Name: 多发性硬化症的小鼠模型EAE视神经炎及脑部炎症的生物发光和近红外成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学习使用生物发光和近红外成像技术在小鼠EAE模型中可视化视神经炎和脑部炎症。该方法可实时监测多发性硬化症的疾病进展及药物疗效，为神经免疫学研究提供非侵入性评估手段。

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本研究由德国研究基金会（CRC1039 A3）、黑森州“科学经济卓越发展计划”（LOEWE）、转化医学与药理学研究中心（TMP）以及Else Kröner-Fresenius基金会（EKFS）研究培训组“转化研究创新-制药”（TRIP）资助。

1. SJL/J 小鼠中 EAE 的诱导
<ol>
	<li>小鼠
	<ol>
		<li>使用11周龄的雌性SJL/J小鼠，每组n = 10只，置于实验室内适应约7天。</li>
		<li>为评估药物效果，自免疫后3或5天开始，通过饮水或食物颗粒持续给予实验组药物，对照组给予安慰剂（每组n=10）。在疾病高峰期，通过牛奶或含3%蔗糖水浸泡的玉米片给予药物或安慰剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫材料
	<ol>
		<li>使用EAE诱导试剂盒，其中包含抗原（髓鞘蛋白脂质蛋白肽段PLP139-151，1 mg/mL乳剂），该抗原与完全弗氏佐剂（CFA，含热灭活的结核分枝杆菌H37 Ra）乳化，并配有2瓶冻干百日咳毒素（PTX，每瓶5 µg）。</li>
		<li>将紫杉醇（PTX，2 µg/mL）溶解于1×磷酸盐缓冲液（PBS； 即， 向每个PTX管中加入1.5 mL PBS，充分混匀，用同一枪头移出，并加入含有1 mL PBS的50 mL管中；充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫接种
	<ol>
		<li>在尾根部皮下分两处注射PLP/CFA，每处100 µL。避免注射至颈部背部，因为上背部或颈部皮肤的任何免疫反应将干扰头部和脊髓的成像。</li>
		<li>在免疫后1-2小时及24小时，每只小鼠腹腔注射（i.p.）PTX 100 µL，共两次。</li>
		<li>对照小鼠注射不含PLP的CFA（2次，每次100 µL）以及不含PLP的PTX。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫接种后的小鼠处理
	<ol>
		<li>每两天称重小鼠一次，直至第7天，之后每天称重。 
		注意：小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间体重会下降约1 - 2 g，体重下降标志着EAE的发病开始。</li>
		<li>从第7天开始，根据标准评分系统每日评估临床症状（即， 评分0：运动功能无明显改变；评分0.5：尾部远端麻痹；评分1：尾部完全麻痹；评分1.5：单侧或双侧后肢轻度轻瘫；评分2：后肢重度轻瘫；评分2.5：单侧后肢完全麻痹；评分3：双侧后肢完全麻痹；评分3.5：双侧后肢完全麻痹并伴有单侧前肢轻瘫。对评分达到或超过3.5的实验小鼠实施安乐死。 &#62; 12 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EAE病程与成像时间
	<ol>
		<li>在疾病发作初期，当小鼠达到评分时进行第一次成像 &#62; 1，大约发生在免疫后第10至12天。</li>
		<li>在症状出现后的1至2天达到高峰，并持续1至3天，在此高峰期进行第二次成像。 
		注意：此后，小鼠将在7至10天内完全恢复。间隔期间的影像学检查可能仍显示血管渗漏，但炎症指标应为阴性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像
<ol>
	<li>成像系统的设置
	<ol>
		<li>执行 体内 使用任何能够分析生物发光和近红外信号的设备进行成像。</li>
