Name: 核小体的重建与差异同位素标记的姐妹组蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习核小体重建与差异同位素标记姐妹组蛋白的方法，用于同时绘制两种姐妹组蛋白的翻译后修饰图谱。该技术结合高分辨率质谱分析，为研究染色质生物学中的修饰串扰机制提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 Philipp Selenko 博士（FMP-Berlin）提供湿实验所需的实验空间和基础设施，以及德国研究基金会（DFG）通过研究资助项目（LI 2402/2-1）为本工作提供的经费支持。

1. 利用同位素标记（及不对称修饰）的姐妹组蛋白重建核小体
注意：： 本实验方案描述了使用同位素标记不同的组蛋白H3重建核小体的方法。为此，使用了两组组蛋白H3：一组为15N标记，并在N端带有6xHis标签；另一组为13C标记，并在N端融合Strep肽段（WSHPQFEK）。两种标签均通过烟草蚀刻病毒（Tobacco Etch Virus, TEV）蛋白酶识别位点与天然H3序列分隔。为制备其他不对称修饰的核小体，可将其中一组H3以预先修饰的形式加入。组蛋白组的预修饰可通过将目标同位素标记组蛋白与相应的组蛋白修饰酶在各类反应所需的辅因子/PTM供体存在下进行反应来实现16。可通过核磁共振（NMR）波谱法或质谱法评估相应PTM修饰的效率。此处使用的组蛋白/DNA用量仅为粗略建议，旨在获得DNA浓度（260 nm处测定）约为10 µM的核小体制剂。该最终产量足以在相对较短的采集时间内获得高质量的NMR谱图。
<ol>
	<li>利用不同同位素标记（及不对称修饰）的组蛋白H3重建组蛋白八聚体 
	注意：重组组蛋白可在BL21(DE3)plysS细胞中以毫克级产量表达14。为获得同位素标记的组蛋白，采用相同的表达/纯化流程，唯一区别在于细菌培养时使用含15NH4Cl和/或13C-葡萄糖的最低培养基作为氮源和碳源，分别用于15N或13C标记。纯化后的组蛋白需在含5 mM β-巯基乙醇的缓冲液中充分透析，并冻干保存以备使用。
	<ol>
		<li>将冻干的组蛋白分装物溶解于1 mL变性缓冲液（7 M 盐酸胍，20 mM Tris pH 7.5，10 mM DTT）中，每种组蛋白约含5 mg，包括两种类型的组蛋白H3。用移液器吹打混匀，切勿涡旋。将管子置于冰上30分钟，以确保完全变性。</li>
		<li>通过在280 nm处测定吸光度（以变性缓冲液为空白对照），并使用ExPASy门户的ProtParam工具计算的消光系数，确定每种组蛋白的精确浓度15。</li>
		<li>将核心组蛋白按等摩尔比例混合，注意使两种组蛋白H3各占50%。首先以浓度较低的组蛋白的全部内容&#160;为基准，再相应加入其他组蛋白。</li>
		<li>使用变性缓冲液将最终蛋白浓度调整至约1 mg/mL。</li>
		<li>将混合液转移至截留分子量为6 kDa的透析膜中，在4 °C下对1–2 L预冷的复性缓冲液（10 mM Tris pH 7.5，2 M NaCl，1 mM EDTA，2 mM DTT）进行透析。透析至少3小时后更换缓冲液至少一次。最后在4 °C下继续透析过夜。</li>
		<li>收集透析后的样品，于4 °C下以最大转速在微量离心机中离心5分钟，去除任何沉淀物（通常不应观察到沉淀）。通过测定280 nm处的吸光度确定八聚体浓度。计算时使用各组蛋白消光系数之和，并注意将每个值加倍。</li>
		<li>使用截留分子量为10 kDa的离心过滤装置浓缩至最终体积约2 mL。重新计算八聚体浓度并估算损失。此时应获得50–100 µM的八聚体浓度。</li>
		<li>将凝胶过滤柱（见材料表）连接至FPLC系统，并以1 mL/min流速和0.5 MPa压力上限，用2柱体积（CV）经0.22 µm滤膜过滤并脱气的复性缓冲液进行平衡。 
		注意：凝胶过滤步骤应在冷室或冷藏柜中进行。</li>
		<li>以1 mL/min流速注入浓缩样品，并收集1.0–1.5 mL的馏分。</li>
		<li>监测层析图谱，观察组蛋白八聚体在约65–68 mL处的洗脱峰。 
		注意：洗脱峰出现的小肩峰及约80 mL处的峰分别提示存在游离的H3-H4四聚体和H2A-H2B二聚体。</li>
		<li>取每份收集的馏分20 µL，在18% SDS-PAGE凝胶上电泳。 
		注意：上样前需至少用水稀释2倍以降低高盐浓度，避免条带畸变。此要求同样适用于后续在复性缓冲液中样品的SDS-PAGE分析。</li>
		<li>根据染色凝胶上四种组蛋白分布均等判断，合并含纯八聚体的相关馏分，并按前述方法（步骤1.1.7）测定浓度。</li>
		<li>将1 mL Ni-NTA柱（见材料表）连接至FPLC系统，并以1 mL/min流速用10 CV经0.22 µm滤膜过滤并脱气的复性缓冲液进行平衡。 
		注意：Ni-NTA层析应在冷室或冷藏柜中进行。</li>
		<li>以1 mL/min流速使纯化的八聚体通过Ni-NTA柱。</li>
		<li>收集穿流液，并保留样品用于SDS-PAGE/WB分析（分别为20 µL和4 µL）。随后用10 CV复性缓冲液洗涤柱子，直至基线信号稳定。</li>
		<li>以1 mL/min流速，用含250 mM咪唑的10 CV复性缓冲液洗脱。保留样品用于SDS-PAGE/WB分析（分别为20 µL和4 µL）。</li>
		<li>使用批次/重力流装置，以含250 mM咪唑的10 CV复性缓冲液平衡1 mL商用链霉亲和素亲和柱（见材料表）。 
		注意：此层析步骤应在冷室中进行。</li>
		<li>将Ni-NTA柱的洗脱液通过商用链霉亲和素亲和柱。</li>
		<li>收集穿流液，并保留样品用于SDS-PAGE/WB分析（分别为20 µL和4 µL）。随后用10 CV复性缓冲液洗涤。</li>
		<li>以10 CV含2.5 mM 脱硫生物素的复性缓冲液洗脱。保留样品用于SDS-PAGE/WB分析（分别为20 µL和4 µL）。</li>
		<li>测定八聚体浓度，加入比八聚体摩尔量少10倍的TEV蛋白酶，在标准塑料离心管中于4 °C反应过夜。 
		注意：完全消化（去除亲和标签）所需的TEV蛋白酶量取决于其来源（构建体）及活性（新制备的重组TEV蛋白酶活性高于长期储存在-80 °C的样品）。初始建议加入比八聚体少10倍的TEV蛋白酶（按蛋白浓度估算），并根据结果调整。</li>
		<li>通过在18% SDS-PAGE凝胶上分别取TEV蛋白酶加入前后的混合物20 µL进行电泳，检测消化效率。若消化不完全，可补充TEV蛋白酶并继续孵育3–4小时。</li>
		<li>使用截留分子量为50 kDa的透析膜对样品进行透析，以去除TEV蛋白酶并调整缓冲液组成。</li>
		<li>使用&#160;截留分子量为10 kDa的离心过滤装置（也可使用步骤1.1.7中的同一滤器）将纯化的不对称八聚体浓缩至1.0–2.0 mL。测定最终浓度。可立即用于核小体重建，或加入等体积甘油（终浓度50%，v/v）后于-20 °C长期保存。考虑到此前步骤中至少70%的损失，此时八聚体浓度应在20–50 µM范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>核小体重建
	<ol>
		<li>若八聚体保存于50%甘油中，需在4 °C下用复性缓冲液透析过夜，再进行核小体重建。</li>
		<li>使用5 M NaCl储备液将DNA（含核小体定位序列）的盐浓度调整至2 M NaCl。 
		注意：纯化的DNA（无论是从含有多个目标序列拷贝的质粒中提取，还是通过PCR扩增合成）应以约50 µM浓度储存在水或标准Tris-EDTA缓冲液中。</li>
		<li>按小规模预实验确定的最佳比例混合八聚体与DNA，使用复性缓冲液将最终体积调至约3.0 mL。始终最后加入八聚体，以避免八聚体与DNA在&#60;2 M盐浓度下混合。
		<ol>
