Name: 受肥胖相关炎症组织的巨噬细胞的分离、鉴定和纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习从饮食诱导炎症组织（如肝脏）中分离和鉴定组织驻留巨噬细胞的方法。该优化方案可高效获取单细胞悬液，用于研究肥胖相关慢性炎症中的巨噬细胞表型及其在免疫学中的作用。

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我们感谢宾夕法尼亚州立大学千年科学中心流式细胞术核心设施的支持。

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作者无利益冲突需要披露。

饮食诱导的代谢紊乱模型被广泛用于模拟动脉粥样硬化、单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎和2型糖尿病等共病，以更好地理解疾病进展背后的分子机制。依赖胶原酶的消化方法常用于解离组织，从而将细胞从细胞外基质（ECM）中释放出来16,27。胶原酶等酶类可破坏为邻近细胞提供结构支持的胶原蛋白。组织的结构组成决定了组织基质的硬度（即抵抗形变的能力），并影响哪种粗制胶原酶产品在有效破坏ECM方面最为高效28。白色脂肪组织（WAT）由&#34;软基质&#34;构成，通常使用II型胶原酶进行消化，以释放脂肪细胞和常驻免疫细胞，同时维持细胞表面胰岛素受体的完整性29。主动脉纤维成分的微观结构促成了&#34;硬基质&#34;特性，因此常联合使用具有最高胶原酶活性的XI型胶原酶及其他辅助酶类，以实现有效的主动脉消化。与主动脉不同，肝脏消化则采用酶活性较弱的IV型胶原酶来破坏基质，并释放具有活性的实质和非实质细胞30</sup...

