Name: 支气管肺泡灌洗小鼠肺分析炎症细胞浸润 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习支气管肺泡灌洗技术用于小鼠肺部免疫学研究，通过流式细胞术分析巨噬细胞、T细胞、B细胞等炎症细胞浸润情况。该方法简单高效，无需特殊设备即可评估呼吸系统健康与疾病状态。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.V.H. 是根特大学生物医学分子生物学系的研究助理。E.R.J. 由 UniVacFlu（项目编号 607690）提供资助。K.R. 由欧盟第七框架计划项目 FLUNIVAC 提供资助。

本研究中描述的所有动物实验均依照国家法规（比利时法律14/08/1986和22/12/2003，比利时皇家法令06/04/2010）以及欧洲立法（欧盟指令2010/63/EU和86/609/EEC）进行。所有小鼠实验及动物实验方案均经根特大学伦理委员会批准（许可编号LA1400091和EC2016-027）。
1. 准备
<ol>
	<li>灌洗液
	<ol>
		<li>配制含100 µM乙二胺四乙酸（EDTA）的平衡盐溶液。 
		注意：为检测支气管肺泡灌洗液（BAL液）中的蛋白质水平，建议添加蛋白酶抑制剂以防止BAL液中蛋白酶的活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导管
	<ol>
		<li>通过将23 G针头插入透明塑料聚乙烯21 G导管（内径：0.58 mm，外径：0.965 mm，长度：0.5 cm）中制备导管。也可使用预制导管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉剂
	<ol>
		<li>准备终末麻醉剂，优选可引起呼吸停止的麻醉剂（例如，磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的戊巴比妥钠溶液（>100 mg/kg））。 
		注意：建议使用注射麻醉而非吸入麻醉，因为吸入麻醉可能影响BAL液的成分。例如，CO2会影响血液pH值，从而导致不同化合物的重新分布12。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氯化铵-碳酸氢钾（ACK）红细胞裂解缓冲液
	<ol>
		<li>通过将8.29 g NH4Cl和1 g KHCO3溶于含100 µM EDTA的1 L H2O中配制ACK裂解缓冲液；红细胞裂解缓冲液也可从外部供应商购买。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实施支气管肺泡灌洗（BAL）
<ol>
	<li>将导管插入气管
	<ol>
		<li>使用26 G针头经腹腔注射致死剂量的短效巴比妥类麻醉剂以处死小鼠。为确认已达到致死性麻醉效果，可用镊子夹捏小鼠后肢足部以检查足底反射。</li>
		<li>将动物仰卧位固定于手术板上，并用针固定四肢。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒颈部进行消毒。使用手术刀在靠近气管的颈部皮肤处做一切口。</li>
		<li>切开皮肤以暴露唾液腺。用镊子分离唾液腺，暴露胸骨舌骨肌。再用镊子切开气管周围的肌肉，充分暴露气管。</li>
		<li>用镊子将一根棉线从气管下方穿过。</li>
		<li>使用26 G针头小心穿刺暴露的气管软骨环之间的中段部位，注意避免进一步损伤气管组织。</li>
		<li>将导管插入气管约0.5 cm。确保导管插入深度适中，避免过深插入导致肺组织结构受损。</li>
		<li>利用步骤2.1.5中预先放置的棉线，结扎气管以固定导管。若结扎不充分，注入的平衡盐溶液可能逆流至呼吸道上段，而非进入肺部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集灌洗液
	<ol>
		<li>用1 mL注射器吸取1 mL含100 µM EDTA的无菌平衡盐溶液。</li>
		<li>将1 mL注射器连接至导管，缓慢将盐溶液/EDTA溶液注入肺内。</li>
		<li>在轻柔按摩小鼠胸壁的同时回抽液体。若注射器内未见回吸液体，可小心将导管在气管内稍作进退调整。</li>
		<li>将注射器从针头取下，将回收的灌洗液转移至置于冰上的15 mL离心管中。通常情况下，每注入1 mL液体可回收700–900 µL的支气管肺泡灌洗液（BAL）。</li>
		<li>重复步骤2.2.1–2.2.4共两次。 
		注意：若实验目的为分析非细胞成分，当检测灵敏度不足时，建议对合并后的样本进行浓缩处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 收集支气管肺泡灌洗液中的细胞与非细胞成分
<ol>
	<li>离心灌洗液，400 × g，7 分钟 4 °C.</li>
	<li>收集上清液，并立即用于后续分析（例如， ELISA）或在 -80 °C保留细胞沉淀，用于分析肺部的细胞浸润情况。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 200 µL ACK裂解缓冲液 
	注意：此步骤可确保红细胞裂解，同时保持白细胞完整。</li>
	<li>室温孵育 2 分钟。 
	注意：为减少红细胞裂解造成的变异，此步骤不应超过 2 min。</li>
	<li>加入1 mL冷的PBS以稀释ACK裂解缓冲液。</li>
	<li>400 × g 条件下离心 7 分钟 4 °C弃去上清液，并将细胞重悬于适量 PBS 中，用于后续分析（见下文）。 
	注意：PBS 的体积取决于后续将要进行的研究。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液中的不同细胞类型
注意：可通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液（BAL）中细胞的绝对数量和相对组成。本文旨在详细阐述BAL技术。流式细胞术本身是一种专门的技术，建议参阅有关流式细胞术的专门文献13,14,15,16,17。实验中使用与荧光染料偶联的抗体，识别特定细胞类型（见表1）的表面抗原。通过设门策略，可在BAL细胞组分中鉴定T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗原</td>
			<td>细胞类型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分化簇3 (CD3)</td>
			<td>在T细胞上表达</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分化簇11c (CD11c)</td>
			<td>大多数树突状细胞上高表达，但也存在于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及部分B细胞上。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分化簇11b (CD11b)</td>
			<td>在多种白细胞表面表达，包括单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、粒细胞和巨噬细胞。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiglecF</td>
			<td>肺泡巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII</td>
			<td>通常仅存在于抗原呈递细胞上，如树突状细胞、单核吞噬细胞和B细胞。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>B淋巴细胞抗原</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly-6G</td>
			<td>单核细胞、粒细胞和中性粒细胞的标志物</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：免疫细胞表面抗原的选择。 本表列出了用于鉴定不同细胞类型的表面表位。需要多种标志物的组合才能可靠地定义特定的细胞类型。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样本</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>管</td>
			<td>待加入细胞的抗原-荧光素标记物</td>
			<td>抗体储存浓度 (mg/mL)</td>
			<td>抗体稀释倍数</td>
			<td>总体积 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>可固定活力染料</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/1000</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CD11c</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/800</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SiglecF</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/100</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样本 X</td>
