Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

该程序的总体目标是提供一种方便的方法来控制异源系统中的离子通道表达，同时避免冗长的细胞培养并发症。从而提供了一种控制实验之间条件并产生更多可复制结果的方法。这种方法有助于促进离子通道领域的研究。

例如在药理学中表征通道特性。由于当前方法要么复杂，要么显示不一致的蛋白质表达。该技术的主要优点是，我们可以在相对较短的时间内实现为单个实验量身定制的各种蛋白质的受控表达水平。

要开始此程序，请将 TREX 293 细胞转移到每孔用 0.9 毫升全 DMEM 制备的 12 孔板中，以产生 50% 的汇合度。并将细胞在 CO2 培养箱中于 37 摄氏度孵育过夜。接下来，制备由 DMEM（此处所示的目标基因）、TRPV1（惰性质粒）和脂质体转染试剂组成的转染混合物。

对于电生理实验，在转染混合物的哺乳动物表达质粒中加入 EGFP，以便可视化成功转染的细胞。将转染混合物在室温下孵育 30 分钟。然后，将转染混合物滴加到 12 孔板中铺板的细胞上，以转染细胞。

用力摇动板，以确保 DNA 和转染试剂均匀分散。然后，将转染的细胞在 27 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，如果进行电生理学检查，通过在紫外灯下观察 EGFP 的荧光信号来确认细胞已成功转染。

如果进行电生理学，将细胞从 12 孔板转移到 500 μL 全 DMEM 中的 PDL 涂层盖玻片中。如果进行钙成像，请在 PDL 涂层钙成像室中发现大约 20， 000 个细胞。在此过程中，在双蒸水中制备 1 毫克/毫升的多西环素储备液。

将储备溶液在 4 摄氏度下避光保存长达三周。如需长期储存，请将多西环素储备液保持在零下 20 摄氏度。接下来，在完整的 DMEM 中制备新鲜的多西环素溶液。

并将其加热到 37 摄氏度。对于电生理记录，将 500 微升多西环素溶液以每毫升 2 微克的浓度移液到每个孔中，使多西环素的最终浓度为 1 微克/毫升。对于钙成像，向每个孔中加入 100 μL 多西环素溶液，浓度为 3 μg/mL，使多西环素的最终浓度为 1 μg/mL。

将样品孵育所需的时间，以便在 37 摄氏度和 5% 的 CO2 下诱导。要通过钙成像校准蛋白质表达，请制备林格溶液并将其加热至 37 摄氏度。为了帮助分散 AM 酯，荧光离子指示剂（例如水性溶液中的 Fura-2）制备非离子 F-127 的 DMSO 溶液。

将溶液加热至 27 摄氏度，直到非离子 F-127 溶解。然后将非离子 F-127 溶液储存在室温下，并在使用前再次加热至 37 摄氏度。之后，从林格氏液制备 Fura-2 AM 加载溶液，补充 2 至 3 微摩尔 Fura-2 AM、02 毫克/毫升非离子 F-127 和 10 毫摩尔 D-葡萄糖。

然后从腔室中的细胞中吸出培养基，并用 Fura-2 AM 上样溶液替换。将细胞在室温下避光孵育 60 分钟。然后，吸出 Fura-2 AM 溶液。

并用林格氏和 10 毫摩尔 D-葡萄糖溶液洗涤细胞，以去除多余的细胞染料。在每个溶液中留下 200 微升林格氏液和 10 毫摩尔 D-葡萄糖溶液。并在室温下避光孵育 30 分钟。

30 分钟后，将腔室放在显微镜鼻托上方的载物台上，并用支架固定。然后根据最终所需浓度计算并制备 TRPV1 特异性激动剂 capsaisin 的工作浓度。接下来，打开灯、相机和显微镜，然后选择 Fura-2 滤光片以检测 510 纳米波长的发射。

调整所需的放大倍率，并通过使用显微镜旋钮纵这些参数来聚焦所选视野中的细胞。在黑暗中，减去背景光并设置曝光时间。将图片采样设置为所需的速率。

然后，首先通过在 340 纳米和 380 纳米波长下激发 Fura-2 负载细胞来记录它们的荧光响应。340 与 380 个信号的比率是细胞内钙浓度的指标，因此也是 TRPV1 活性的指标。随后，在 200 μL 林格氏溶液中加入两种微摩尔辣椒素，以产生一种微摩尔辣椒素的最终饱和浓度，以评估 TRPV1 的表达水平并分析 TRPV1 反应。

要确定单通道记录的理想诱导时间，首先准备浴槽和移液器溶液。然后准备一些玻璃移液器，火抛光至 10 至 12 兆欧姆的电阻。通过在目标细胞的膜上形成密封来进行全细胞膜片钳。

随后，将保持电位设置为负 40 毫伏。并通过施加负压使膜破裂。然后，使用显微作器，将带有 mebrane 贴片的移液器从细胞中提起。

然后将 profusion 系统直接放置在包含膜贴剂的移液器旁边。将贝塞尔滤波器和输出增益分别降低到 2 到 5 killahurtz 和 10 A。之后，将饱和浓度的激动剂大量涂抹在膜贴上。

然后根据应用于细胞的诱导时间分析成功记录的单通道贴片的数量，并根据所需的结果调整诱导时间。此处显示的是辣椒素应用前后瞬时表达 RTRPV1 的 TREX 293 细胞的伪彩色图像。以下是处理、转染的 TREX 293 细胞中细胞内钙水平随时间的相应变化。

每个图形表示 50 个单元格的平均值。TRPV1 记录中单通道补丁的成功率取决于诱导时间。以下是 TREX 293 细胞在诱导 2 小时和 4 小时后瞬时表达 RTRPV1 的补丁的当前痕迹。

该图描述了在指定的诱导时间之后补丁中的通道数。如果作得当，该技术可以在转染后 12 小时内对表达受控的蛋白质进行分析。尝试此程序时，请务必记住标准化不同蛋白质的转染浓度和诱导时间。

观看本视频后，您应该对如何以省时的方式为您选择的离子产生可控的表达系统有一个很好的了解。