小鼠模型已被广泛用于研究人类疾病的动态过程。从处于疾病状态的小鼠中正确分离组织驻留细胞，可为理解疾病发病机制中的分子和细胞贡献提供平台1。其中一种至关重要的疾病是肥胖症。肥胖症的发病率在全球范围内持续上升，同时伴随胰岛素抵抗、2型糖尿病、心血管疾病和脂肪肝病的发生2,3。过量的营养摄入与体力活动减少共同作用，引发脂肪组织发出异常信号，进而改变其他外周组织（如主动脉和肝脏）的细胞微环境4。这种代谢稳态的破坏导致慢性低度全身性炎症5。
已发现，主动脉和肝脏中常驻巨噬细胞的经典活化及其向白色脂肪组织（WAT）的募集，不仅会引发代谢信号的失调，还会持续促进炎症反应6,7。巨噬细胞在表型和功能上的异质性与肥胖相关共病的发生机制密切相关7。巨噬细胞极化具有动态可塑性，使其能够表现出多种活化表型，从而协调炎症的发生与消退过程8。经典活化的（M1）巨噬细胞参与炎症的延续，而替代性活化的（M2）巨噬细胞则与炎症消退及组织修复相关9,10。
当机体经历代谢应激时，白色脂肪组织会异常积聚。扩张的脂肪组织会募集并滞留炎性细胞，这些细胞显著改变正常脂肪细胞的功能，促进胰岛素抵抗、高血糖，最终导致2型糖尿病、胰岛素抵抗或高血糖11,12。与此同时，白色脂肪组织会响应浸润的、经典活化的（M1型）脂肪组织巨噬细胞（ATMs）所释放的炎症信号而发生重塑13,14。这一多细胞器官会释放一系列信号，破坏其他器官（如主动脉和肝脏）的正常功能4。
肝脏是一个代谢中枢器官，能够响应来自邻近功能失调的白色脂肪组织（WAT）的刺激而发生适应性变化15。肝内巨噬细胞（即库普弗细胞）在代谢变化的刺激下，会分泌促炎性细胞因子，从而改变实质性和非实质性肝细胞的表型，并促进组织重塑。肝脏脂质积聚、炎症反应、过量的细胞外基质沉积、坏死以及最终的功能丧失，均继发于持续的炎症损伤，这些病理变化共同构成了非酒精性脂肪性肝病相关的广泛肝损伤谱系16,17,18。
在机体经历慢性代谢应激的过程中，伴随着白色脂肪组织（WAT）和肝脏功能的受损，大动脉的动脉壁内会积聚脂质19。动脉内脂质积聚会触发活化的内皮细胞分泌趋化因子，并继而导致单核细胞的募集20。一旦被募集，单核细胞即增殖、分化，摄取脂蛋白并转化为泡沫细胞。动脉粥样硬化病变的启动和维持由募集的单核细胞来源巨噬细胞以及组织驻留的脂质负荷巨噬细胞所介导的促炎活性驱动。在这一致动脉粥样硬化微环境中传递的胞外和胞内应激信号作用下，这些巨噬细胞进而启动凋亡信号级联反应。当这些泡沫细胞死亡时，其富含脂质的内容物被释放至病变的坏死核心，最终导致斑块破裂、心肌梗死和脑卒中。
巨噬细胞表型的异质性在一定程度上调控了由脂肪组织（WAT）、肝脏和主动脉等失调组织中炎症变化所引发的肥胖8,21。对募集型和组织驻留型巨噬细胞进行表征，有助于揭示可调控巨噬细胞表型的潜在分子靶点1。为了有效表征肥胖诱导的炎症组织中的巨噬细胞，可通过酶消化法获得单细胞悬液。此类解离方案必须能够充分降解结缔组织，同时最大限度减少免疫细胞死亡，并获得理想的细胞得率。所用酶混合物的选择取决于组织类型及其结构组成。相较于肝脏和WAT，主动脉等结构较坚韧的组织需要更强的酶活性才能实现有效解离。从单细胞悬液中，可明确表征或分离组织驻留型巨噬细胞，用于后续分析，如转录谱分析。
本文介绍了一种组织特异性方案，该方案利用胶原酶依赖性组织消化和多色流式细胞术，有效分离并表征来自传统饮食诱导的肥胖、动脉粥样硬化、单纯性脂肪变性和脂肪性肝炎小鼠模型中的组织驻留型巨噬细胞。通常使用针对白细胞（CD45 和/或 CD11b）及巨噬细胞（F4/80）特异性抗原的抗体对细胞表面标志物进行同时染色，以鉴定巨噬细胞群体22。荧光激活细胞分选（FACS）是一种强大策略，可用于高纯度地分选已鉴定的细胞群体。随后可通过下游分子分析（如定量实时聚合酶链式反应）对分选后的细胞群体进行表型特异性基因表达谱的评估23。尽管标准流式细胞术及基于流式细胞术的细胞分选技术在区分高度异质性细胞悬液中的巨噬细胞方面非常有效，但仍需对早期方案进行优化，以确保获得成功的实验结果。本研究描述了可有效分离和表征具有活性的组织特异性巨噬细胞的实验方案；更重要的是，本研究深入探讨了实验中常遇到的技术问题，并提供了预防和解决这些问题的前瞻性策略及故障排除方法。

<table><tbody><tr><td>26 G × 5/8 英寸针头</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G × 0.75 英寸针头 × 12 英寸管路血液采集套装</td><td>BD</td><td>367297</td><td>用于肝脏灌注过程中下腔静脉的插管</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 英寸针头</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>带橡胶塞的 1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/32 Fc 封闭抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE 大鼠 IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 叙利亚仓鼠 IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 大鼠 IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue 大鼠 IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微型离心管&amp;nbsp;</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛水溶液 -16×</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪刀，3.5 英寸，直头，23 mm，锋利&amp;nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>用于常规解剖操作</td></tr><tr><td>微型镊子，4 英寸，全弯，0.8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&amp;nbsp;</td><td>用于常规解剖操作</td></tr><tr><td>弹簧解剖剪刀 &amp;ndash; 3 mm 刃口&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-10</td><td>用于主动脉解剖步骤 1.3.3.17 至 1.3.3.28</td></tr><tr><td>弯曲尖端 0.07 mm × 0.04&amp;nbsp;mm 镊子</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>用于主动脉解剖步骤 1.3.3.17 至 1.3.3.28</td></tr><tr><td>止血钳（弯型）</td><td>Fine Science Tool</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养/培养皿</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯培养皿（10 cm）带盖</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管（聚丙烯）</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管&amp;nbsp;（聚丙烯）</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（库存变性乙醇，无水）</td><td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>XI 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>I 型透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 烧杯&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm 止血夹</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m 一次性滤器</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵钾（ACK）</td><td>ThermoFischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>剃刀（0.22 mm（0.009&quot;））</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red 活/死细胞染色试剂</td><td></td><td></td><td>红色活力染料（见 &lt;strong&gt;图 1A&lt;/strong&gt;）</td></tr></tbody></table>