			<td>MHCII</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CD3</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CD19</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CD11b</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ly6G</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>电压对照</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>管</td>
			<td>待加入细胞的抗原-荧光素标记物</td>
			<td>抗体储存浓度 (mg/mL)</td>
			<td>抗体稀释倍数</td>
			<td>总体积 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未染色细胞</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染细胞</td>
			<td>可固定活力染料</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/1000</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染细胞</td>
			<td>CD11c</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/800</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染细胞</td>
			<td>SiglecF</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/100</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染细胞</td>
			<td>MHCII</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染细胞</td>
			<td>CD3</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染细胞</td>
			<td>CD19</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染细胞</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染细胞</td>
			<td>Ly6G</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>补偿对照</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>管</td>
			<td>待加入微珠的抗原-荧光素标记物</td>
			<td>抗体储存浓度 (mg/mL)</td>
			<td>抗体稀释倍数</td>
			<td>总体积 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未染色微珠</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染微珠</td>
			<td>CD11c</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/2000</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染微珠</td>
			<td>SiglecF</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/2000</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染微珠</td>
			<td>MHCII</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染微珠</td>
			<td>CD3</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/2000</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染微珠</td>
			<td>CD19</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/2000</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染微珠</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/400</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单染微珠</td>
			<td>Ly6G</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1/200</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 需包含的对照列表。 本表格列出了准确解读实验结果所需的所有必要对照。
<ol>
	<li>细胞表面染色 
	注意：流式细胞术分析中必须包含所有关键对照。需要准备三组试管（见表2）：（1）含样品的试管；（2）每种抗体-荧光素组合对应的支气管肺泡灌洗（BAL）细胞试管，用于单染，以确定流式细胞仪各通道的电压；（3）每种抗体-荧光素组合对应的微珠试管，用于单染，以确定补偿矩阵。
	<ol>
		<li>在PBS中按适当稀释比例配制抗体混合液和Fc阻断剂（抗CD16/CD32）（见表2）。实验前需确定每种抗体的最佳工作稀释度。</li>
		<li>将样品细胞重悬于50 µL抗体混合液中，并向各关键对照管中加入50 µL相应稀释的单个抗体。 
		注意：染色可在96孔U型板中进行，便于减少染色体积并同时处理大量样本。</li>
		<li>在4 °C避光孵育30分钟。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心7分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用PBS将细胞重悬至终体积200 µL。 
		注意：该终体积取决于流式细胞仪可检测的最小体积，不同仪器间略有差异。此外，读取体积还取决于细胞数量和/或样本在流式细胞仪中运行所需的时间。</li>
		<li>将样品和对照用于流式细胞术分析。 
		注意：为确定不同细胞群体的绝对细胞数，应加入计数微珠。在上机检测前，向每个样本中加入相同数量的微珠（约±25,000个）。通过前向散射和侧向散射，可在流式细胞术中识别计数微珠（见图1）。随后，通过比较微珠事件与细胞事件的比例，可计算样本中细胞的绝对数量。可使用以下公式： 
		<img alt="流式细胞术公式：使用添加微珠计算绝对细胞数；实验计算方法。" src="/files/ftp_upload/55398/55398eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分析 
	注意：染色程序完成后应立即进行流式细胞术分析。必须使用具有适当激光器和滤光片以检测信号的流式细胞仪。表3概述了本研究中所需的激光器和滤光片。有关流式细胞术分析的更多信息，请参见Adan 等18。
	<ol>
		<li>根据前向散射和侧向散射设置初始门控，排除碎片和双联体（见图1）。</li>
		<li>利用单染细胞和微珠调整电压及光谱重叠的补偿。 
		注意：这些设置因流式细胞仪型号而异，每次实验前均需检查。正确的流式分析中，前向散射和侧向散射电压至关重要。合适的前向和侧向散射有助于识别和确认被分析细胞的身份。为确定这些电压，应首先运行未染色样本。</li>
		<li>设置表面抗原的荧光门控（见图1），并分析样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>激光类型</td>
			<td>滤光片设置</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>505 LP</td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蓝色 (488 nm) </td>
			<td>550 LP</td>
			<td>575/26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mW</td>
			<td>670 LP</td>
			<td>685/35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>750 LP</td>
			<td>780/60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>紫色 405 nm</td>
			<td></td>
			<td>450/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>红色 633 nm</td>
			<td></td>
			<td>660/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mW</td>
			<td>750 LP</td>
			<td>780/60</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：本研究中所用流式细胞仪的激光器和滤光片概述。