			<li>进行初步小规模重建，以确定可获得最佳核小体产率的八聚体:DNA比例。为此，在50–100 µL体积内设置三个反应，DNA:八聚体比例分别为0.9:1.0、1.0:1.0和1.1:1.0。通常使用5 µM的DNA浓度。</li>
			<li>按以下步骤（1.2.4–1.2.8）进行重建，最终通过在260 nm处测定DNA浓度以及运行经溴化乙锭染色的6%非变性PAGE DNA凝胶，分别评估可溶性良好质量核小体的产量（图5A）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将混合液转移至截留分子量为6 kDa的透析膜中，在4 °C下对1 L复性缓冲液透析过夜。</li>
		<li>逐步降低透析缓冲液的盐浓度，依次为2 M、0.85 M、0.64 M和0.2 M NaCl。每种缓冲液中至少保持3小时。有时在最后一次转换后会形成沉淀。若发生此情况，按计划继续透析，并在下一步结束时通过微量离心去除沉淀。</li>
		<li>将透析膜转移至盛有1 L测定缓冲液（25 mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 6.8，25 mM NaCl，2 mM DTT）的烧杯中，在4 °C下继续透析过夜。</li>
		<li>收集样品，于4 °C下以最大转速在微量离心机中离心5分钟，去除步骤1.2.5中形成的任何沉淀，并使用截留分子量为30 kDa的离心过滤装置浓缩至最终体积约300 µL。</li>
		<li>在260 nm处测定DNA浓度，运行18% SDS-PAGE蛋白凝胶（上样4 µL）和6%非变性PAGE DNA凝胶（上样0.2 µL），并将样品在4 °C保存数周。最终浓度应在10–20 µM范围内。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 两种姐妹组蛋白上修饰反应的核磁共振分析
注意：核小体组蛋白尾部的二维 1H-15N 相关谱图指认可参见文献16,17,18。此外，赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸在二维 1H-13C 相关谱图中 CHx 基团的指认可参见文献16。
<ol>
	<li>NMR 设置与参考谱图的采集 
	注意: 酶促反应实验在 300 K 条件下进行，使用 3 mm NMR 管，加入 140 µL 核小体样品溶于反应缓冲液中。也可使用其他体积样品的不同规格 NMR 管。上述温度适用于获得高质量的核小体组蛋白尾部的 1H-15N 相关谱图，并保持良好的酶活性。分别采集 2D-SOFAST-HMQC 1H-15N 和 2D-HSQC 1H-13C 谱图，设置参数使两种谱图的采集时间相近。典型的采集参数为：对于两种不同类型的相关谱图，分别采用 128 次累加、1.024 (1H) × 128 (15N) 复数数据点，以及 32 次累加、1.024 (1H) × 64 (13C) 复数数据点。两种 2D 谱图的采集时间均约为 30 分钟。
	<ol>
		<li>将核磁共振波谱仪的样品温度设为 300 K。向样品中加入 10% D2O (v/v)，用于仪器频率锁定。</li>
		<li>将样品放入核磁共振波谱仪中，执行基本操作（锁场、调谐、匀场），并确定最优脉冲长度及常规采集参数。</li>
		<li>采集 1D 和 2D 1H-15N 以及 1H-13C 参考谱图。</li>
		<li>处理参考谱图，确保用于监测修饰反应的信号峰分辨良好且强度足够。</li>
		<li>回收样品并转移至微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶促反应设置、NMR 监测及定量分析
	<ol>
		<li>复制并安排一系列交替采集的 2D 1H-15N 和 1H-13C 谱图。总采集时间应达到数小时，并根据首次反应获得的酶促反应速率，在后续实验中相应调整。</li>
		<li>向样品中加入相应类型修饰反应所需的辅因子（磷酸化反应加入 1 mM ATP/2 mM MgCl2，乙酰化反应加入 1 mM 乙酰辅酶 A，甲基化反应加入 1 mM SAM，等）。</li>
		<li>加入目标酶，用移液器混匀，将样品重新转移至 NMR 管，随后放入核磁共振波谱仪中（上述操作应迅速完成）。 
		注意: 若对预期酶活性无先验信息，建议将底物与酶的摩尔比设为 10:1。先进行一次预实验，再根据结果调整正式实验条件。</li>
		<li>执行快速自动匀场，并沿用参考谱图中的其余采集参数。</li>
		<li>开始交替采集 2D 1H-15N 和 1H-13C 谱图序列。</li>
		<li>实时监测反应进程，并在反应完成或达到预期程度时停止采集。</li>
		<li>使用与之前完全相同的参数处理谱图数据。</li>
		<li>重复整个实验，但改变两种相关谱图的采集顺序。若首次实验中 1H-15N 相关谱图排在序列首位，则本次实验以 1H-13C 相关谱图开始。通过此方法并保持两种谱图的采集时间一致，可在相同时间尺度上绘制和比较两种不同同位素标记组蛋白上的翻译后修饰反应。此外，还可计算平均值并绘制误差棒。 
		注意: 关于 NMR 信号分析及酶促反应定量的详细方法学描述可参见此处19。</li>
		<li>从每个时间点的 NMR 谱图中选择能够反映反应进程的信号峰，使用 NMR 谱图可视化与分析软件计算其相对信号强度。需同时分析反映未修饰态和修饰态的信号峰，并提取修饰水平数据。</li>
		<li>将计算得到的修饰水平数值对反应时间作图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Dynamics+of+the+Chromatin+Fiber+in+Solution%3A+Determinants%2C+Mechanisms%2C+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Chromatin+Remodeling+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Biology of Chromatin Remodeling Complexes.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+Combinatorial+Functions+of+Histone+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).</li>
<li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Language+of+Histone+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Language of Histone Crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Liokatis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+histone+H3+Ser10+establishes+a+hierarchy+for+subsequent+intramolecular+modification+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).</li>
<li>Voigt, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23021224">Asymmetrically Modified Nucleosomes.</a> Cell. 151 (1), 181-193 (2012).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications.</a> Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li>