		<li>所有成像过程中，将小鼠置于2–2.5%异氟烷麻醉下。</li>
		<li>使用中间的气体供应装置，将一至两只小鼠并排置于仪器中，使上脊柱位于中心位置。</li>
		<li>同时使用两只小鼠，每组一只，以成对比较药物作用效果。这对于生物发光成像至关重要。</li>
		<li>用黑色布料遮蔽免疫接种部位，并拍摄照片以获取基线图像，用于评估小鼠位置的正确性。所有图像均需使用B聚焦模式，相机距离为6.5 cm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物发光炎症探针的注射与成像
	<ol>
		<li>使用 体内 成像系统设置：透射生物发光成像（Epi-BLI），发射滤光片打开，激发滤光片阻断，光圈f1， binning 8，聚焦高度B = 6.5 cm，自动曝光120 s；采集基线图像。</li>
		<li>腹腔注射100 µL即用型化学发光试剂（40 mg/mL）。注射前充分混匀，再抽取至注射器中。</li>
		<li>注射后5、10和15分钟采集生物发光图像。不同动物间生物发光峰值的时间进程存在差异。 
		注意：峰出现在注射后 5 - 10 分钟；若 15 分钟时信号下降，则表明无需进一步成像。采用对照组与处理组的小鼠配对，以消除因不同时间进程导致的微小偏差。</li>
		<li>填写与实验相关的描述。观察自动弹出的对话框，其中包含小鼠品系、性别、时间点、探针注射时间、分组等信息。 等等将所有文件保存在同一个文件夹中；文件将带有时间标签及所有描述信息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>近红外荧光纳米颗粒注射与成像用于血脑屏障完整性评估
	<ol>
		<li>使用近红外落射荧光成像（B聚焦，距离：6.5 cm）。聚乙二醇化荧光纳米颗粒的激发/发射最大值为675/690 nm。在不同波长下采集两幅图像，分别为Ex640/Em700和Ex675/Em720；曝光时间为2秒，binning为8，光圈值为2。采集基线图像。</li>
		<li>通过尾静脉向小鼠静脉注射 70 µL 聚乙二醇化荧光近红外纳米颗粒，并在注射后 3 h 和 24 h 使用上述设置对小鼠进行成像。在填充注射器前充分混匀溶液。</li>
		<li>向对照组小鼠注射0.9%氯化钠，以评估信号的特异性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>近红外荧光探针注射及MMP活性成像
	<ol>
		<li>在采集基线图像前一天，小心剃除或脱去头部和上脊柱区域的毛发。皮肤不得受损。</li>
		<li>使用近红外落射荧光成像（B聚焦，距离：6.5 cm）。MMP可激活探针的激发/发射最大值为680/700 nm。在不同波长下采集两幅图像，分别为Ex640/Em700和Ex675/Em720；曝光时间1秒，binning为8，光圈f2。采集基线图像。</li>
		<li>向即用型溶液（20 nmol/1.5 mL溶于1×PBS）的1.5 mL离心管中加入200 µL 1×PBS，使其足够用于10只小鼠；在填充注射器前充分混匀。 
		注意：所提供的体积未考虑在注射器填充和注射过程中损失的部分体积。</li>
		<li>在成像前24小时，通过尾静脉向实验动物静脉注射150 µL探针。对照组动物仅注射PBS，以评估信号的特异性。</li>
		<li>注射后24小时，使用上述设置（1秒曝光，聚焦B，8倍 binning，f-stop 2），至少在两个波长下采集Epi-FL图像：Ex640/Em700 和 Ex675/Em720。 
		注意：使用两个波长可通过减去非特异性信号实现光谱分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像分析
<ol>
	<li>生物发光分析（BLI）
	<ol>
		<li>双击软件以打开它。</li>
		<li>在上方菜单栏中，单击 文件浏览器 图标，进入实验文件夹的目录并选择该文件夹；这将在表格中打开文件夹内的所有文件。</li>
		<li>配置显示与实验相关的描述性列。</li>