<ol><li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+protein+alleles+using+knockin+mice+and+a+chemical+inducer+of+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization.</a> Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).</li>
<li>Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+processes+in+the+human+lung+in+health+and+disease%3A+evaluation+by+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage.</a> Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).</li>
<li>Gee, J. B., Fick, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage.</a> Thorax. 35 (1), 1-8 (1980).</li>
<li>Tornling, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+in+bronchoalveolar+lavage+in+rats+exposed+to+quartz%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ind+Med%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz.</a> Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).</li>
<li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+respiratory+tract+toxicity+of+inhaled+material%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material.</a> Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).</li>
<li>Morris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+analysis+of+the+lung+microbiota+of+cynomolgous+macaques+during+long-term+SHIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection.</a> Microbiome. 4 (1), 38(2016).</li>
<li>Naessens, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+treatment+prevents+respiratory+syncytial+virus-induced+pulmonary+exacerbation+responses+in+postallergic+mice+by+stimulating+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation.</a> J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).</li>
<li>Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+cellular+analyses+in+conjunction+with+high-resolution+computed+tomography+imaging+as+a+diagnostic+intervention+for+patients+with+suspected+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+India%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease.</a> Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).</li>
<li>Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage.+The+report+of+an+international+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference.</a> Chest. 90 (1), 122-131 (1986).</li>
<li>Baughman, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uncertainties+of+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">The uncertainties of bronchoalveolar lavage.</a> Eur Respir J. 10 (9), 1940-1942 (1997).</li>
<li>Singletary, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+common+BAL+technique+to+enhance+sample+diagnostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).</li>
<li>Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+influence+of+CO2%2C+as+an+agent+for+euthanasia%2C+on+the+pharmacokinetics+of+basic+compounds+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents.</a> Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Rubio-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Characterization+of+Macrophages+from+Rat+Kidney+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+flow+cytometry+assay+to+measure+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity.</a> J Vis Exp. (82), e51105(2013).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5061/the-elisa-method">The ELISA method.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19066547">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+fluorometric+immunoassay+testing+methodology+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li>
<li>Song, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+bronchoalveolar+lavage+method+based+on+suction+frequency+number+and+lavage+fraction+number+using+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Res%22%5BJournal%5D)">Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats.</a> Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).</li>
<li>Seliger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+high-precision+flow+cytometry+based+technique+for+total+white+blood+cell+counting+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens.</a> Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).</li>
<li>Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage%3A+role+in+the+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+management+of+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease.</a> Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+endotoxins+during+sensitization+prevents+further+endotoxin-induced+exacerbation+of+airway+inflammation+in+a+mouse+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma.</a> Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+downregulates+airway+inflammation+induced+by+lipopolysaccharide+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse.</a> Respir Res. 6, 91(2005).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+endotoxins+on+allergen+sensitization+and+challenge+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse.</a> Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).</li>
<li>Hachet-Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+neutralizing+molecules+to+inhibit+actions+of+the+chemokine+CXCL12%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12.</a> J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).</li>
<li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+lung+S1P%281%29+receptor+reduces+allergen-induced+plasma+leakage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).</li>
<li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergen-induced+lung+inflammation+in+actively+sensitized+mice+assessed+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging.</a> Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).</li>
<li>Reber, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociated+glucocorticoid+receptor+modulator+reduces+airway+hyperresponsiveness+and+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma.</a> J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).</li>
<li>Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+lactate+dehydrogenase+and+its+isoenzymes+as+indicators+of+lung+damage+or+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation.</a> Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).</li>
<li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+lung+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage.</a> Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).</li>
<li>Forget, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adherent+cell+perifusion+technique+to+study+the+overall+and+sequential+response+of+rat+alveolar+macrophages+to+toxic+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances.</a> Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).</li>
<li>Sung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+from+welding-fume-exposure-induced+lung+fibrosis+and+pulmonary+function+changes+in+sprague+dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats.</a> Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).</li>
<li>Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+possible+role+of+proteasomes+in+the+bronchoalveolar+space+of+the+injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung.</a> Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).</li>
<li>Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+rat+alveolar+macrophages+by+bronchoalveolar+lavage+under+normal+and+activated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions.</a> Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).</li>
<li>Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+pulmonary+macrophage+and+neutrophil+function+in+sequential+bronchoalveolar+lavage+aspirates+in+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis.</a> Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).</li>
<li>Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+quartz+exposed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ind+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats.</a> Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).</li>
<li>Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1-antitrypsin+content+in+the+serum%2C+alveolar+macrophages%2C+and+alveolar+lavage+fluid+of+smoking+and+nonsmoking+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects.</a> J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