<li>Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Detection%2C+of+Protein+Phosphorylation+and+Acetylation+by+High-Resolution+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).</li>
<li>Binolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+repair+of+oxidation-damaged+%CE%B1-synuclein+fails+to+target+C-terminal+modification+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites.</a> Nat. Commun. 7, 10251(2016).</li>
<li>Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOFAST-HMQC+experiments+for+recording+two-dimensional+heteronuclear+correlation+spectra+of+proteins+within+a+few+seconds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds.</a> J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).</li>
<li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling%2C+post-translational+protein+modifications+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy.</a> J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).</li>
<li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Nucleosome+Core+Particles+from+Recombinant+Histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA.</a> Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy+%3ASIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy :SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).</li>
<li>Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+Isotope-Labeled+Nucleosomes+to+Study+Asymmetric+Histone+Modification+Crosstalk+by+Time-Resolved+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).</li>
<li>Stützer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulations+of+DNA+Contacts+by+Linker+Histones+and+Post-translational+Modifications+Determine+the+Mobility+and+Modifiability+of+Nucleosomal+H3+Tails%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails.</a> Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).</li>
<li>Zhou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H4+K16Q+Mutation%2C+an+Acetylation+Mimic%2C+Causes+Structural+Disorder+of+Its+N-terminal+Basic+Patch+in+the+Nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome.</a> J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).</li>
<li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+NMR+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+serine+and+threonine+phosphorylation+in+reconstituted+kinase+reactions+and+mammalian+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts.</a> Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+ligation+and+modification+strategies+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).</li>
<li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+lysine+methylation+by+high-resolution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).</li>
<li>Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Synthesis+of+Asymmetrically+Modified+Bivalent+Nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125 (2), 315-326 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在核小体重建过程中，本方案采用一种长度为165 bp的DNA模板，其中包含601-Widom核小体定位序列20，但使用不同长度的DNA模板也预期可获得类似效果。该方案的设计与应用基于不对称类型的组蛋白H3。依据相同原理，该方法也可用于其他核心组蛋白，并可用于重建携带两种不同同位素标记的核心组蛋白的复合物。该方案还可稍作修改，以首先重建组蛋白亚复合物，而非直接重建组蛋白八聚体。通过此修改，可采用相同的串联纯化方案重建不对称的H3-H4四聚体。随后将这些四聚体与分别重建的H2A-H2B二聚体及DNA混合，以组装成核小体16。经修改后的方案在最终产率和整体性能方面与原始方案相似。
该方案高度依赖于两个亲和层析柱有效结合相应物种的能力，从而最终获得高纯度的不对称复合物。要直接且具体地证明最终纯化的复合物确实且仅是不对称形式，较为困难。然而，使用相应抗体对各纯化步骤样品进行蛋白质印迹（WB）分析，可为串联纯化方案的成功提供可靠的证据（图3）。通过核磁共振（NMR）...

