Name: 使用3D生物印刷创建心脏组织展示球体的机械整合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: 了解无生物材料3D生物打印心脏组织的方法，利用心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞形成自发性搏动球体，构建具有机械整合功能的心脏补片，为心脏组织再生和心脏病研究提供新模型。

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作者感谢以下资助来源：心血管研究 Magic That Matters 基金和马里兰干细胞研究基金（2016-MSCRFI-2735）。

1. 心肌细胞的制备
<ol>
	<li>按照已描述的方法10，在包被有基底膜基质的6孔板上培养人诱导性多能干细胞（hiPSCs）。</li>
	<li>采用先前所述方法11,12将hiPSCs分化为hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）。</li>
	<li>分化后第19天，每孔加入2 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA，在室温下作用5分钟，以分离心肌细胞。</li>
	<li>在光学显微镜下观察心肌细胞，监测细胞解离情况。</li>
	<li>加入2 mL 0.0125%胰蛋白酶抑制剂以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>收集分离的心肌细胞，并使用电动移液器将其转移至一个50 mL锥形离心管中。</li>
	<li>将细胞悬液在室温下以250 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。</li>
	<li>用5 mL添加了B-27的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基（RPMI/B-27细胞培养基）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>取20 µL细胞悬液，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液进行染色。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对细胞悬液进行计数，获得细胞浓度和细胞活力。</li>
</ol>
2. 成纤维细胞的制备
<ol>
	<li>启动人源心肌成纤维细胞（HCF）（成年心室型）细胞系13。</li>
	<li>根据HCF培养方案进行传代和分离13。</li>
	<li>用移液器吸取20 µL含细胞的培养基，并加入等体积的0.4%台盼蓝溶液进行染色。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对新制备的细胞悬液进行计数，获得细胞浓度和细胞活力。</li>
</ol>
3. 内皮细胞的制备
<ol>
	<li>按照文献14所述方法启动人脐静脉内皮细胞（HUVEC）系，并根据文献14所述的HUVEC培养方案进行传代和分离。</li>
	<li>用移液器吸取20 µL含细胞的培养基，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液进行染色。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对细胞悬液进行计数，获得细胞浓度和细胞活力。</li>
</ol>
4. 共培养：
<ol>
	<li>将三种细胞类型（hiPSC-CM、HCFs 和 HUVECs）混合于 RPMI/B-27 细胞培养基中，在 50 mL 锥形管中制备混合细胞悬液，细胞比例为 hiPSC-CM:HCF:HUVEC = 70:15:15，细胞浓度为每毫升 165,000 个细胞。</li>
	<li>使用多通道移液器将混合细胞悬液以每孔 200 µL（即每孔 33,000 个细胞）分配至超低吸附 96 孔圆底板中。</li>
	<li>将 96 孔板置于 37°C、5% 二氧化碳、95% 湿度条件下培养 3 天。</li>
	<li>在光学显微镜下观察各孔底部中央是否存在混合细胞多细胞球体。 
	注意：在二维显微投影中，这些球体呈圆形（图 1）。细胞接种至超低吸附 96 孔板后 24 小时内应形成球体，48 小时内应开始搏动。未出现搏动的球体不应用于 3D 生物打印，以确保最终生成的 3D 生物打印心肌补片具有功能活性。可对球体进行连接蛋白 43（Cx43）和肌钙蛋白的免疫荧光染色，以评估球体的细胞组成与质量15。</li>
</ol>
5. 无支架心脏组织的3D生物打印
<ol>
	<li>将含有球状体的培养板装入无支架球状体三维生物打印机的载片架中。</li>
	<li>开启三维生物打印机，并运行三维生物打印软件。
	<ol>
		<li>依次点击 &#34;Auxillary&#34;、&#34;Operation Preparation&#34;、&#34;Inspect Mode&#34;，然后点击 &#34;Home Return&#34;。</li>