支气管肺泡灌洗（BAL）是一种用于获取细胞学和生物化学信息的有效技术，可用于评估感染或药物引起的反应。最初，BAL被用于治疗光气中毒患者过量的黏液分泌3。如今，该技术在临床上被广泛用于研究肺部疾病的发病机制、诊断及治疗管理3,24。在实验动物中，BAL常用于监测肺部气道内的炎症反应、免疫机制以及感染性疾病的进程1,2。
为了研究呼吸系统疾病模型中的炎症细胞模式，支气管肺泡灌洗（BAL）后应进行细胞绝对计数和分类计数。除了细胞的绝对数量外，各类细胞的相对数量也具有重要意义。例如，在肺组织修复和肺癌模型中，BAL细胞总数可能仅出现极轻微增加甚至无明显变化，此时评估细胞组成尤为有用。通过结合细胞染色与光学显微镜观察，可根据形态学特征识别不同类型的细胞，如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞25,26,27,28,29,30。流式细胞术可用于更特异性的分析，例如鉴定不同T细胞表型7,31。除了分析浸润的各类细胞群体外，还可利用BAL样本研究肺部非细胞成分。通过在BAL液体中进行ELISA、免疫印迹、细胞因子微球阵列、免疫组织化学以及定量聚合酶链式反应等方法，可检测细胞因子、生长因子及其他炎症相关成分。为评估肺组织损伤程度，还可测定BAL液中的总蛋白含量和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase）水平32,33。
随着新型诊断工具的发展，支气管肺泡灌洗液成分的基因组学和蛋白质组学表征在不久的将来将成为可能。计算能力的不断提升与高通量基因表达技术的结合，将有助于定义各种疾病状态下的特异性基因表达谱。在支气管肺泡灌洗液上应用这些技术，可获得基因和蛋白质的表达模式，从而识别出参与肺部疾病不同阶段的关键分子。
支气管肺泡灌洗液（BAL）所获得数据的主要局限性在于不同研究试验之间缺乏可比性3,9。灌洗技术以及后续的BAL液处理过程存在高度变异性。为了能够对各次BAL试验进行比较，必须对灌注的灌洗液类型、灌注部位以及用于分析细胞和非细胞成分的回收液部分进行标准化。不同研究之间在灌洗回收次数上存在显著差异，范围从1次到14次不等34,35,36。这种差异可能影响肺部总细胞数的估算结果。明确哪一部分BAL液中含有大多数细胞至关重要。Song et al. 的研究表明，约70%的总细胞数在第一至第三次回收液中被获取22。然而，其他研究报道第二次灌洗回收的细胞数多于第一次37,38。从这些研究中可以得出结论：仅进行一次回收的灌洗操作不能代表整个肺部情况，可能导致对结果的误判。
支气管肺泡灌洗液的非细胞成分含有反映肺部健康状况的重要信息33,39,40。支气管肺泡灌洗液稀释程度的差异会导致可溶性组分定量结果不同，从而引起不同试验间结果的差异。Song et al. 比较了每次灌洗不同组分中的蛋白质和乳酸脱氢酶水平，得出结论：第一次灌洗组分中的含量是第二次灌洗组分的两到三倍。
为了获得具有代表性的支气管肺泡灌洗（BAL）样本用于分析，需注意一些关键技术要点。其中之一是进行适当的麻醉。必须检查小鼠的足部反射，以确保达到终末期镇静状态。这不仅出于伦理学考虑，而且因为如果小鼠未充分麻醉，将难以置入并维持导管于正确位置。
第二个重要的技术考虑因素是导管在气管中的位置。当导管插入过深时，可能会损伤肺部结构。在支气管肺泡灌洗（BAL）操作过程中，导管的远端不应到达肺部。导管还应使用棉线固定并结扎。如果导管未被固定，注入的生理盐水可能向上流入鼻腔，而非向下进入肺部。在注射和抽吸生理盐水的过程中，必须保持导管稳定。
从支气管肺泡灌洗液（BAL）中获得的数据必须能够代表整个小鼠肺部的情况。因此，灌注适当体积的生理盐水缓冲液至关重要（即&#160;3 mL，分3次，每次1 mL）。细胞收获量与BAL液体收获量之间不存在线性关系。在轻柔按摩小鼠胸壁的同时，应小心地收集灌洗液。如果施加的剪切力过大，可能会损害气道及BAL液中细胞的活性、功能和结构。如果在注射器中未见吸入的液体，应小心地将导管在气管中插入更深或稍退出一些。
在支气管肺泡灌洗液（BAL）的处理与分析过程中，需特别注意某些特定环节，以最大限度地保留BAL样本中的信息。BAL采集后，细胞处于缺乏营养的生理盐水中，因此必须在采样后1小时内尽快处理样本。若需较长时间储存，则必须使用添加营养成分的培养基。
为保持细胞活性，应避免使用促进细胞黏附于表面的离心管。离心细胞悬液时，应避免采用可能破坏细胞完整性或影响回收的支气管肺泡灌洗（BAL）细胞均匀重悬的转速。含有细胞的BAL液体应在400 × g、4 °C条件下离心7分钟。需要注意的是，细胞悬液在处理过程中应始终保持在4 °C环境中。