真核生物的DNA在细胞核内被紧密地包装成染色质。染色质的基本结构单元是核小体核心颗粒，其包含约147个碱基对的DNA，缠绕在一个由四种核心组蛋白（H3、H4、H2A、H2B）各两个拷贝组成的八聚体复合物上。组蛋白蛋白具有多种翻译后修饰（PTMs）。这些共价修饰可通过影响系统的物理化学性质直接发挥作用，或通过招募染色质重塑活性间接发挥作用，从而改变染色质结构1,2,3。通过这些机制，组蛋白PTMs调控染色质的可及性，进而调节所有以DNA为基础的细胞功能4。
翻译后修饰主要由组蛋白修饰酶系统催化，作用于核小体中核心组蛋白的无序N端区段（即“尾部”）。由于组蛋白尾部相对较短的序列上存在多个修饰位点，翻译后修饰可通过促进或抑制后续修饰反应而相互影响，这种现象称为修饰间的串扰。5由于核小体整体结构的对称性，人们曾认为修饰反应及串扰机制在每种核小体组蛋白的两个拷贝（姐妹组蛋白）上是相似发生的。这一概念最近受到挑战并随后被证伪。特别是， 体外 在游离组蛋白H3尾部肽段和核小体上进行的酶学实验表明，一组H3激酶以不对称方式引入磷酸化修饰6此外，基于亲和纯化的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析揭示了多种真核细胞中存在不对称性H3甲基化的核小体。7因此，不对称修饰的核小体构成了新的核小体类型，需要开发相应的工具以揭示调控其形成的机制，并分析这种不对称性可能产生的串扰效应。
通常，蛋白质印迹法（Western Blotting, WB）和质谱分析法（Mass Spectrometry, MS）被用于检测组蛋白的翻译后修饰（PTMs）。尽管WB操作简便，但存在特异性差和交叉反应的问题。此外，该方法无法同时进行多种PTMs的分析，也不能对修饰反应进行直接定量8。另一方面，MS分析依赖复杂的仪器设备，需要高水平的技术培训，但具有高特异性，并能同时实现多种PTMs的定位与定量分析9&#160;。然而，这两种方法均为破坏性检测，在分析前需将核小体复合物解离，从而产生混合的组蛋白和/或组蛋白来源的肽段。此类操作使得无法区分发生在两个姐妹组蛋白上的独立修饰事件，也无法报告核小体组蛋白中每条拷贝特异性的修饰状态。
核磁共振（NMR）波谱法作为一种替代方法被用于绘制翻译后修饰（PTM）反应图谱。NMR具有非破坏性，因此可在重建的混合物中，甚至在完整细胞中实时监测PTM事件10,11。随着快速数据采集方法的发展，以及基于同位素标记（15N 和/或 13C）样品的二维异核相关方法实现高分辨率定位技术的进步12，现已能够同时绘制多种类型的PTM，例如丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化、赖氨酸乙酰化/甲基化以及精氨酸甲基化13。根据所研究的PTM类型，可采用15N或13C标记方案，以标记作为修饰报告基团的蛋白质功能基团。因此，可通过追踪相应功能基团因化学环境改变而产生的特征性化学位移变化，实现PTM的定位分析。在大多数情况下，N-H和C-H化学基团均可用于报告目标PTM的动态变化过程。
本方案描述了生成含有同位素标记差异的姐妹组蛋白核小体的方法。该方法结合了核磁共振（NMR）光谱技术的灵活性，可通过1H-15N和1H-13C相关谱图对翻译后修饰（PTM）进行定位，同时利用不同的蛋白质亲和标签对选定的重组组蛋白复合物进行纯化。值得注意的是，该方案在核小体重建过程中使用了某一特定组蛋白的两种不同样品池。这两种样品池分别进行了不同的同位素标记（一种标记15N，另一种标记13C），并分别融合了多聚组氨酸标签和链霉亲和素亲和标签。采用Voigt et al.7&#160;首次使用的&#160;镍柱（Ni-NTA）与链霉亲和素亲和层析串联纯化策略，从对称产物中分离出非对称组分（图1A）。随后，利用非对称组蛋白八聚体通过标准的盐梯度透析法14重组生成相应的核小体复合物（图1B）。此外，通过相同流程，并使其中一组组蛋白样品预先引入修饰，可在所得核小体上实现翻译后修饰的非对称性引入。将这些底物与组蛋白修饰酶反应，并通过NMR对修饰事件进行图谱分析，可实现对修饰间相互作用机制的表征，包括发生在已修饰组蛋白拷贝上的in-cis效应和未修饰组蛋白拷贝上的in-trans效应（图1C）。

