分析细胞表面粘附重塑回应机械张力使用磁珠

本实验的总体目标是探索使用配体包被的磁性微珠和强制应用于粘附受体响应张力而被激活的生化途径。这种方法可以帮助回答机械交易领域中的问题，例如来自快速螺力函数的机械张力如何引导它们进行分化，或者组织顺应性如何驱动它们的转变。该技术的主要优点是，通过使用珠子对粘附受体的特定子集施加张力，可以刺激许多细胞进行化学分析。

首先，涡旋至少 30 秒，将超级顺磁性甲苯磺酰活化珠彻底重悬于原始样品瓶中。将 40 微升重悬的超顺磁性珠子分装到含有 1 毫升 0.1 摩尔磷酸钠 pH 7.4 的 1.5 毫升微量离心管中。接下来，将试管放在磁性分离架上，以将磁珠与溶液分离。

弃去上清液，从磁分离架上取出试管。将微珠重悬于 1 毫升 0.1 摩尔磷酸钠 pH 7.4 中。洗涤珠子两次后，将珠子重悬于 1 毫升相同的缓冲液中。

然后，将 100 μg 牛纤连蛋白或任何其他细胞粘附受体配体混合到磁珠上并涡旋。重复此步骤，用 BSA、聚-D-赖氨酸或载转移蛋白替换配体进行阴性对照。将微珠与含配体的溶液在 37 摄氏度下在转子上孵育 12 至 24 小时。

如果在反应发生后出现微珠聚集体，超声处理时间不超过 10 至 20 秒。接下来，使用磁性分离架分离珠子并吸出剩余的溶液。然后加入 1 毫升 PBS 溶液，补充有 0.2% 牛血清蛋白。

在 37 摄氏度的转子上孵育 1 小时。使用磁铁，用 1 毫升补充有 0.2% 牛血清蛋白的 PBS 溶液洗涤珠子两次。在将它们重悬于 1 毫升相同缓冲液中之前。

如果聚集体出现的时间不超过 20 到 30 秒，则对磁珠进行超声处理。继续进行细胞检测，或将磁珠在 4 摄氏度下储存长达一个月。在 60 mL 组织培养皿中，在适当的生长培养基中培养贴壁细胞，直至达到 80% 汇合。

沉淀配体包被的珠子后，将沉淀重悬于补充有 0.2% 牛血清蛋白的 1 毫升 PBS 溶液中。将 100 μL 配体包被的微珠溶液添加到 5 mL 温热培养基中并涡旋。接下来，在 60 mL 培养皿中吸出培养基，并加入 5 mL 补充有珠子的温热生长培养基。

在细胞培养条件下孵育悬浮液 20 分钟，使磁珠沉淀并粘附在细胞上。关键不要超过 20 分钟，因为珠子可能会被吞噬作用内化。接下来，使用 10 倍或 20 倍物镜在光学显微镜下观察珠子。

通过轻轻摇动培养皿来检查微珠粘附，以区分附着的微珠和漂浮的微珠。将圆形 38 毫米钕磁铁放在普通 60 毫米培养皿盖的上表面，并使用位于盖子下表面的两个较小的 13 毫米钕磁铁将其固定到位。将承受张力的细胞孵育所需的时间点和细胞培养条件。

将普通的培养皿盖换成带磁铁的盖子。由于磁铁非常强大，因此请小心作它们。处理后，将培养皿放在冰上，小心地从培养皿中吸出整个培养基。

加入 300 μL 细胞裂解缓冲液，在冰上孵育 10 分钟。然后，使用细胞刮刀收集裂解物并将其转移到预冷的 1.5 ml 微量离心管中。使用磁性分离架沉淀磁珠，并将总细胞裂解物转移到新的预冷 1.5 mL 微量离心管中。

从磁珠分离后获得的总细胞裂解物中取出 15 μL 等分试样，用于 western blot 分析。用 1 毫升冰冷的裂解缓冲液洗涤珠子 3 次。然后，向微珠沉淀中加入 50 μL 样品缓冲液。

涡旋混合悬浮液后，使用干块加热器在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟。该组分包含分离的粘附复合物。进行生化分析或将馏分储存在零下 20 摄氏度。

该图显示了粘附复合物的纯化。GAPDH 免疫印迹用作总细胞裂解物的上样对照，并检查粘附复合物的纯度。使用长时间曝光来验证纯化的粘附复合物组分中不存在细胞质信号。

纤连蛋白包被的磁珠用于研究粘附复合物响应张力而随时间发生的机械转导过程。磁分离粘附复合物组分后，通过 western blot 分析裂解物和粘附复合物组分。免疫印迹了上样对照和已知在粘附复合物处募集或磷酸化以响应机械张力的候选物。

虽然张力不影响桩蛋白募集到粘附复合物中，但其对酪氨酸 31 的磷酸化在总细胞裂解物和粘附复合物组分的机械张力下增强。观看此视频后，您应该对如何使用磁珠对粘附表面蛋白施加张力有很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。

在尝试此过程时，请务必记住小心使用强大的磁铁。按照此程序，可以进行生化研究，例如蛋白质印迹、肌动蛋白聚合测定或酶测定，以回答其他问题，例如激酶活性是否受张力调节。这项技术可以帮助细胞生物学领域的研究人员探索细胞中的磁敏感信号通路。