		<li>点击 &#34;Start&#34; 下方的绿色图标，开始球状体检测。</li>
		<li>观察屏幕上 &#34;(2) Dia (µm)&#34; 列下显示的球状体直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为估算最接近的100 µm的平均球状体直径，点击 &#34;Initial settings&#34;，并将平均球状体直径输入至 Stack Z pitch (µm) 中。</li>
	<li>点击 &#34;Total&#34;，&#34;Layers&#34; 下的数值应自动重新调整。点击 &#34;Apply&#34; 以确认设置。</li>
	<li>点击 &#34;Needle Array Map&#34;，进入 &#34;Layer No.&#34;，选择所需的三维生物打印层，并通过选择单个球状体位置，在屏幕左侧的地图上绘制所需的三维生物打印设计。点击 &#34;Apply&#34; 以确认三维生物打印设计。</li>
	<li>点击 &#34;Needle Array Check&#34; 开始针阵列检测。若针阵列失焦，请在 &#34;OffsetZ (µm)&#34; 中输入0至500 µm之间的数值以调整相机焦距，建议从500 µm开始，每次递减100 µm直至0 µm。</li>
	<li>点击 &#34;Inspection Parameters&#34;、&#34;Type 1&#34;，并设置 &#34;Diameter (µm)&#34; 为所需的直径范围。将 &#34;Roundness (%)&#34; 和 &#34;Smoothness (%)&#34; 设置为所需的百分比值。点击 &#34;Apply&#34; 以确认设置。 
	注：此处球状体直径设置为450 µm至550 µm。&#34;Roundness (%)&#34; 和 &#34;Smoothness (%)&#34; 是计算机对每个单独球状体的评估参数。此处 &#34;Roundness (%)&#34; 设置为60%，&#34;Smoothness (%)&#34; 设置为70%。</li>
	<li>点击 &#34;Presence&#34;，并将 &#34;Diameter (µm)&#34; 更新为与上一步相同的设置。点击 &#34;Apply&#34; 以确认设置。</li>
	<li>点击 &#34;Stack Mode&#34;，然后点击 &#34;Start&#34; 下方的绿色图标，启动三维生物打印机喷嘴通过真空吸力拾取球状体，并将其精确放置于针阵列中的指定位置。 
	注：对于由81个球状体（9×9）组成的 cardiac patch，三维生物打印过程大约需要20至30分钟。</li>
	<li>打印完成后，使用无菌镊子夹取含有三维生物打印组织片的针阵列，转移至盛有150 mL RPMI/B-27 细胞培养基的250 mL无菌烧杯中。</li>
	<li>将带有针阵列的三维生物打印组织片在37°C、5%二氧化碳、95%湿度条件下孵育3天。</li>
</ol>
6. 从针阵中取出3D生物打印补片及补片成熟
<ol>
	<li>孵育 3 天后，一手握住针阵列的底部，另一手放在补片下方的塑料盖上，轻轻向上滑动塑料盖，将 3D 生物打印补片从针阵列上取下。 
	注意：如有需要，可在执行此步骤前用磷酸盐缓冲液（PBS）对针进行润滑，以便更顺畅、更容易地取下。</li>
	<li>使用无菌镊子夹起带有 3D 生物打印补片的塑料盖，将补片和塑料盖一起转移至含有 RPMI/B-27 细胞培养基的 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>用镊子夹住塑料盖，在 RPMI/B-27 细胞培养基中轻轻晃动带有补片的塑料盖，使补片脱离并释放到培养基中。</li>
	<li>在光学显微镜下检查 3D 生物打印补片，观察其是否跳动，以确认该 3D 生物打印补片具有功能。</li>
	<li>将 3D 生物打印补片置于 35 mm 培养皿中继续孵育 3 天或更长时间（37°C，5% 二氧化碳，95% 湿度）。 
	注意：3 天后，球状体将融合在一起，补片中原本针穿过的孔洞应不再可见。</li>
</ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用能够搏动的功能性球状体进行3D生物打印至关重要。如果球状体无法搏动，继续使用将 invariably 导致打印出的3D生物补片无功能。
这种方法的一个优点是可以通过改变类球体中心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的总数量及所占百分比，来调控贴片的细胞组成。这使得能够打印出具有不同组织学特性和力学性能的多种类型心脏贴片。
该方法还可用于制备包含不同类型球状体的补片，并可实现具有复杂三维结构的心脏补片的3D生物打印。通过3D生物打印实现精确的球状体定位，可构建出结构复杂的最终三维结构，而通过轻柔旋转悬浮的球状体7或将球状体简单模压成圆柱形三维结构16则难以达到此种复杂程度。
该方法的局限性在于，由于针阵列中针之间的距离固定为400 µm，所形成的球状体直径相对固定，介于450至550 µm之间；此外，若球状体直径过大，可能导致细胞活力下降。补片在从针阵列取出后机械强度较弱，但随着培养...