<table><tbody><tr><td>盐酸胍</td><td>Applichem</td><td>A14199</td><td>使用高纯度的 Gu-HCl</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>4855.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Applichem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR chemicals</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Applichem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Applichem</td><td>A3902</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Applichem</td><td>A1073</td><td></td></tr><tr><td>d-脱硫生物素</td><td>Sigma</td><td>D1411</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>1034557</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin Superflow</td><td>IBA</td><td>2-1207-001</td><td></td></tr><tr><td>His-probe 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8036</td><td></td></tr><tr><td>Strep-tactin 偶联 HRP</td><td>IBA</td><td>2-1502-001</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-35</td><td></td></tr><tr><td>6 - 8 kDa 透析膜</td><td>Spectrumlabs</td><td>spectra/por 1, 132650</td><td></td></tr><tr><td>50 kDa 透析膜</td><td>Spectrumlabs</td><td>spectra/por 7, 132129</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa 离心过滤单元</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa 离心过滤单元</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>溶液态核磁共振波谱仪&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>工作频率至少为 500 MHz，并配备三共振低温探头</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>变性缓冲液</td><td>7 M 盐酸胍</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>20 mM Tris，pH 7.5</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>10 mM DTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>复性缓冲液</td><td>10 mM Tris，pH 7.5</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 M NaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 mM DTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>测定缓冲液</td><td>25 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 6.8</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>25 mM NaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 mM DTT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用同位素标记不同的姐妹组蛋白重建核小体

