利用3D生物打印技术构建表现出类球体机械整合的心脏组织
2017年7月2日
本方案描述了无需使用生物材料的三维心脏组织生物打印技术。三维生物打印的心脏补片表现出组分球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病的三维模型方面具有广阔的应用前景。
本视频的目的是演示仅使用细胞、不使用生物材料的三维心脏组织生物打印技术。首先，分离心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，计数后按所需细胞比例混合。然后使用多通道移液器将细胞混合物分配至超低吸附96孔板的各个孔中。
将96孔板中的细胞孵育三天后，这些细胞会形成能够自发搏动的球状体。共聚焦显微镜显示，在球状体内部，肌钙蛋白T阳性的心肌细胞中，连接蛋白43呈绿色荧光标记，而心肌细胞本身则呈远红荧光标记。随后，将含有球状体的96孔板载入3D生物打印机中。
3D 生物打印机首先通过移动平台将96孔板转移至针阵列旁边的位置。随后，3D 生物打印机检测96孔板中所有类球体，以获取每个类球体的相关数据，例如其直径和形状。这是3D生物打印过程的放大视图。
通过真空吸力，喷嘴从左侧的96孔板中拾取球状体，并将其放置到右侧针阵列的特定位置。此过程重复进行，直至完成三维生物打印。当所有球状体和96孔板均完成生物打印后，三维生物打印机将储存已用完的96孔板，并通过移动平台装载新的96孔板。
这是一段延时视频，以100倍速度展示了九乘九补片的三维生物打印过程的俯视图。针阵列中的针以成组形式排列，类球体从上方被加载到每根针上。在无菌条件下培养三天后，通过将针阵列中的硬质塑料片轻轻向上滑入补片下方，极其小心地将三维生物打印的心脏补片从针阵列上取下。在此过程中，可根据需要向针上滴加磷酸盐缓冲液（PBS），以利于更顺畅、更容易地完成取下操作。
3D 生物打印的心脏补片在从针阵列取出后非常脆弱，因此必须格外小心，以免损坏。随后将 3D 生物打印的心脏补片转移至含有适当细胞培养基的 35 毫米组织培养皿中。刚从针阵列取出时即可观察到补片已开始搏动，且每次搏动时针孔的尺寸均会发生变化。
3D生物打印的心脏补片在成熟过程中，由针阵列造成的组织空隙会被周围组织填充。3D生物打印的心脏补片可持续自发搏动。综上所述，无需使用生物材料即可实现心脏组织的3D生物打印是可行的。
3D生物打印的心脏补片表现出组分球状体的机械整合。心脏组织的3D生物打印在临床应用和心脏组织再生方面具有广阔前景，可用于构建心脏组织的3D模型，实现预测性药理学和毒理学中的复制，并推动细胞和基因定向疗法的开发。
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概述
本方案描述了仅使用细胞、无需生物材料的心肌组织三维生物打印技术。所获得的心肌补片表现出良好的机械整合性，在心肌组织再生及心脏疾病模型构建方面具有广阔的应用前景。
关键研究组成部分
科学领域
- 三维生物打印
- 心脏组织工程
- 再生医学
背景
- 心脏组织再生对于治疗心脏病至关重要。
- 传统方法通常依赖生物材料，这可能会限制组织整合。
- 仅使用细胞可能增强生物打印组织的功能性。
- 理解细胞间的相互作用是实现成功组织工程的关键。
研究目的
- 开发一种无需生物材料的三维生物打印心肌组织的方法。
- 评估生物打印心肌补片的机械整合性。
- 建立用于研究心脏病的模型。
使用的方法
- 心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的分离与计数。
- 按所需比例混合细胞，并将其分配至超低吸附96孔板中。
- 培养细胞以形成可自发搏动的球状体。
- 利用共聚焦显微镜评估细胞的表达与整合情况。
主要结果
- 由混合细胞形成的球状体表现出自发性搏动。
- 共聚焦显微镜证实了心肌细胞中关键蛋白的表达。
- 3D生物打印机成功将球状体整合为心肌补片。
- 已证实补片的机械整合性。
结论
- 无需生物材料的3D生物打印是可行且有效的。
- 该方法在心脏组织再生方面具有应用潜力。
- 该技术可作为心脏病研究的有价值模型。
常见问题
行业重要性概述
该方法实现了无生物材料的三维生物打印功能性心肌组织，为临床前疾病建模和再生医学提供了一种可扩展的、用于生成机械整合组织片的方法。通过仅使用细胞，减少了外源性支架带来的变异性，并提高了药物反应和毒性测试中的生理相关性。所获得的可自发搏动的组织片可支持心血管药物研发早期阶段的靶点验证和机制性风险评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究心肌组织形成与功能中的多细胞相互作用。
- 操作价值：提供可重复的平台，用于评估化合物对心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞整合网络的影响。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成可搏动的心脏类球体，这些类球体可融合成机械整合的组织片层，从而实现对收缩功能的检测。
- 操作价值：通过生物打印实现类球体的精确定位，有助于组织结构的标准化，提高检测的一致性。
转化与临床前研究
- 科学价值：构建与疾病相关的三维心肌组织模型，用于研究病理生理机制及治疗反应。
- 操作价值：支持生物打印补片在体外培养中的成熟，便于对组织整合性与稳定性进行长期评估。
流程与工作流整合
该工作流程将类球体生成与生物打印作为早期发现与临床前验证之间的桥梁，能够构建复杂的 cardiac 组织，用于后续功能评估。
- Discovery Biology：在定义明确的多细胞系统中，支持细胞间相互作用及组织水平机械整合的假设验证。
- Screening：提供标准化的搏动性心肌组织片，具有可量化的收缩活性，适用于化合物筛选。
- Analytics：通过成像和功能性读数，实现对自发搏动及结构整合的测量。
- Translational Research：提供从球形体形成到成熟组织片的连续过程，模拟发育及疾病相关组织重塑。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的生物打印流程，用于生成针对多种靶点和适应症的心肌组织模型。
运营与企业影响
- 科学价值：通过模拟类似天然的心脏组织力学特性和细胞整合，提高预测的可信度。
- 操作价值：消除与生物材料相关的变异性，提升不同实验和实验场所间结果的可重复性。
- 战略价值：在与人类相关的系统中实现对心脏毒性或治疗效应的早期检测，降低后期研发失败的风险。
- 项目组合影响：通过提高模型保真度和数据的可转化性，为心血管项目中的风险调整决策提供依据。
实施注意事项
- 需要具备原代细胞分离、类球体培养和三维生物打印设备操作的专业技术。
- 依赖于具备真空吸附功能且兼容针阵列的生物打印机的可及性。
- 需要标准化的细胞混合比例以及超低吸附培养板，以确保类球体形成的稳定性。
- 涉及成熟时间及培养基条件的优化，以促进功能性组织的发育。
- 受限于当前生物打印贴片的尺寸规模，以及因结构脆弱而在打印后需谨慎操作的必要性。