气道会遇到多种损伤因素，这些因素可能导致炎症、病原体入侵或恶性转化。衬覆肺腔表面的上皮细胞构成了哺乳动物体内的重要屏障之一。它们与肺泡巨噬细胞共同作用，阻止环境中的有害物质通过气道侵入全身系统。此类有害物质包括有机和无机化学物质、细菌以及病毒。同样，也可设计特定的免疫接种或治疗干预手段以靶向肺部。在所有这些情况下，对所引发反应进行详尽的分析，对于理解、干预或预防呼吸系统内发生的生物学过程至关重要。
支气管肺泡灌洗（BAL）是一种分析此类反应的重要方法，因为所获得的样本包含了有关肺部气道内炎症反应、免疫机制以及感染性疾病进展的关键信息1,2通过使用支气管肺泡灌洗（BAL），可以研究浸润的细胞。这与消化肺组织所获得的结果形成对比，后者提供的是 &#34;更脏的&#34; 细胞群体，其中包含大量死亡和黏附性细胞。支气管肺泡灌洗（BAL）通过将生理盐水溶液注入终末细支气管，随后回收该溶液而实现。回收的液体可用于定量及表型分析肺部常驻细胞和浸润性炎性细胞。该方法常用于研究气道疾病模型中的细胞浸润情况，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）以及感染性疾病模型。除细胞成分外，肺气道的分子组成也在支气管肺泡灌洗液（BALF）中得以反映。为分析其分子成分，可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹（immunoblot）以及细胞因子微球阵列（cytokine bead array）同时检测多种细胞因子，以评估细胞因子和趋化因子的存在情况。
BAL 是一种成熟的方法，用于研究炎症性呼吸系统疾病动物模型中炎性细胞的浸润情况。观察到细胞浸润发生改变（例如， 淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞水平升高）有助于更深入地理解疾病，并可作为评估治疗干预效果的客观参数。
准确且可重复地解读支气管肺泡灌洗（BAL）细胞学分析结果，要求正确实施BAL操作，并对收集的灌洗液进行恰当的处理和加工。术语&#34;支气管灌洗&#34;由Stitt在八十多年前首次提出3。1961年，Myrvik从兔肺灌洗液中成功获取了肺泡巨噬细胞3。如今，BAL已成为小鼠模型中分析和监测肺部状况的常用方法，但科学文献中至今仍未见标准化BAL操作流程的报道4,5。此外，目前采用该技术的研究实验室众多，其操作方法可能同样繁多3,6,7,8,9,10,11。重要的是，BAL所获得的数据应代表整个小鼠肺部的情况，而非仅反映局部肺组织的状态。这种操作上的差异性增加了不同研究之间结果解读和比较的难度。
本文介绍了一种基础、低成本且可重复的支气管肺泡灌洗（BAL）操作方法，可用于收集小鼠气道腔内的细胞成分和可溶性成分。简言之，将导管插入已深度麻醉并处死的小鼠暴露的气管中，连接注射器后，将含有乙二胺四乙酸（EDTA）的缓冲盐溶液注入肺部。通过反复轻柔地推注和回抽活塞，对肺腔进行多次灌洗以采集样本。此过程中施加的负压应尽可能小，以防止气道塌陷。收集完成后，应对所得的支气管肺泡灌洗液进一步处理，以便通过流式细胞术对细胞进行计数和鉴定。

