用同位素标记不同的姐妹组蛋白重建核小体

本生化实验方案的总体目标是制备带有同位素差异标记的姐妹组蛋白的核小体，用于同时绘制两种姐妹组蛋白上的翻译后修饰位点。该生化实验方案旨在生成具有不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体，以实现对两种姐妹组蛋白上翻译后修饰的同步定位分析。

该方法结合高分辨率技术（如质谱分析）用于绘制翻译后修饰图谱，可解答染色质生物学中的关键问题，例如：哪些机制参与了对称性修饰核小体的形成？该技术的主要优势在于其易于在生物化学实验室中建立，因为它结合了标准的核小体重建方案与常见的蛋白质纯化方法。将使用两组组蛋白H3进行八聚体的重建。

含有氨基末端多聚组氨酸标签的氮15标记H3，以及含有氨基末端链霉亲和素亲和标签的碳13标记H3。开始此操作时，将包括上述两种组蛋白H3在内的冻干组蛋白等分试样溶解于变性缓冲液中。向每管含有约五毫克组蛋白的样品中加入一毫升变性缓冲液，并用移液器吹打混匀，但不要涡旋振荡。

将离心管置于冰上静置30分钟，以确保充分解折叠。随后，测定280纳米处的吸光度，以确定每种组蛋白的精确浓度。将核心组蛋白按等摩尔比例混合，注意两种组蛋白H3的溶液各占50%。

使用去折叠缓冲液将蛋白质终浓度调整至约一毫克每毫升。将混合液转移至截留分子量为六千道尔顿的透析膜中，并在四摄氏度下用一至两升预冷的复性缓冲液进行透析。

次日，收集透析后的样品，于4°C、最大转速下在微量离心机中离心5分钟，以去除任何沉淀物。测定八聚体浓度后，使用截留分子量为10 kDa的离心过滤装置将八聚体浓缩至终体积约2 mL。八聚体浓度应达到50至100 μM。

通过将凝胶过滤柱连接至FPLC系统，准备进行凝胶过滤。使用两倍柱体积（CV）的0.22微米滤膜过滤并脱气的复性缓冲液进行平衡。以每分钟1毫升的流速上样浓缩样品，并收集1至1.5毫升的组分。

开始此实验步骤时，汇集含有纯八聚体的相关组分，并按照先前所述方法测定其浓度。将一个1毫升的镍-氮川三乙酸（nickel nitrilotriacetic acid）或镍NTA柱连接至FPLC系统，并以每分钟1毫升的流速，用10个柱体积的0.22微米滤过并脱气的复性缓冲液进行平衡。

将纯化的八聚体以每分钟1毫升的流速通过镍柱NTA。收集穿流液。用含有250毫摩尔/升咪唑的复性缓冲液洗脱10个柱体积，流速为每分钟1毫升。

收集镍NTA洗脱液。基于链霉亲和素的纯化最好在冷室中进行。使用批量重力流装置，用含有250毫摩尔/升咪唑的10个柱体积复性缓冲液平衡1毫升商用链霉亲和素亲和柱。

将镍-NTA洗脱液过链霉亲和素亲和柱。收集穿流液。用含有2.5毫摩尔脱硫生物素的10个柱体积复性缓冲液进行洗脱。

收集洗脱液。测定洗脱液中八聚体的浓度后，加入十分之一量的TEV蛋白酶，在4摄氏度下孵育过夜。次日，将混合物转移至截留分子量为50千道尔顿的透析膜中，于4摄氏度下用复性缓冲液透析过夜。

使用截留分子量为10千道尔顿的离心浓缩管，将纯化的不对称八聚体浓缩至1至2毫升体积。预期八聚体浓度为20至50微摩尔。核小体重建需要含有核小体定位序列的DNA。

使用5摩尔氯化钠储备液将DNA的盐浓度调整至2摩尔氯化钠。按照小规模测试确定的最佳八聚体与DNA比例，将DNA与八聚体及复性缓冲液混合。最后加入八聚体，以避免八聚体与DNA在低于2摩尔的盐浓度下发生混合。

将混合物转移至截留分子量为6 kDa的透析膜中，在4 ℃条件下，用1升复性缓冲液透析过夜。次日，逐步降低透析缓冲液中的盐浓度，每种氯化钠浓度的缓冲液中至少保持3小时。

接下来，将透析膜转移至含有1升测定缓冲液的烧杯中，在4摄氏度下继续透析过夜。次日，收集透析后的样品。在4摄氏度下，以最大转速在微量离心机中离心5分钟，去除形成的任何沉淀。

使用30千道尔顿截留分子量的离心过滤装置将样品浓缩至终体积约300微升。在260纳米处测定DNA浓度，终浓度应为10至20微摩尔。

将样品在 4 摄氏度下保存，可维持数周。复性组蛋白混合物的凝胶过滤洗脱图谱显示，组蛋白八聚体在约 70 毫升处洗脱。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了正确的组蛋白化学计量比。

将包含三种类型八聚体的重建八聚体混合物进行串联亲和纯化。通过亲和标签的存在验证不对称组分的分离。随后使用TEV蛋白酶去除亲和标签。

小规模的核小体重建实验通过使用不同摩尔比的DNA与组蛋白八聚体，表明DNA与八聚体的摩尔比为1:1时效果最佳。随后采用优化后的DNA与八聚体摩尔比进行大规模核小体重建，结果显示四种核心组蛋白具有正确的化学计量比。对同位素标记不同的核小体进行核磁共振（NMR）波谱分析，证实了含有氮-15标记和碳-13标记的姐妹H3组蛋白的存在。

在此应用实例中，对组蛋白H3的C环10位进行差异同位素标记并发生不对称磷酸化的核小体，与GCN5乙酰转移酶发生反应，并通过核磁共振（NMR）波谱法实时监测组蛋白H3两个拷贝上第14位赖氨酸的乙酰化过程。分析结果表明，组蛋白H3的C环10位磷酸化相较于反式（trans）修饰，可顺式（cis）促进GCN5对组蛋白H3第14位赖氨酸的乙酰化。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在五天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何重构包含具有不同特征的姐妹组蛋白的核小体。