		<li>为进行质量控制，双击无EAE症状的无应答小鼠和/或未处理小鼠的文件，以检查EAE信号的特异性。 
		注意：在未处理小鼠中应无信号，而在无应答小鼠中信号应极微弱。
		<ol>
			<li>在每只小鼠注射探针前，检查基线图像以进一步验证信号的特异性；基线图像应为阴性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择图像时，双击第一只EAE小鼠的第一个文件，检查生物发光强度（LUT条范围）及信号定位。逐一检查所有图像。对每只小鼠，关闭强度最低的文件即，每只小鼠保留3张图像中的2张。</li>
		<li>图像调整与导出
		<ol>
			<li>双击第一个需要量化的文件。观察新窗口弹出。在下方 &#34;选项&#34; （上方菜单），自定义每幅图像中显示的标签。</li>
			<li>在右侧工具栏中，前往 &#34;图像调整&#34; 默认情况下，最小和最大强度已设置为 &#34;自动&#34; 并以彩虹伪彩色显示。选择 &#34;手动&#34; 必要时可更改设置。 
			注意：例如，所有导出的图像可使用相同的LUT标尺（相同的最小值和最大值），以便于比较。调整最小值和最大值不会影响定量结果。</li>
			<li>点击图像导出，选择 png 格式、保存目录及图像名称</li>
		</ol>
		</li>
		<li>感兴趣区域（ROI）的定量分析
		<ol>
			<li>前往 &#34;感兴趣区域&#34; 工具面板中的工具。选择感兴趣区域（ROI）方法（圆形、矩形、自动或手绘）及ROI数量。观察图像窗口中弹出的ROI窗口。</li>
			<li>使用鼠标调整大小和位置。若使用自动 ROI 工具，则所有图像应采用相同的 ROI 阈值；若手动定义 ROI 的大小和位置，则所有图像应使用相同区域。例如， 圆形感兴趣区域（circular ROIs）。</li>
			<li>点击 &#34;测量相对荧光强度（RO.I.）。观察新窗口弹出。自定义列（例如， 文件名，动物编号，组别，实验，区域，总细胞数，平均细胞数，标准差，最小值和最大值，区域，时间点，探针注射时间 等等。）。保存自定义设置。准备就绪后，全选（Ctrl + A），将表格复制并粘贴到电子表格中。</li>
			<li>将图像连同已绘制的感兴趣区域（ROIs）一并导出为 png 格式。保存并关闭图像文件。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对所有需要定量的图像文件重复该步骤（3.1.6 - 3.1.7）。将所有ROI定量结果复制到电子表格中。 
		注意：此处结果可按组别、时间点进行排序， 等等。 并对结果进行统计分析。使用ROI内生物发光信号的总荧光计数进行统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>近红外（NIR）荧光纳米颗粒分析
	<ol>
		<li>使用软件中的控件调节图像的阈值。 
		注意：这不会影响定量结果。</li>
		<li>在 Ex/Em 675/720 和 Ex/Em 640/700 下采集的图像进行视觉比较，以评估信号的特异性。</li>
		<li>使用在激发/发射波长675/720 nm下采集的图像进行定量分析（激发最大值：680 nm）。定义感兴趣区域（ROI），可使用自动ROI工具。调整自动ROI的阈值，并将其应用于所有图像。量化ROI中的总辐射效率（见步骤3.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>近红外（NIR）分析蛋白酶敏感探针
	<ol>
		<li>使用软件控件调节图像的阈值。 
		注意：这不会影响定量结果。对自发荧光进行光谱分离。光谱分离工具在 Living Image 软件中实现。自动分离使用激发/发射波长 640/700 作为特异性信号图像，675/720 作为自发荧光图像。</li>
		<li>选择解混后的图像，并按上述方法定义感兴趣区域（ROI）。采用ROI内的总辐射效率进行定量和统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