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

不对称修饰的核小体包含两个组蛋白拷贝（姐妹组蛋白），其上带有不同的翻译后修饰（PTMs）组合。这类新近发现的核小体形式，其建立机制及功能意义尚不明确。目前的分析方法尚无法有效检测核小体中姐妹组蛋白上特异性PTM的分布情况。本方案介绍了一种生物化学方法，用于 体外 重组包含不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体。在组蛋白亚复合物复性过程中加入预先修饰的组蛋白混合物，可生成不对称修饰的复合物。这些不对称核小体制备物可进一步与组蛋白修饰酶反应，利用核磁共振（NMR）波谱法研究由不对称预整合的PTM所介导的修饰间串扰机制。特别是通过针对各自同位素类型的NMR相关实验，可独立地实时监测两种姐妹组蛋白上的修饰反应。该方法为研究促进核小体复合物上不对称PTM模式形成与传播的串扰机制提供了有效手段。

将重建混合物通过凝胶过滤柱后，可分离出正确折叠的八聚体物种（图2）。含有三种不同类型八聚体的重建八聚体混合物随后进行串联亲和纯化。收集各步骤的样品，并通过SDS-PAGE及后续的WB进行分析。通过检测不同样品中两种亲和标签（His-和Strep-）的存在情况，可验证该实验方案是否正确执行，从而实现不对称物种的分离（图3）。随后，通过TEV蛋白酶消化去除亲和标签（图4）。去除亲和标签后的不对称八聚体用于重建不对称核小体。首先，通过小规模预实验确定DNA与八聚体的最佳摩尔比，以获得高产率的单分散复合物。随后，采用优化后的混合比例进行大规模核小体重建。通过蛋白/DNA凝胶和NMR波谱分别分析核小体的正确组装情况以及姐妹H3组蛋白的不同同位素标记情况（图5）。图6展示了一个应用实例：将不同同位素标记且H3S10位点不对称磷酸化的核小体与Gcn5乙酰转移酶反应，并通过NMR波谱实时监测两个H3拷贝上H3K14位点的...

本方案描述了含有不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体的重建方法。同时，在使用预先修饰的组蛋白拷贝后，可生成不对称翻译后修饰的核小体。这些样品可直接用于高分辨率核磁共振（NMR）波谱技术，同时研究姐妹组蛋白上的修饰串扰机制。

