Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

这种迁移测定的总体目标是在体外研究淋巴细胞外渗到中枢神经系统的情况。这种方法有助于进一步了解中枢神经系统的炎症性疾病和开发新的治疗方法。该技术的一些优点是易于获得，并且允许在单细胞水平上分析稀有淋巴细胞群。

该方法有助于了解淋巴细胞穿越血脑屏障的迁移情况，可应用于血脑脊液屏障的迁移研究。此外，可以进行 Evans 蓝渗透分析以评估血脑屏障模型的完整性。首先，用 2 毫升新鲜制备的纤连蛋白溶液覆盖 T-25 细胞培养瓶的底部，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中孵育至少 3 小时。

孵育结束时，将纤连蛋白溶液替换为 7.2 乘以 10 的 6 毫升完全 ECM-b 培养基中的第四个人脑微血管内皮细胞或 HBMEC，并将培养瓶放回培养箱中。当 HBMEC 达到 80% 汇合时，将上清液转移到 15 毫升锥形管中，并用 5 毫升 PBS 洗涤贴壁细胞 3 次。第三次洗涤后，向细胞中加入 2 毫升预热的 Accutase 溶液，在 37 摄氏度下放置 2 分钟。

然后用力敲击培养瓶数次，通过光学显微镜确认细胞分离。当细胞开始从培养瓶底部浮出时，使用收获的上清液反复冲洗培养瓶，直到大部分 HBMEC 重悬。然后将细胞悬液转移到 15 毫升锥形管中进行离心，并将沉淀重悬于 1 毫升新鲜的 ECM-b 培养基中进行计数。

为了制备用于迁移测定的细胞培养小室，首先将 100 μL 纤连蛋白溶液添加到每个小室和 96 孔平底板的一个孔中。在 37 摄氏度下放置 3 小时后，用 100 μL HBMEC 替换纤连蛋白溶液，并将 600 μL 新鲜 ECM-b 培养基添加到细胞培养小室的下隔室中。然后将板放回细胞培养箱中 3 到 4 天。

为了测试是否已达到屏障完整性，从一个细胞培养小室的下室和上室中吸出培养基，并向小室中加入 100 微升新鲜制备的伊文思蓝溶液。将 600 微升补充有 B27 的 PBS 添加到下隔室中，然后将板放回培养箱中。一小时后，用镊子小心地取出插入物，并将 100 微升 PBS B27 从下室转移到黑色聚苯乙烯 96 孔平底板的两个独立孔中。

然后将板加载到多功能酶标仪中，并确定最佳 z 位置。为了确定 HBMEC 屏障功能，使用适当的设置测量 Evans blue 染料溶液的激发，并将采集的数据与描述接种后不同时间点 HBMEC 的 Evans blue 渗透的标准曲线进行比较。确认细胞单层形成后，在补充有 B27 的 RPMI 培养基中，将外周血单核细胞或 PBMC 样品重悬至浓度为每毫升细胞的 5 倍 10 至第 6 个细胞。

接下来，从含有汇合 HBMEC 单层的适当数量的细胞培养插入物的下隔室和上隔室中吸出培养基，并将每个供体 100 微升 PBMC 添加到细胞培养插入物中，并添加到每个体外对照的 24 孔板的一个孔中。将 600 μL RPMI 加 B27 添加到细胞培养小室的下隔室中，向体外对照孔中加入 500 μL，然后将板放回细胞培养箱中 6 小时。孵育结束时，使用镊子取出细胞培养小室，用 400 μL PBS 小心冲洗底部，不要接触膜。

然后将 20 μL 流式荧光球与实验和体外对照孔中的细胞充分混合，并将 1 mL 所得 PBMC 悬浮液转移到相应的流式细胞仪管中。通过离心收集细胞，并将感兴趣的荧光染料偶联抗体添加到 100 μL 流式细胞术缓冲液中。在 4 摄氏度下放置 30 分钟后，用 250 μL 新鲜流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于适当体积的流式细胞术缓冲液中进行分析。

采集完所有数据后，打开相应的流式细胞术分析软件。要分析 NK 细胞亚群迁移，首先在侧向散射通道图中选择淋巴细胞，然后在 CD3 与 CD56 点图中显示细胞。然后选择 CD56 阳性、CD3 阴性的 NK 细胞。

为了区分转位的 NK 细胞亚群，在 CD56 与 CD16 图中显示细胞，并设门 CD56bright、CD16dim 或阴性细胞以及 CD56dim、CD16 阳性细胞。然后从正向与侧向散点图中选择 Flow-Count Fluorospheres。要确定磁珠编号，请在覆盖 525 至 700 纳米发射波长与时间变化的通道图中显示所选数据。

最后，确定迁移的 NK 细胞的百分比，即迁移的细胞总数与体外对照中细胞总数之间的比率。培养 3 到 4 天后，HBMEC 表达紧密连接分子 Zonula occludens-1 并在单层中生长，表现出跨内皮电阻和降低的 Evans 蓝染料渗透。在整个 PBMC 迁移测定之前，用干扰素 γ 和 TNF α 刺激内皮细胞单层 24 小时，导致所有分析的淋巴细胞群的迁移增加。

有趣的是，在未刺激和细胞因子激活的 HBMEC 中，CD56bright、CD16dim 或阴性 NK 细胞表现出比 CD56dim、CD16 阳性 NK 更高的迁移能力。尽管总体上 CD56dim 细胞通过发炎细胞单层的迁移相对增加较高，但模拟了 CD56bright、CD16dim 阴性 NK 细胞在鞘内隔室中富集的体内观察结果。掌握后，这项技术可以在 10 小时内完成。

用干扰素 γ 和 TNF α 对体外迁移装置进行预处理，可以研究炎症条件下的淋巴细胞迁移。我们的方案可以通过施加剪切力或与血脑屏障的其他细胞（如星形胶质细胞）共培养来修改，以提供淋巴细胞迁移到中枢神经系统的精细模型。观看此视频后，您应该对如何使用人血脑屏障的体外模型研究淋巴细胞迁移有很好的了解。