的1× William's Medium E轻柔重悬细胞。重复过滤和洗涤肝细胞三次后，吸除上清液以去除多余的细胞碎片。

将细胞重悬于25毫升含有原代肝细胞解冻和铺板补充剂的预温1×William's E培养基中，并通过新的70微米尼龙细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。细胞计数后，将细胞接种于含有原代肝细胞解冻和铺板补充剂的2毫升William's E培养基中，置于胶原包被的6孔细胞培养板中。经过两次换液以最终使细胞处于无血清饥饿状态后，分别用PBS（作为溶剂对照）、25纳克/毫升FGF23、100微克/毫升LPS或50纳克/毫升IL6在无血清培养基中处理细胞。

将培养物孵育24小时。按照制造商说明书，使用离心柱试剂盒制备RNA后，向PCR管中加入200纳克分离得到的RNA。然后向管中加入14微升无核酸内切酶的水和4微升逆转录酶。

将PCR管放入热循环仪中，并运行以下逆转录程序以生成cDNA。为进行定量PCR，将以下QPCR预混液组分在冰上加入一个离心管中混合。涡旋振荡预混液。

然后将九微升溶液分装至96孔板的每个孔中。小心向每孔加入一微升cDNA，每份样品准备三个孔。最后，在实时PCR仪中运行样品，并根据文本方案分析数据。

此处展示的是原代分离并培养的细胞的代表性光学显微镜图像。免疫细胞化学分析表明，分离得到的肝细胞高表达白蛋白以及成纤维细胞生长因子受体4。在本实验中，原代分离的肝细胞分别用FGF23、LPS或IL6处理24小时，随后通过定量实时PCR分析CRP和IL6的mRNA水平。

LPS、IL6 和 FGF23 显著增加了 CRP 和 IL6 的表达。如图所示，通过 ELISA 检测分离得到的原代肝细胞培养上清液中的 CRP 水平。QPCR 分析结果表明，与 PBS 处理的细胞相比，LPS、IL6 和 FGF23 处理显著提高了细胞上清液中的 CRP 水平。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在短短几小时内完成。在进行此操作时，务必牢记保持无菌环境。由于涉及原代培养，将可能的污染风险降至最低对于获得最佳结果至关重要。

观看本视频后，您应能充分掌握如何成功分离小鼠肝细胞，以研究多种肝细胞功能，例如肝源性细胞因子的表达与分泌。