不对称修饰的核小体包含两个组蛋白拷贝（姐妹组蛋白），其上带有不同的翻译后修饰组合。

本生化实验方案的总体目标是制备带有同位素差异标记的姐妹组蛋白的核小体，用于同时绘制两种姐妹组蛋白上的翻译后修饰位点。该生化实验方案旨在生成具有不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体，以实现对两种姐妹组蛋白上翻译后修饰的同步定位分析。该方法结合高分辨率技术（如质谱分析）用于绘制翻译后修饰图谱，可解答染色质生物学中的关键问题，例如：哪些机制参与了对称性修饰核小体的形成？该技术的主要优势在于其易于在生物化学实验室中建立，因为它结合了标准的核小体重建方案与常见的蛋白质纯化方法。将使用两组组蛋白H3进行八聚体的重建。含有氨基末端多聚组氨酸标签的氮15标记H3，以及含有氨基末端链霉亲和素亲和标签的碳13标记H3。开始此操作时，将包括上述两种组蛋白H3在内的冻干组蛋白等分试样溶解于变性缓冲液中。向每管含有约五毫克组蛋白的样品中加入一毫升变性缓冲液，并用移液器吹打混匀，但不要涡旋振荡。将离心管置于冰上静置30分钟，以确保充分解折叠。随后，测定280纳米处的吸光度，以确定每种组蛋白的精确浓度。将核心组蛋白按等摩尔比例混合，注意两种组蛋白H3的溶液各占50%。使用去折叠缓冲液将蛋白质终浓度调整至约一毫克每毫升。将混合液转移至截留分子量为六千道尔顿的透析膜中，并在四摄氏度下用一至两升预冷的复性缓冲液进行透析。次日，收集透析后的样品，于4°C、最大转速下在微量离心机中离心5分钟，以去除任何沉淀物。测定八聚体浓度后，使用截留分子量为10 kDa的离心过滤装置将八聚体浓缩至终体积约2 mL。八聚体浓度应达到50至100 μM。通过将凝胶过滤柱连接至FPLC系统，准备进行凝胶过滤。使用两倍柱体积（CV）的0.22微米滤膜过滤并脱气的复性缓冲液进行平衡。以每分钟1毫升的流速上样浓缩样品，并收集1至1.5毫升的组分。开始此实验步骤时，汇集含有纯八聚体的相关组分，并按照先前所述方法测定其浓度。将一个1毫升的镍-氮川三乙酸（nickel nitrilotriacetic acid）或镍NTA柱连接至FPLC系统，并以每分钟1毫升的流速，用10个柱体积的0.22微米滤过并脱气的复性缓冲液进行平衡。将纯化的八聚体以每分钟1毫升的流速通过镍柱NTA。收集穿流液。用含有250毫摩尔/升咪唑的复性缓冲液洗脱10个柱体积，流速为每分钟1毫升。收集镍NTA洗脱液。基于链霉亲和素的纯化最好在冷室中进行。使用批量重力流装置，用含有250毫摩尔/升咪唑的10个柱体积复性缓冲液平衡1毫升商用链霉亲和素亲和柱。将镍-NTA洗脱液过链霉亲和素亲和柱。收集穿流液。用含有2.5毫摩尔脱硫生物素的10个柱体积复性缓冲液进行洗脱。收集洗脱液。测定洗脱液中八聚体的浓度后，加入十分之一量的TEV蛋白酶，在4摄氏度下孵育过夜。次日，将混合物转移至截留分子量为50千道尔顿的透析膜中，于4摄氏度下用复性缓冲液透析过夜。使用截留分子量为10千道尔顿的离心浓缩管，将纯化的不对称八聚体浓缩至1至2毫升体积。预期八聚体浓度为20至50微摩尔。核小体重建需要含有核小体定位序列的DNA。使用5摩尔氯化钠储备液将DNA的盐浓度调整至2摩尔氯化钠。按照小规模测试确定的最佳八聚体与DNA比例，将DNA与八聚体及复性缓冲液混合。最后加入八聚体，以避免八聚体与DNA在低于2摩尔的盐浓度下发生混合。将混合物转移至截留分子量为6 kDa的透析膜中，在4 ℃条件下，用1升复性缓冲液透析过夜。次日，逐步降低透析缓冲液中的盐浓度，每种氯化钠浓度的缓冲液中至少保持3小时。接下来，将透析膜转移至含有1升测定缓冲液的烧杯中，在4摄氏度下继续透析过夜。次日，收集透析后的样品。在4摄氏度下，以最大转速在微量离心机中离心5分钟，去除形成的任何沉淀。使用30千道尔顿截留分子量的离心过滤装置将样品浓缩至终体积约300微升。在260纳米处测定DNA浓度，终浓度应为10至20微摩尔。将样品在 4 摄氏度下保存，可维持数周。复性组蛋白混合物的凝胶过滤洗脱图谱显示，组蛋白八聚体在约 70 毫升处洗脱。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了正确的组蛋白化学计量比。将包含三种类型八聚体的重建八聚体混合物进行串联亲和纯化。通过亲和标签的存在验证不对称组分的分离。随后使用TEV蛋白酶去除亲和标签。小规模的核小体重建实验通过使用不同摩尔比的DNA与组蛋白八聚体，表明DNA与八聚体的摩尔比为1:1时效果最佳。随后采用优化后的DNA与八聚体摩尔比进行大规模核小体重建，结果显示四种核心组蛋白具有正确的化学计量比。对同位素标记不同的核小体进行核磁共振（NMR）波谱分析，证实了含有氮-15标记和碳-13标记的姐妹H3组蛋白的存在。在此应用实例中，对组蛋白H3的C环10位进行差异同位素标记并发生不对称磷酸化的核小体，与GCN5乙酰转移酶发生反应，并通过核磁共振（NMR）波谱法实时监测组蛋白H3两个拷贝上第14位赖氨酸的乙酰化过程。分析结果表明，组蛋白H3的C环10位磷酸化相较于反式（trans）修饰，可顺式（cis）促进GCN5对组蛋白H3第14位赖氨酸的乙酰化。一旦掌握，该技术若操作得当，可在五天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何重构包含具有不同特征的姐妹组蛋白的核小体。