3D 生物打印有多种不同的方法1,2,3。3D 生物打印通常根据打印技术进行分类1，例如喷墨生物打印、微挤出生物打印、激光辅助生物打印、多种方法的组合或更新的技术方法。3D 生物打印也可分为无支架法和依赖支架法4。大多数3D生物打印方法属于依赖支架法，需要使用生物材料，例如 生物墨水5 或支架材料6。然而，依赖支架的3D生物打印面临诸多问题和局限性4,7，例如支架材料的免疫原性、专有生物墨水的成本高昂、打印速度慢以及降解产物的毒性等。
已有研究尝试采用球状体进行无支架心脏组织工程8，以克服依赖支架的组织工程技术存在的上述缺点。然而，正如该论文作者所指出的，在生物制造过程中，稳定地操作和将球状体精确定位于固定位置仍存在困难。结合使用3D生物打印与基于球状体的组织工程技术有望克服这些难题。在本方案中，我们描述了一种仅使用球状体形式的细胞、不添加其他生物材料的3D生物打印心脏组织的方法。
无支架类球体三维生物打印技术9能够利用真空负压吸取单个类球体，并将其精确定位于针阵列上。这种在三维生物打印中将类球体定位在针阵列上的构想，灵感来源于日本传统插花艺术“生花”（ikebana）中使用的针阵列（称为&#34;kenzan&#34;）。该系统可实现类球体在任意构型下的精确排布，且各个类球体在短时间内即可融合为一体，形成三维生物打印的组织。因此，该方法使得类球体的操作更加简便，为未来无支架器官生物制造的发展提供了潜在可能。

<table><tbody><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>0.0125% 定义型胰蛋白酶抑制剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 细胞培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>添加 B27 的 RPMI 构成 HIPSC-CM 培养基</td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>添加 B27 的 RPMI 构成 HIPSC-CM 培养基</td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>人源心肌成纤维细胞（成年心室型）</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSurface 超低吸附96孔圆底板&amp;nbsp;</td><td>Akita Sumitomo Bakelite Co.</td><td>MS-9096UZ</td><td></td></tr><tr><td>Regenova Bio 3D 打印机</td><td>Cyfuse Biomedical K.K.</td><td>N/A</td><td>www.cyfusebio.com/en/</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>肌钙蛋白 T 抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>701620</td><td></td></tr><tr><td>连接蛋白 43 (Cx43) 抗体</td><td>Chemicon</td><td>MAB3068</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36935</td><td></td></tr></tbody></table>

利用3d生物打印技术构建表现出类球体机械整合的心脏组织

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

本方案描述了一种无需使用生物材料、仅利用细胞进行心脏组织三维生物打印的方法。首先分离、计数心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，并按所需比例混合。将混合后的细胞接种于超低吸附96孔板的各个孔中进行共培养。3天内可形成跳动的球状体。随后，利用真空负压通过喷嘴吸取这些球状体，并使用三维生物打印机将其组装到针阵列上。球状体在针阵列上进一步融合。三维生物打印3天后，可将完整的心脏组织片取出，该组织片已具备自发跳动能力。三维打印的心脏组织片实现了各组成球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病三维模型方面具有广阔前景。

在步骤 4.4（共培养）结束时，每个孔中的细胞应通过重力作用聚集在超低吸附 96 孔圆底板的底部，形成球状体。这些球状体包含 hiPSC-CM、HCFs 和 HUVECs，可在光学显微镜下进行肉眼观察，其二维投影应呈圆形（图 1）。在步骤 6.3 结束时，3D 生物打印的心脏贴片应存在组织空隙，这是由针阵列穿刺形成的针孔所致（图 2，左图）。此时，球状体之间的边界应变得模糊不清，且贴片应开始自发搏动，表现出球状体之间的机械整合。在步骤 6.5 结束时，组织空隙应被周围组织填充（图 2，右图），同时 3D 生物打印的心脏贴片应持续自发搏动。
<img alt="显示类球体形成的细胞培养显微图像；比例尺为500 μm；实验生物学。" class="xfigimg" src="/f...