<table><tbody><tr><td>汉克斯平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>有刺激性</td></tr><tr><td>23 G × 1 1/4 针头</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>尺寸：0.60 × 30 mm</td></tr><tr><td>26 G × 1/2 针头</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td>尺寸：0.45 × 12 mm</td></tr><tr><td>塑料管</td><td>BD 医疗技术</td><td>427411</td><td>聚乙烯管，内径 0.58 mm (0.023&quot;)，外径 0.965 mm (0.38&quot;)，长度 30.5 m (100')</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 或酚红；经无菌过滤</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td>无热原且无毒</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools GmbH&amp;nbsp;</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools GmbH&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>TH.Geyer</td><td>7696705</td><td>无 RNase/DNase/内毒素</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>TH.Geyer</td><td>7696702</td><td>无 RNase/DNase/内毒素</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0030 120.094</td><td>聚丙烯材质</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>经无菌过滤</td></tr><tr><td>活/死细胞染料 - efluor 506</td><td>ebioscience</td><td>65-0866-18 &amp;nbsp;</td><td>可固定的活力染料</td></tr><tr><td>CD11c-PE-cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF-PE</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>552126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MHCII-APCefluor780</td><td>Biolegend</td><td>107628&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE-cy5</td><td>VWR</td><td>55-0031-U100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE-cy5</td><td>eBiosciences</td><td>15-0193-83&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-V450</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>560455&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-AF700</td><td>Biolegend</td><td>127621</td><td></td></tr><tr><td>绝对计数微球</td><td>Life Technologies Europe B.V.&amp;nbsp;</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD16/CD32 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 340 &amp;micro;l 储存板</td><td>Falcon</td><td>353263</td><td>V 型底，天然聚丙烯材质</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td>BD Biosciences</td><td>393202</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肺部支气管肺泡灌洗以分析炎性细胞浸润

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

支气管肺泡灌洗（Bronchoalveolar Lavage, BAL）是一种用于检测肺腔内细胞及非细胞成分的实验性操作 离体 深入了解一种持续存在的疾病状态。
本文介绍了一种简单且高效的方法，可在无需特殊工具或设备的情况下对小鼠肺部进行支气管肺泡灌洗（BAL）。通过将导管插入已深度麻醉小鼠的气管，将生理盐水溶液注入细支气管，从而收集灌洗液。通过轻柔回抽灌注液体，以最大化回收支气管肺泡灌洗液，并尽量减少剪切力。该技术有助于保持气道及灌洗液中细胞的活性、功能和结构完整性。
有多种技术可用于进一步了解肺部疾病状态。本文介绍了一种常用的方法，用于鉴定和计数不同类型的免疫细胞，该方法结合了流式细胞术与一组特定的荧光标记细胞表面标志物。&#160;此处所述的支气管肺泡灌洗（BAL）操作也可用于分析小鼠肺部的病原微生物、液体成分或吸入颗粒。

进行支气管肺泡灌洗时，使用3次、每次1 mL的缓冲盐溶液后，应回收2至3 mL的液体。可进一步分析该灌洗液，以表征其中的细胞成分和非细胞成分。为检测细胞因子和趋化因子的存在，可进行ELISA19、免疫印迹20，或利用细胞因子磁珠阵列法同时分析多种细胞因子21。此外，还可测定该液体中的白蛋白含量和总蛋白含量22。
以本研究为例，描述了如何通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液（BAL）的细胞成分。所分析的BAL液来自经气管内滴注脂多糖24小时后的雌性Balb/cAnNCrl小鼠（7周龄）。使用以下偶联荧光染料的抗体来鉴定不同类型的细胞：CD11c、SiglecF、MHCII、CD3ε、CD19、Ly6g和CD11b（见表1和材料表）。同时使用了可固定的活率染料。通过基于不同细胞群体表面抗原差异表达的设门策略（图1），可鉴定出巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
首先，根据前向散射和侧向散射参数排除碎片和双联体。使用活细胞染料对活细胞进行圈选。接着，鉴定出 CD11c 高表达细胞和 CD11c 低表达细胞。在 CD11c 高表达群体中，分别根据 MHCII 和 SiglecF 的表达鉴定巨噬细胞和树突状细胞。在 CD11c 低表达群体中，分别根据 CD3ε 和 CD19 的表达鉴定 T 细胞和 B 细胞。在剩余的细胞群体中，分别根据 CD11b 和 Ly-6G 标记物的表达鉴定中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
加入计数微球，通过比较微球事件与细胞事件的比例来确定不同细胞群体的绝对细胞数量23。这些计数微球根据其前向散射和侧向散射特性进行识别（图1）。表4概述了 naïve 小鼠以及经5 µg脂多糖刺激24小时后小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中不同细胞群体的绝对细胞数量。
<img alt="流式细胞术数据图表、细胞分化和免疫细胞设门过程、白细胞分析。" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞流式细胞术检测的设门策略。 根据所述支气管肺泡灌洗（BAL）方案分离BAL细胞。在小鼠气管内滴注脂多糖24小时后分离细胞。根据前向散射和侧向散射特性识别计数微球和细胞。在细胞设门中，利用前向散射和侧向散射识别单个细胞。在此最后的细胞群体中，识别出活细胞。随后识别CD11chigh细胞和CD11clow细胞。在CD11chigh细胞群中，分别根据MHCII和SiglecF的表达识别巨噬细胞和树突状细胞。在CD11clow细胞群中，分别根据CD3ε和CD19的表达识别T细胞和B细胞。在剩余的细胞群体中，分别根据CD11b和Ly-6G的表达识别中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞群体</td>
			<td>未刺激小鼠中细胞的绝对数量</td>
			<td>LPS 刺激小鼠中细胞的绝对数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>巨噬细胞</td>
			<td>79,612</td>
			<td>25,439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>树突状细胞</td>
			<td>495</td>
			<td>671</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 细胞</td>
			<td>45,271</td>
			<td>28,089</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B 细胞</td>
			<td>4,164</td>
			<td>2,926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中性粒细胞</td>
			<td>632</td>
			<td>566,716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>嗜酸性粒细胞</td>
			<td>3,483</td>
			<td>4,332</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：对未处理小鼠和LPS刺激小鼠的支气管肺泡灌洗液进行流式细胞术分析的代表性结果。