从受肥胖相关炎症影响的组织中分离、表征与纯化巨噬细胞

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

肥胖会促进一种慢性炎症状态，这种状态主要由组织驻留型巨噬细胞以及单核细胞来源的巨噬细胞介导。饮食诱导的肥胖（DIO）是研究巨噬细胞异质性作用的有价值模型；然而，从炎症组织中获得足够数量的巨噬细胞分离物十分困难。在本方案中，我们概述了基于我们研究所得的分离步骤及必要的故障排除指南，用于在小鼠接受18周高脂（HFD）或高脂/高胆固醇（HFHCD）饮食干预后，获取合适的组织驻留型巨噬细胞群体。本方案聚焦于肥胖与动脉粥样硬化研究中的三个标志性组织：肝脏、白色脂肪组织（WAT）和主动脉。我们强调了流式细胞术的双重应用如何实现对组织驻留型巨噬细胞的分离与表征的新维度。本方案的一个基础部分阐述了组织特异性酶消化与巨噬细胞分离的复杂细节，以及后续用于流式细胞分析的细胞表面抗体染色。本方案还针对荧光激活细胞分选（FACS）中存在的现有复杂性问题进行了说明，并提供了解析，以便从充分分选的细胞群体中获得广泛范围的表征结果。此外，方案中包含了用于细胞分选的替代富集方法，例如针对致密肝脏组织的方法，从而在使用FACS时提高灵活性并优化时间管理。简而言之，本方案有助于研究人员在特定研究中评估多种炎症组织中的巨噬细胞异质性，并提供了已被证实有效的故障排除建议，以实现DIO介导炎症中免疫细胞的高效分离与表征。

使用载脂蛋白E缺陷型（ApoE KO）C57BL/6（BL6）小鼠，喂饲高脂高胆固醇饮食（HCHFD或HCD）18周后，当合并两个样本时，可分离得到1 × 104 - 2 × 104个CD45+F4/80+主动脉巨噬细胞。从喂饲HFHCD的ApoE KO小鼠中分离的肝脏可获得超过5 × 105个分选的库普弗细胞（具体数量取决于可用的分选时间）。使用喂饲高脂饮食（HFD）的野生型（WT）C57BL/6小鼠时，可从基质血管组分（SVF）中分选5 × 105至1 × 106个驻留型脂肪组织巨噬细胞（ATMs）。上述从特定组织中可分选获得的巨噬细胞总数足以用于通过定量实时聚合酶链式反应（qPCR）进行基因表达分析。对于巨噬细胞群体回收数量较少的组织（如主动脉），建议在需要提取RNA进行此类分析时使用共沉淀剂（例如糖原）并进行过夜沉淀。
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本方案可使研究人员分离并鉴定从饮食诱导的代谢紊乱模型中提取的各种典型炎症组织中的组织驻留巨噬细胞。