本视频展示了生物发光和近红外荧光的技术方法 体内 在SJL/J小鼠中进行EAE成像。我们显示，利用对炎症敏感的探针进行生物发光成像主要可检测到视神经炎，其定量结果与EAE严重程度的临床评估及药物治疗效果相一致。然而，该生物发光成像方法未能检测到腰段脊髓的炎症，而腰段脊髓是EAE表现的主要部位17，这可能是因为信号被脊柱吸收所致。
近红外成像灵敏度更高，但会受到较强自发荧光干扰，而生物发光则不存在这一问题。近红外成像的曝光时间（1 - 2 s）远短于生物发光成像（2 - 5 min），因此在信号强度快速变化的时间序列实验中，近红外成像是首选方法。
方案中的关键步骤及技术局限性
免疫接种部位的信号会干扰EAE中的脊髓成像，但通过将两个注射部位均置于尾根部，可避免这一问题，该注射位置的效果不逊于推荐的注射部位（颈部和尾根部）。然而，必须使用黑色布料遮盖注射部位。
...

多发性硬化症是由自身免疫介导的对脑和脊髓中髓鞘的攻击与破坏所引起的1。该病在女性中的年总发病率为每10万人中约3.6例，在男性中约为2.0例，是继创伤性损伤之后导致青壮年神经功能障碍的第二大常见原因2,3。多发性硬化症的疾病病理机制受到遗传和环境因素的共同影响4，但目前尚未被完全阐明。自身反应性T淋巴细胞进入中枢神经系统，触发炎症级联反应，导致脑、脊髓和视神经白质区域出现局灶性浸润。在大多数情况下，这些浸润最初是可逆的，但随着复发次数的增加，病变持续存在的可能性也随之上升。目前已开发出多种啮齿类动物模型用于研究该疾病的病理过程。其中，SJL/J小鼠的复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型和C57BL6小鼠的原发进展型EAE模型是最常用的两种模型。
临床EAE评分（描述运动功能缺损程度）和体重是评估EAE严重程度的金标准。这些临床表现与脊髓中免疫细胞浸润和髓鞘破坏的程度相一致，并可在一定程度上预测药物治疗在人类中的疗效。5然而，这些体征主要反映的是脊髓腹侧纤维束的损伤。目前尚无一种简便、无创、可靠且可重复的方法来评估 体内 活体小鼠脑部浸润和视神经炎 
的 体内 成像技术符合Russell和Burch（1959）提出的“3R”原则，该原则主张 R替换， R教育，以及 R动物实验的优化6，因为成像技术可在多个时间点增加单个动物的检测指标读数，从而减少总体动物使用数量。目前，炎症或髓鞘状态主要通过以下方式评估 离体 通过免疫组织化学、FACS分析或不同的分子生物学方法7，均需在特定时间点处死小鼠。 
已开发出多种用于评估皮肤、关节和血管系统炎症的活体成像系统探针。这些技术依赖于组织过氧化物酶（包括髓过氧化物酶（MPO）、基质金属蛋白酶（MMPs）8和组织蛋白酶9或环氧化酶2）对生物发光或近红外荧光底物的激活。这些探针主要在关节炎或动脉粥样硬化模型中得到了验证9,10。一种对组织蛋白酶敏感的探针也已被用于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的荧光分子断层成像11。基质金属蛋白酶（尤其是MMP2和MMP9）参与了EAE中蛋白酶介导的血脑屏障破坏，并在免疫细胞浸润部位表达上调12，提示这些探针可能适用于EAE的成像。这一推论同样适用于基于过氧化物酶或组织蛋白酶的探针。从技术上讲，对脑或脊髓中的炎症进行成像具有更大挑战性，因为颅骨或脊柱会吸收生物发光和近红外信号。
除了炎症指标外，已有研究描述了一些可特异性结合髓鞘的荧光化学物质，可能用于髓鞘化程度的定量分析13。一种近红外荧光探针——3,3'-二乙基硫三碳菁碘化物（DBT）——被发现可特异性结合有髓神经纤维，并已在原发性髓鞘形成缺陷的小鼠模型以及铜唑酮诱导的脱髓鞘模型中被验证为一种定量分析工具14。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，DBT信号反而增强，反映了髓鞘纤维的炎症状态5。
EAE和MS的另一个特征是血脑屏障（BBB）破坏，导致血管通透性增加，血液细胞、细胞外液和大分子物质渗出进入中枢神经系统实质。这可能导致水肿、炎症、少突胶质细胞损伤，并最终引发脱髓鞘15,16。因此，使用荧光探针（如荧光染料标记的牛血清白蛋白5）对BBB渗漏进行可视化观察可能有助于评估EAE，这类探针在正常情况下从血液向组织的分布极为缓慢。
在本研究中，我们评估了不同探针在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中的应用价值，并展示了最可靠且稳健的生物发光技术的操作步骤。此外，我们还讨论了近红外探针在检测基质金属蛋白酶（MMP）活性和血脑屏障（BBB）完整性方面的优缺点。