reconstitution-nucleosomes-with-differentially-isotope-labeled-sister

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

核小体的重建与差异同位素标记的姐妹组蛋白

我们描述了一组用于分析H1连接子组蛋白表达水平的检测方法。通过基于随机引物的逆转录反应，随后进行实时PCR，可对各个H1基因的mRNA进行定量检测；而H1组蛋白的蛋白质定量则通过高效液相色谱（HPLC）分析实现。...

哺乳动物连接组蛋白亚型的表达分析

在本视频中，我们展示了高速时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术，用于研究核小体复合物的动态过程。当AFM探针扫描核小体表面时，可检测核小体高度的变化，并记录DNA随时间解缠绕的过程。...

高速时间序列原子力显微镜捕捉核小体动态

本文介绍了一种利用重组核心组蛋白和串联重复的核小体定位DNA重建模型核小体阵列的方法。我们还描述了如何通过分析型超速离心机中的沉降速度实验以及原子力显微镜（AFM）来监测重建后核小体阵列的饱和程度。...

利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

本文描述了可用于表征ATP依赖性染色质重塑酶的生化检测方法，这些方法可评估其以下能力：1）催化ATP依赖性的核小体滑动；2）与核小体底物结合；以及3）以核小体或DNA依赖的方式水解ATP。...

用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

本文介绍了一种利用静态和时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术在单分子水平上表征核小体颗粒的实验方案。所述的表面功能化方法可实现对核小体结构及其动态行为在纳米尺度下的高分辨率捕捉。...

利用原子力显微镜成像研究核小体的结构与动力学

泛素化是一种翻译后修饰，在细胞过程中发挥重要作用，并受到去泛素化的严密调控。这两种反应的异常与人类疾病密切相关。我们提供了使用纯化组分在体外进行泛素化和去泛素化反应的实验方案。...

体外核小体组蛋白泛素化与去泛素化实验

本文介绍了一种利用遗传密码子扩展技术表达乙酰化组蛋白蛋白，并在体外组装重建核小体的方法。...

利用遗传密码子扩展技术在组蛋白中进行位点特异性的赖氨酸乙酰化以用于核小体重建 大肠杆菌

本方案详细阐述了使用两种样品制备方法制备用于冷冻电镜载网的核小体复合物的步骤。...

用于冷冻电镜结构解析的与DNA修复因子复合的核小体核心颗粒的制备

本文介绍了一种用于重建含核小体的DNA系链以进行单分子相关力与荧光显微镜检测的详细实验流程。此外，还描述了若干后续实验，可用于观察染色质相互作用蛋白的结合行为，并分析核小体物理性质的变化。...

原位核小体组装用于单分子关联力与荧光显微镜技术

近期在骨骼过度生长患者中发现人类纺锤体相关蛋白家族成员4（SPIN4）的遗传变异，这是一种新型发育障碍。本文介绍了一种实验方案及新研究成果，描述了在核小体背景下通过生物化学方法鉴定SPIN4结合底物——修饰组蛋白的过程。...

通过肽阵列与天然核小体下拉法鉴定人纺锤蛋白家族成员4（SPIN4）的修饰组蛋白结合底物

学习核小体重建与差异同位素标记姐妹组蛋白的方法，用于同时绘制两种姐妹组蛋白的翻译后修饰图谱。该技术结合高分辨率质谱分析，为研究染色质生物学中的修饰串扰机制提供可靠工具。

用同位素标记不同的姐妹组蛋白重建核小体

探索更多视频