支气管肺泡灌洗小鼠肺分析炎症细胞浸润

该程序的总体目标是通过支气管肺泡灌洗收集肺腔的细胞和非细胞内容物，用于离体分析和评估动物的持续疾病状态。该方法可以通过量化肺部先天细胞和体液反应来帮助回答呼吸免疫学领域关于感染和炎症诱导免疫机制的关键问题。该技术的主要优点是简单、高效且可重复性高，并且不需要特殊设备或工具。

在开始手术之前，通过将 23 号针头插入一根 0.5 厘米的透明塑料聚乙烯 21 号管中来制作导管，然后将动物置于仰卧位。固定小鼠的四肢并用 70% 乙醇对颈部进行消毒。然后用手术刀在气管附近做一个皮肤切口。

打开皮肤，露出唾液腺，用镊子分离腺体，露出胸骨舌骨肌。用镊子切开气管周围的肌肉。当它可见时，使用镊子在气管组织下穿一根棉缝合线。

接下来，使用 26 号针头小心地刺穿两个软骨环之间的气管中间，然后将预制导管插入气管腔约 0.5 厘米。用缝合线稳定导管。然后，在一毫升注射器中加入 1 毫升补充有 100 微摩尔 EDTA 的无菌平衡盐溶液。

将装有的注射器连接到导管上，轻轻地将平衡的盐和 EDTA 溶液注射到肺部。注射完所有盐水后，轻轻吸出溶液，同时按摩胸部。在注射和重新吸入固体液体时保持轻柔非常重要，以最大限度地提高 BAL 液的回收率并最大限度地减少剪切力。

如果固体液体通过鼻子，请沿导管重新固定缝合线。收集完所有抽吸物后，将液体转移到冰上的 15 毫升试管中，然后再重复灌洗两次。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 7 分钟内完成。

第三次支气管肺泡灌洗液收集后，离心混合抽吸物并将上清液储存在负 80 摄氏度。将沉淀重悬于 200 μL ACK 裂解缓冲液中。在室温下不超过 2 分钟后，用 1 mL 冷 PBS 稀释裂解缓冲液，然后离心收集细胞。

沉淀重悬于适当体积的 PBS 中，以用于待分析的样品数量，并将细胞分装到 96 孔板的适当孔中进行分析。通过另一次离心收集细胞，并将沉淀重悬于 50 微升 FC Block 和 PBS 中。在室温下放置 10 分钟后，向每个孔中加入 50 μL 适当的目标抗体混合物，并在 4°C 下避光孵育细胞 30 分钟。

在孵育结束时，离心板并弃去上清液，将沉淀重悬至每孔 200 微升 FAX 缓冲液的最终体积，用于流式细胞术分析。使用基于各种支气管肺泡灌洗细胞群表面抗原差异表达的门控策略，可以识别多种免疫细胞类型。单元和单序列根据其前向和侧向散射特性进行门控。

对活/死染料阴性细胞进行门控，然后鉴定 Cd11c High 和 Cd11c Low 细胞。在 Cd11c High 群体中，巨噬细胞和树突状细胞可以分别根据它们的 MHC-II 和 SinglecF 表达来识别。在 Cd11c Low 群体中，可以根据 T 细胞和 B 细胞各自的 CD3/CD19 和 MHC-II 表达来识别它们。

在其余细胞中，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞可以分别通过其 Cd11b 或 Ly-6G 标志物表达来识别。还可以添加计数珠子，通过比较珠子与细胞事件的比率来确定不同细胞群的绝对细胞数，例如，在幼稚动物和 LPS 刺激动物中。收集 BAL 液后，可以进行其他技术，如 ELISA 免疫印迹细胞因子微珠阵列，以回答有关 BAL 液中脱细胞含量的其他问题。

该技术发展后，为免疫学领域的研究人员探索小鼠肺腔的细胞和非细胞含量铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何高效且可重现地执行 BAL 有很好的了解。