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10149</td><td>成像探针，聚乙二醇化纳米颗粒，用于血脑屏障完整性的成像</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10126</td><td>成像探针，可被基质金属蛋白酶激活，用于炎症成像</td></tr><tr><td>XenoLight RediJect Inflammation Probe</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>760535</td><td>成像探针，可被氧化酶激活，用于炎症成像</td></tr><tr><td>PLP139-151/CFA 乳剂&amp;nbsp;</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE 诱导试剂盒</td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE 诱导试剂盒</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td></td><td>生物发光与红外成像系统</td></tr><tr><td>LivingImage 4.5 软件&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>CLS136334</td><td>IVIS 分析软件</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott Labs, Illinois, USA</td><td>26675-46-7</td><td>麻醉剂</td></tr></tbody></table>

小鼠多发性硬化eae模型中视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）在SJL/J小鼠中是复发-缓解型多发性硬化症（RRMS）的模型。描述运动功能缺陷的临床EAE评分是脊髓免疫介导炎症的基本读数。然而，评分和体重无法提供 体内 评估脑部炎症和视神经炎。后者在约2/3的多发性硬化症患者中是一种早期且常见的表现。本文展示了利用生物发光和近红外活体成像技术，在活体小鼠中评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）诱发的视神经炎、脑部炎症以及血脑屏障（BBB）破坏的方法。 体内 成像系统。由氧化酶激活的生物发光底物主要显示视神经炎。该信号具有特异性，可实现对药物效应和疾病进程的可视化，且与临床评分相一致。采用在血管内停留较长时间的聚乙二醇化荧光纳米颗粒评估血脑屏障（BBB）完整性。近红外成像在疾病高峰期检测到BBB渗漏，信号在眼部周围最强。使用基质金属蛋白酶的近红外底物评估EAE诱导的炎症反应。自发荧光干扰了信号检测，需通过光谱分离进行定量分析。总体而言，生物发光成像是一种可靠的方法，可用于评估EAE相关的视神经炎及药物效应，在信号特异性、稳健性、定量便捷性和成本方面均优于近红外成像技术。

视神经炎生物发光的时间进程
炎症探针的生物发光信号在眼睛周围最强，且仅出现在患有视神经炎的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠中。未患EAE的小鼠或未注射炎症探针的小鼠均未出现信号。当小鼠恢复时，该信号消失。因此，该信号对视神经炎具有特异性，且信号峰值与临床EAE评分的峰值相一致。图1展示了SJL/J小鼠在诱导EAE后第10天和第14天成像的两个示例。生物发光信号在第10天达到最高，随后小鼠开始恢复时信号消失。临床评分的时间进程与生物发光信号的消失相吻合（示例-1），或早于评分的下降（示例-2）。
<img alt="生物发光成像，小鼠研究，第10天和第14天的光子计数与评分分析数据" src="/files/ftp_upload/55321/55321fig1....