肺的健康状况可通过肺细支气管中存在的免疫细胞类型和数量来反映。本文介绍一种支气管肺泡灌洗技术，可用于分离和研究小鼠下呼吸道中的非黏附性细胞及可溶性因子。

支气管肺泡灌洗（Bronchoalveolar Lavage, BAL）是一种实验性操作，用于在体外检测肺腔内的细胞及无细胞成分，以获得……

本实验的总体目标是通过支气管肺泡灌洗获取肺泡腔内的细胞及无细胞成分，用于离体分析以及评估动物当前的疾病状态。该方法有助于解答呼吸免疫学领域中关于感染和炎症诱导的免疫机制的关键问题，其途径是通过定量分析肺部的固有细胞免疫和体液免疫应答。该技术的主要优点在于操作简单、高效且高度可重复，无需特殊设备或工具。开始操作前，将23号针头插入一段0.5厘米长的透明塑料聚乙烯21号导管中，制备导管，并将动物置于仰卧位。固定小鼠四肢，用70%乙醇对颈部进行消毒。然后使用手术刀在气管附近做皮肤切口。切开皮肤以暴露唾液腺，用镊子分离腺体，显露胸骨舌骨肌。用镊子在气管周围切开该肌肉。当气管组织可见时，用镊子将棉线缝合线穿过气管下方。接下来，使用26号针头在气管的两个软骨环之间小心穿刺气管中部，并将预先制备的导管插入气管腔内约0.5厘米。用缝线固定导管。然后，用1毫升无菌平衡盐溶液（添加100微摩尔EDTA）充满1毫升注射器。将装有液体的注射器连接至导管，轻柔地将平衡盐溶液和EDTA溶液注入肺部。当全部生理盐水注入后，在按摩胸壁的同时轻柔回抽液体。注射和回抽灌洗液时操作务必轻柔，以最大化支气管肺泡灌洗液的回收率，并尽量减少剪切力对细胞的损伤。如果固体中的液体经鼻部流出，需重新固定导管上的缝线。当所有抽吸液收集完毕后，将液体转移至预冷的15毫升离心管中，并重复灌洗操作两次。若操作得当，熟练掌握此技术后可在七分钟内完成。第三次支气管肺泡灌洗液收集完成后，将合并的灌洗液离心，并将上清液于-80摄氏度保存。将沉淀重悬于200微升ACK裂解缓冲液中。室温孵育不超过2分钟后，加入1毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释裂解液，随后通过离心收集细胞。根据待分析样品的数量，用适当体积的PBS重悬沉淀，并将细胞分装至96孔板中相应数量的孔内进行分析。再次离心收集细胞，然后将沉淀重悬于50 µL FC阻断剂和PBS中。室温孵育10分钟后，向每孔加入50 µL相应感兴趣的抗体混合液，在4°C避光孵育30分钟。孵育结束后，离心微孔板并弃去上清液，将沉淀重悬于每孔200微升FAX缓冲液中，用于流式细胞术分析。根据支气管肺泡灌洗液中不同细胞群体表面抗原的差异表达，采用设门策略可鉴定多种免疫细胞类型。细胞及单细胞群体根据其前向散射和侧向散射特性进行设门。活/死染料阴性细胞设门后，进一步鉴定Cd11c高表达和Cd11c低表达细胞。在Cd11c高表达群体中，根据MHC-II和SinglecF的表达情况可分别鉴定巨噬细胞和树突状细胞。在Cd11c低表达群体中，可根据CD3/CD19和MHC-II的表达情况分别鉴定T细胞和B细胞。在其余细胞中，可通过其 Cd11b 或 Ly-6G 标记物的表达分别鉴定嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。也可加入计数微球，通过比较微球事件与细胞事件的比例，确定不同细胞群体的绝对细胞数量，例如在未处理动物与 LPS 刺激动物之间的比较。收集支气管肺泡灌洗液（BAL 液）后，还可进行其他技术操作，如 ELISA、免疫印迹、细胞因子微球阵列等，以进一步探究 BAL 液中无细胞成分的相关问题。该技术建立后，为免疫学领域的研究人员探索小鼠肺腔内的细胞及非细胞成分开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何高效且可重复地进行支气管肺泡灌洗（BAL）。