肥胖可促进一种慢性炎症状态，这种状态主要由组织驻留巨噬细胞以及单核细胞来源的巨噬细胞介导。

本实验的总体目标是从饮食诱导炎症常累及的组织（如肝脏）中有效分离并鉴定巨噬细胞。该方法有助于解答免疫学与炎症研究领域中的关键问题，即组织驻留型巨噬细胞表型如何决定慢性炎症性疾病的进展过程。该方法的主要优势在于优化了从肥胖介导的低度慢性炎症影响的组织中获取单细胞悬液所需的分离步骤。进行该操作演示的是我实验室的研究生 Joselyn Allen。分离肝脏时，首先将经乙醇浸泡的小鼠仰卧固定于聚苯乙烯泡沫解剖板上，并固定其前肢和后肢。接着，用中号尖头镊子夹住尿道口附近的腹部皮肤，用锋利的解剖剪在提起的皮肤上剪开一个小切口。将剪刀的下刃插入皮肤与腹膜之间的切口，从腹股沟向下巴方向做一侧向切口。轻柔地向后牵拉皮肤，暴露完整的腹膜腔和胸壁，然后通过腹膜做一侧向切口。抬起胸骨，小心切开膈肌。然后将胃肠道器官移至一侧，找到肝下腔静脉（IVC）。使用止血钳夹闭肝上腔静脉，以维持局部灌注，并将装有预热灌注缓冲液的注射器连接至23号血液采集和输注装置。轻轻推动注射器推杆，使灌注缓冲液充满管路和针头，然后将针头平行插入肝下腔静脉。正确插管下腔静脉可确保解离缓冲液在肝脏及外周组织中均匀分布，从而优化组织消化效果。使用4厘米止血钳固定针头位置，轻压注射器推杆以开始灌注。若针头位置正确，肝脏颜色将迅速变浅，肝叶随之肿胀。立即剪开门静脉，使灌注缓冲液能够自由流经肝脏，期间偶尔用拇指和食指轻轻按摩肝叶，以促进血液排出。当剩余灌注缓冲液仅约5毫升时，将灌注缓冲液注射器更换为装有预热解离缓冲液的注射器，继续轻柔按摩肝叶并灌注肝脏，直至肝脏完全消化。通过用镊子的钝端轻轻按压左侧肝叶来确认消化是否成功。表面应出现一个压痕，移除镊子后该压痕会缓慢回填。随后移除针头，使用解剖剪的一片短直刀刃小心切断连接韧带，以完整切除肝脏和胆囊。将肝脏转移至含有10毫升冰冻DMEM的10厘米培养皿中，并用齿状镊夹住已切断的肝上腔静脉（IVC）。使用中号镊子，对每个肝叶进行快速划动，以使细胞从格利森囊（Glisson's Capsule）中释放，并将饱和的DMEM通过置于冰上的50毫升锥形管中的70微米细胞筛网。只有将肝细胞从格利森囊中充分解离，才能获得高产量的活细胞。当所有细胞收集完毕后，倒置试管轻轻混匀细胞悬液，并通过离心沉淀细胞。将上清液转移至新的50毫升锥形管中，再进行三次低速离心。最后一次离心后，将上清液转移至新的50毫升离心管中，并以较高速度再次离心细胞。随后，用FACS缓冲液重悬非实质细胞沉淀，进行细胞计数，并根据后续实验应用，将肝细胞稀释至适当浓度，分装至标记的5毫升圆底聚苯乙烯管中。食用高脂饮食或高脂高胆固醇饮食的小鼠，其主动脉等受影响组织中经典活化的M1型巨噬细胞浸润增加。在食用高脂高胆固醇饮食的小鼠中，表达RON受体的主动脉CD45阳性F4/80阳性巨噬细胞（具有抗炎表型）数量减少，而促炎性的CD45阳性F4/80阳性CD11c阳性巨噬细胞在这些动物分离的主动脉中数量增加。此外，从消化后的主动脉中分选得到的表达RON受体的巨噬细胞显示出Arginase 1基因表达升高，该基因是公认的M2型巨噬细胞标志物。事实上，对肝脏驻留巨噬细胞的表征显示，表达 RON 受体的亚群占主导地位，而 CD11c 阳性的促炎性巨噬细胞群体则表现出与抗炎 M2 表型密切相关基因的表达下调。在消化白色脂肪组织中分离出的巨噬细胞群体中也观察到类似趋势，具有促炎表型的巨噬细胞群体表现出 RON 受体表面表达降低。若操作熟练，该技术在正确实施的情况下，每只动物可在 20 至 30 分钟内完成。完成此操作后，可进一步采用流式细胞术、荧光激活细胞分选和/或定量 PCR 等方法，以更深入地表征分离所得肝脏来源的组织驻留巨噬细胞的表型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从病变肝脏中正确分离组织驻留巨噬细胞。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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