我们展示了一种技术 体内 在SJL/J小鼠多发性硬化实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中进行视神经炎和脑炎的活体生物发光与近红外成像。

小鼠多发性硬化EAE模型中视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）在SJL/J小鼠中是复发-缓解型多发性硬化症（RRMS）的动物模型。临床EAE评分用于描述……

该成像技术的总体目标是在活体小鼠中可视化并量化多发性硬化 EAE 模型中的视神经炎和脑部炎症。该方法有助于回答神经免疫学领域的关键问题，例如影响 EAE 和多发性硬化病程的新机制。该技术的主要优势在于，可在疾病发展全过程中的活体小鼠上观察并量化由 EAE 诱发的视神经炎和脑部炎症。该技术的应用前景涉及治疗领域，因为我们可以观察到药物的作用效果，而这些效果无法从EAE评分中显现。在此操作中，将PTX以每毫升2微克的浓度溶于1×PBS中，并充分混匀。随后，在异氟烷短暂麻醉下，于小鼠尾根部皮下注射100微升PLP/CFA，共注射两次。不要向颈部后方注射，因为上背部或颈部皮肤的任何免疫反应都会干扰头部和脊髓的成像。免疫后1至2小时，向小鼠腹腔内注射100微升PTX。然后在免疫后24小时，再次向小鼠注射100微升PTX。对于对照组小鼠，在尾根部两侧各注射 100 微升不含 PLP 的 CFA，共注射两次。从免疫后第 7 天开始，根据标准评分系统每天评估临床症状。当小鼠评分超过 1 分时（通常发生在免疫后第 10 至 12 天），在疾病 onset 时进行首次成像。然后在疾病高峰期进行第二次成像，高峰期大约在初始症状出现后一到两天，持续一至三天。此后，小鼠将在七到十天内完全恢复。在恢复期间进行成像可能仍会显示血管渗漏，但炎症指标应为阴性。进行活体成像时，在所有成像过程中均需使用 2% 至 2.5% 异氟烷对小鼠进行麻醉。将两只小鼠并排置于仪器中，并使其上背部位于中心位置。随后，用黑色布料遮盖免疫接种部位。打开图像采集软件并初始化相机。然后拍摄基线图像以评估小鼠的正确位置。随后，使用与相机距离为6.5厘米的B聚焦模式来采集所有图像。随后，在填充注射器前，将即用型化学发光试剂配制为每毫升含40毫克。然后，向小鼠腹腔内注射100微升该试剂，并在注射后5、10和15分钟时采集生物发光图像。在此步骤中，打开生物发光分析软件。在上方菜单栏中，单击文件浏览器图标。进入实验文件夹所在的目录并打开文件，然后配置列以显示与实验相关的描述信息。为进行质量控制，可单击无EAE症状的无应答小鼠或未处理小鼠的文件，以检查EAE信号的特异性。为进一步控制信号的特异性，需在每次探针注射前检查每只小鼠的基线图像，该图像应为阴性。选择图像时，点击第一只EAE小鼠的第一个文件，检查其生物发光强度和定位，并逐一检查所有图像。进行定量分析时，为每只小鼠选择信号最强的图像。调整并导出图像时，双击第一个需要定量的文件。在新弹出窗口的“选项”按钮下，自定义每个屏幕上显示的标签。在右侧工具面板中，进入图像调整。默认情况下，最小和最大强度设置为自动，并以彩虹伪彩色显示。如有必要，选择手动以更改设置。接下来，点击图像导出，选择 PNG 格式、保存目录及图像名称。如需对感兴趣区域进行定量分析，请前往工具面板中的 ROI 工具，选择 ROI 方法及 ROI 数量。在图像窗口内的 ROI 窗口中，调整 ROI 的大小和位置。当使用自动 ROI 工具时，所有图像应采用相同的 ROI 阈值。如果 ROI 的大小和位置为手动定义，则所有图像应使用相同的区域。然后，点击“测量 ROI”。在新弹出的窗口中自定义实验细节的列，并保存设置。准备就绪后，选择全部数据，将表格复制并粘贴到电子表格中。随后，将带有 ROI 的图像导出为 PNG 格式，然后保存并关闭图像文件。以下是两只 SJL/J 小鼠在 EAE 诱导后第 10 天和第 14 天成像的示例。眼睛周围的生物发光信号在第10天时最强，当小鼠开始恢复时该信号消失。此处的柱状图显示了第10天和第14天生物发光信号的定量结果，而临床EAE评分则在此处展示。该图中每组五只小鼠的生物发光图像显示了药物的作用效果，其中接受R-氟比洛芬治疗的小鼠视神经炎症状减轻。对感兴趣区域（ROI）中的总生物发光计数进行定量分析，证实了治疗具有显著效果。一旦掌握该技术，根据待成像小鼠的数量，操作可在两到三小时内完成。在实施该实验流程时，需注意使用白色小鼠，并密切观察实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的临床病程。在完成此操作后，可进一步采用其他方法（如FACS分析或免疫组织化学）来回答更多问题，例如脊髓中的免疫细胞浸润情况。观看视频后，您应能够充分掌握如何利用生物发光成像技术在多发性硬化EAE模型中评估视神经炎和脑部炎症。