本方案描述了无需使用生物材料的三维心脏组织生物打印技术。三维生物打印的心脏补片表现出组分球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病的三维模型方面具有广阔的应用前景。

利用3D生物打印技术构建表现出类球体机械整合的心脏组织

本方案描述了仅使用细胞、无需生物材料的三维心脏组织生物打印技术。心肌细胞、内皮细胞和……

本视频的目的是演示仅使用细胞、不使用生物材料的三维心脏组织生物打印。首先，分离心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，计数后按所需细胞比例混合。然后使用多通道移液器将细胞混合物分配至超低吸附96孔板的各个孔中。将细胞在96孔板中孵育三天，三天后，细胞形成可自发搏动的球状体。共聚焦显微镜显示，在球状体内的肌钙蛋白T阳性心肌细胞中，连接蛋白43呈绿色荧光标记，而心肌细胞本身呈远红荧光标记。随后，将含有球状体的96孔板装入3D生物打印机中。3D生物打印机首先通过移动平台将96孔板转移至针阵列旁边的指定位置。随后，3D生物打印机对96孔板中的所有类球体进行检测，以获取每个类球体的相关数据，例如其直径和形状。此图为3D生物打印过程的放大视图。从左侧96孔板中，喷嘴通过真空负压吸取类球体，并将其放置于右侧针阵中的指定位置。此过程将重复进行，直至完成全部三维生物打印。当所有类球体及96孔板均完成打印后，三维生物打印机将储存已使用完的96孔板，并通过移动平台装载新的96孔板。这是一段延时视频，以100倍速度展示了一个9×9补片的三维生物打印过程的俯视图。针阵列中的针头以成组形式排列，类球体从上方被加载到每根针上。在无菌条件下培养三天后，通过将针阵列中的一块硬质塑料片轻轻向上滑动至补片下方，从而非常小心地将三维生物打印机心脏补片从针阵列上取下。在此步骤中，可根据需要在针上使用磷酸盐缓冲液（PBS）进行润滑，以便更顺利、更容易地完成移除操作。3D 生物打印的心脏补片在从针阵列取出后极为脆弱，因此必须格外小心，以免损坏。随后将 3D 生物打印的心脏补片转移至含有适当细胞培养基的 35 毫米组织培养皿中。刚从针阵列取出时即可观察到补片已开始搏动，且每次搏动时针孔的尺寸均会发生变化。3D生物打印的心脏补片被允许成熟，在此期间，由针阵列引起的组织空隙被周围组织填充。3D生物打印的心脏补片持续自发搏动。综上所述，无需使用生物材料即可实现心脏组织的3D生物打印是可行的。3D生物打印的心脏补片表现出组分球状体的机械整合。心脏组织的3D生物打印在临床应用和心脏组织再生方面具有广阔前景，可用于构建心脏组织的3D模型，实现预测性药理学和毒理学中的复制，并推动细胞和基因定向疗法的开发。

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生物工程

使用3D生物印刷创建心脏组织展示球体的机械整合

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

本方案描述了一种基于网状模具的方法，用于构建具有满意结构完整性和同步搏动行为的三维无支架心肌组织。...

一种基于网状模具的无支架三维心脏组织构建方法

本方案旨在将三维生物打印贴片移植到模拟心力衰竭的小鼠梗死心外膜上。内容包括麻醉、开胸手术、左前降支冠状动脉永久性结扎以及将生物打印贴片应用于心脏梗死区域的详细操作步骤。...

在小鼠心肌梗死模型中移植三维生物打印补片

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本方案旨在通过悬滴共培养细胞来制备三维心脏球状体（CSs）。 将胶原蛋白包埋的CSs用生理浓度的阿霉素（DOX，一种心脏毒性试剂）处理，以建立心力衰竭模型。利用DOX处理的CSs进行体外测试，可用于发现针对心力衰竭患者的新疗法。...

用于研究人类心脏病理生理学的体外生物工程心脏组织——心肌球体

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

本文介绍了一种利用自动化移液系统接种细胞悬液，实现脂肪来源基质/干细胞（ASC）球体大规模生产的方法，从而确保球体大小和形状的均一性。这些ASC球体可作为三维生物打印技术的构建单元。...

大规模自动化生产脂肪源性干细胞球用于3D生物打印

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外...

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

了解无生物材料3D生物打印心脏组织的方法，利用心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞形成自发性搏动球体，构建具有机械整合功能的心脏补片，为心脏组织再生和心脏病研究提供新模型。

利用3D生物打印技术构建表现出类球体机械整合的心脏组织

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