bronchoalveolar-lavage-murine-lungs-to-analyze-inflammatory-cell

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

支气管肺泡灌洗小鼠肺分析炎症细胞浸润

重复测量啮齿类动物呼吸生理参数并采集气道炎症细胞是理想的研究手段，但通常难以实现。本文介绍一种可重复的小鼠经口插管方法，该方法允许对气道高反应性进行多次测量，并可重复采集气道炎症细胞。...

一种可逆、非侵入性的小鼠气道阻力测量与支气管肺泡灌洗液采集方法

我们通过气管途径，展示了一种将待测物质非手术递送至麻醉小鼠肺部的方法。该方法可使肺部暴露于细菌和病毒病原体、细胞因子、抗体、微珠、化学物质或染料中。我们进一步描述了肺组织及肺引流淋巴结（LDLNs）的采集与处理，以用于流式细胞术分析。...

小鼠非手术气管内灌注及通过流式细胞术分析肺组织和肺引流淋巴结

来源： Venuprasad, K., 等 经气管给药 流感嗜血杆菌 在小鼠模型中研究气道炎症。 视频实验杂志 (2016)本视频展示了从感染了无荚膜型细菌的安乐死小鼠中收集和处理支气管肺泡灌洗液的过程 流感嗜血杆菌...

从小鼠模型中采集感染非分型流感嗜血杆菌后的支气管肺泡灌洗液 流感嗜血杆菌

本视频展示了如何使用流式细胞术鉴定和计数支气管肺泡灌洗液中的多种免疫细胞。首先，利用活细胞染料识别单个免疫细胞，随后对表面标志蛋白进行差异化染色，从而实现对每种细胞类型的精确定量。...

通过流式细胞术鉴定和计数支气管肺泡灌洗液中的免疫细胞

本视频展示了一种用于鉴定小鼠肺组织中定居免疫细胞的体外技术。从小鼠肺组织中分离目标免疫细胞后，使用针对天然免疫和适应性免疫细胞特定标志物的荧光标记抗体混合物对细胞表面进行标记。此外，还利用一种细胞内标志物对单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞进行标记。随后通过流式细胞术鉴定各类免疫细胞类型。...

一种体外鉴定小鼠肺部固有和适应性免疫细胞的方法

宿主对病原体感染的免疫反应是一个受到严密调控的过程。利用小鼠脂多糖肺暴露模型，可对与疾病发病机制相关的复杂机制进行高分辨率评估。...

利用经口咽气管内给予PAMP及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

我们介绍了一种通过雾化吸入脂多糖激发中性粒细胞性肺部炎症以模拟急性肺损伤的方法。此外，还描述了肺隔离、气管插管和支气管肺泡灌洗的基本外科技术。...

使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

文献中已描述了多种在小鼠中建立细菌性肺炎模型的方法。本文介绍一种非侵入性、低成本且快速的方法，通过将细菌接种物滴加至口咽部，使其吸入（即，经气道吸入）以诱导肺炎。同时详细阐述了用于评估肺部固有免疫反应的后续检测方法。...

一种用于小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的非侵入性且技术简便的方法

经臭氧与细菌内毒素联合暴露的小鼠表现出广泛的细胞死亡，包括中性粒细胞的死亡。我们观察到细胞发生多种适应性变化，例如细胞骨架片状伪足结构的破坏、支气管肺泡灌洗液中复合体V...

可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化

本研究中，我们提供了一种高效且可重复的小鼠呼吸系统免疫细胞群体分离方案。同时，我们还介绍了一种利用基于9色流式细胞术的检测...

小鼠肺组织中固有和适应性免疫细胞鉴定的流式细胞术分析

本文介绍了使用无创实时全身体积描记法（WBP）系统测量咳嗽的方法，以及小鼠组织样本采集的标准操作流程，并概述了一些评估气道炎症的方法。...

检测小鼠咳嗽和气道炎症的方法

学习支气管肺泡灌洗技术用于小鼠肺部免疫学研究，通过流式细胞术分析巨噬细胞、T细胞、B细胞等炎症细胞浸润情况。该方法简单高效，无需特殊设备即可评估呼吸系统健康与疾病状态。

小鼠肺部支气管肺泡灌洗以分析炎性细胞浸润

探索更多视频