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多发性硬化症的小鼠模型EAE视神经炎及脑部炎症的生物发光和近红外成像

本视频演示了在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中评估血脑屏障破坏的实验方法。通过眼眶后注射不同分子量的荧光染料，使其在脑部血管中循环。较小分子量的染料可渗漏进入脑组织，而较大分子量的染料仅在血脑屏障严重受损时才能进入，从而反映屏障损伤的程度。...

利用荧光染料检测实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中血脑屏障的破坏

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

来源：Breid, S., 等. α-突触核蛋白纤维外周接种后转基因小鼠神经炎症的生物发光成像。J. Vis. Exp.

转基因小鼠神经炎症的生物发光成像

来源： Schmitz, K., et al., 小鼠多发性硬化EAE模型中视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像。 J. Vis. Exp.

在EAE小鼠模型中进行生物发光成像

我们介绍了一种在成年小鼠暴露的脊髓上植入并维持玻璃窗的方法，用于研究实验性自身免疫性脑脊髓炎。这些玻璃窗可长期提供对脊髓的光学通路，从而在活体动物中利用双光子显微镜在亚细胞水平上监测细胞动态。...

在实验性自身免疫性脑脊髓炎成年小鼠中植入玻璃脊髓窗

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

向表达人类α-突触核蛋白A53T家族性突变和萤火虫荧光素酶的Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠腹腔或舌部外周注射α-突触核蛋白纤维，可诱导其中枢神经系统产生神经病理学改变，包括神经炎症。...

转基因小鼠外周接种α-突触核蛋白纤维后神经炎症的生物发光成像

本方案描述了如何利用眼科成像平台系统，在小鼠等小型啮齿类动物中应用谱域光学相干断层扫描和扫描激光检眼镜等高分辨率成像技术，分别获取视网膜厚度和小胶质细胞分布的信息。...

体内成像携带 Cx3cr1gfp/gfp 报告基因小鼠的谱域光学相干断层扫描与扫描激光检眼镜技术

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的动物模型。本文介绍了一种对EAE小鼠脊髓中的炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分的方法。此外，还提供了一种定量检测小鼠血清中可溶性神经丝轻链水平的方法，有助于在活体小鼠中评估轴突损伤。...

评估实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘及轴突损伤

学习使用生物发光和近红外成像技术在小鼠EAE模型中可视化视神经炎和脑部炎症。该方法可实时监测多发性硬化症的疾病进展及药物疗效，为神经免疫学研究提供非侵入性评估手段。

小鼠多发性硬化EAE模型中视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像

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