使用淋巴细胞外渗分析 体外 人源血脑屏障模型

本跨膜迁移实验的总体目标是体外研究淋巴细胞向中枢神经系统的外渗过程。该方法有助于进一步理解中枢神经系统的炎症性疾病，并推动新型治疗策略的开发。该技术的一些优势在于操作简便，且能够在单细胞水平上分析稀有的淋巴细胞群体。

该方法可用于研究淋巴细胞跨越血脑屏障的迁移过程，并可应用于血-脑脊液屏障迁移机制的研究。此外，还可通过伊文思蓝渗透分析来评估血脑屏障模型的完整性。首先，在细胞培养箱（37摄氏度、5%二氧化碳）中，将两毫升新配制的纤连蛋白溶液加入T-25细胞培养瓶底部，孵育至少三小时。

孵育结束后，弃去纤连蛋白溶液，加入6毫升完全ECM-b培养基，其中含有7.2 × 10⁴个人脑微血管内皮细胞（HBMEC），然后将培养瓶放回孵育箱。当HBMEC达到80%融合度时，将上清液转移至15毫升锥形管中，并用5毫升PBS洗涤贴壁细胞3次。第三次洗涤后，在37°C条件下向细胞中加入2毫升预热的Accutase溶液，作用2分钟。

然后轻轻敲击培养瓶数次，并通过光学显微镜观察确认细胞是否已脱离。当细胞开始从培养瓶底部脱落时，使用收集的上清液反复冲洗培养瓶，直至大部分HBMEC重新悬浮。随后将细胞悬液转移至15毫升锥形管中进行离心，并将沉淀重悬于1毫升新鲜ECM-b培养基中，用于细胞计数。

为进行跨膜迁移实验，首先向每个细胞培养小室及一块96孔平底板中的一个孔内各加入100微升纤连蛋白溶液。在37摄氏度孵育3小时后，将纤连蛋白溶液替换为100微升HBMEC细胞悬液，并向细胞培养小室的下室加入600微升新鲜ECM-b培养基。然后将培养板放回细胞培养箱中继续培养3至4天。

为了检测屏障完整性是否已达到，吸出一个细胞培养小室下层和上层隔室中的培养基，并向小室内加入 100 微升新鲜配制的伊文思蓝溶液。向下层隔室中加入 600 微升添加了 B27 的磷酸盐缓冲液（PBS），然后将培养板放回培养箱。一小时后，使用镊子小心取出小室，并将下层隔室中的 100 微升 PBS B27 溶液分别转移至黑色聚苯乙烯 96 孔平底板的两个独立孔中。

然后将培养板放入多功能酶标仪中，并确定最佳的 z 轴位置。为评估 HBMEC 屏障功能，使用适当参数检测伊文思蓝染料溶液的激发光信号，并将获得的数据与标准曲线进行比较，该标准曲线显示了不同接种时间点后伊文思蓝穿过 HBMEC 的渗透情况。在确认细胞单层形成后，用添加了 B27 的 RPMI 培养基将外周血单个核细胞（PBMC）样品重悬至浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/毫升。

接下来，吸去含有融合的 HBMEC 单层细胞的适当数量细胞培养小室的上下室中的培养基，向每个细胞培养小室以及每个体外对照的 24 孔板中的一个孔加入每个供体 100 微升的 PBMC。向细胞培养小室的下室中加入 600 微升 RPMI 加 B27，向体外对照孔中加入 500 微升，并将培养板放回细胞培养箱中孵育 6 小时。孵育结束后，使用镊子取出细胞培养小室，用 400 微升 PBS 小心冲洗其底部，避免接触膜。

然后将20 µL Flow-Count Fluorospheres充分混匀于实验组和体外对照孔中的细胞中，并将1 mL所得PBMC悬液转移至相应的流式细胞术检测管中。通过离心收集细胞，随后在每份样本中加入100 µL流式细胞术缓冲液配制的荧光染料标记的特异性抗体。在4°C孵育30分钟后，用250 µL新鲜的流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于适当体积的流式细胞术缓冲液中用于检测分析。

当所有数据采集完成后，打开相应的流式细胞术分析软件。为分析 NK 细胞亚群的跨膜迁移，首先在侧向散射光与前向散射光通道图中选择淋巴细胞，并在 CD3 与 CD56 点图中显示细胞，然后选择 CD56 阳性、CD3 阴性的 NK 细胞。

为了区分迁移后的NK细胞亚群，将细胞显示在CD56与CD16的散点图中，并圈选CD56bright、CD16dim或CD16阴性细胞以及CD56dim、CD16阳性细胞。然后从前向散射与侧向散射散点图中选择Flow-Count荧光微球。为确定微球数量，将选定的数据以发射波长介于525至700纳米的通道与时间的关系图进行显示。

最后，通过计算迁移细胞总数与体外对照组细胞总数的比值，确定 NK 细胞迁移的百分比。经过三至四天的培养后，人脑微血管内皮细胞（HBMEC）表达紧密连接分子 Zonula occludens-1，并形成单层细胞，表现出跨内皮电阻以及降低的伊文思蓝染料通透性。在进行全外周血单个核细胞（PBMC）跨内皮迁移实验前，用干扰素 γ 和 TNF α 刺激内皮细胞单层 24 小时，可导致所有被分析的淋巴细胞亚群迁移增加。

有趣的是，在未刺激和细胞因子激活的人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中，CD56bright、CD16dim或CD16阴性的自然杀伤（NK）细胞均表现出比CD56dim、CD16阳性NK细胞更强的迁移能力。尽管总体而言，CD56dim细胞穿过炎症状态单层细胞的跨膜迁移率相对升高更为显著，这模拟了体内观察到的现象，即CD56bright、CD16dim阴性NK细胞在鞘内腔室中富集。该技术一旦掌握，可在10小时内完成。

使用干扰素γ和TNF-α对体外跨膜迁移实验系统进行预处理，可实现炎症条件下淋巴细胞迁移的研究。我们所述方案可通过施加剪切力或与血脑屏障的其他细胞（如星形胶质细胞）共培养的方式进行优化，从而为研究淋巴细胞向中枢神经系统迁移提供更精细的模型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用人源血脑屏障的体外模型来研究淋巴细胞的跨膜迁移过程。