受肥胖相关炎症组织的巨噬细胞的分离、鉴定和纯化
2017年4月3日
该协议允许研究员分离和表征组织驻留巨噬细胞在各种标志发炎组织提取从饮食诱发的代谢紊乱模型。
该程序的总体目标是有效地从通常受饮食诱导的炎症影响的组织（如肝脏）中分离和表征巨噬细胞。这种方法可以帮助回答免疫学和炎症领域关于组织驻留巨噬细胞表型如何决定慢性炎症性疾病进展的关键问题。这样做的主要优点是该程序优化了获得来自肥胖介导的低度慢性炎症影响组织的单细胞悬液所需的分离步骤。
演示该程序的是我实验室的研究生 Joselyn Allen。为了隔离肝脏，首先将浸泡乙醇的小鼠仰卧在聚苯乙烯泡沫解剖板上，并固定前爪和后爪。接下来，使用中等尖头镊子抓住尿道口附近的腹部皮肤，并使用锋利的解剖剪刀在凸起的皮肤上切开一个小切口。
将剪刀的下刀片插入皮肤和腹膜之间的切口中，然后从腹股沟到下巴做一个横向切口。轻轻拉回皮肤，露出完整的腹膜腔和胸壁，并在腹膜上做一个侧切口。提起胸骨并小心切开隔膜。
然后将胃肠道器官移至一侧，找到肝下腔静脉或 IVC。使用止血钳夹住肝上 IVC 以保持局部灌注，并将装满预热灌注缓冲液的注射器连接到 23 号采血和输液装置上。轻轻按下柱塞，直到管路和针头充满灌注缓冲液，然后将针头平行插入肝下腔静脉。
IVC 的正确插管可确保解离缓冲液局部分布在整个肝脏和外周组织中，从而优化组织消化。使用 4 厘米的止血夹将针头固定到位，然后轻轻按下柱塞以开始灌注。如果针头位置合适，颜色会迅速从肝脏冲走，叶会变大。
及时切开门静脉，让灌注缓冲液自由流过肝脏，偶尔轻轻按摩拇指和食指之间的肺叶，以利于血液排出。当只剩下 5 毫升灌注缓冲液时，用装满预热解离缓冲液的注射器更换灌注缓冲液注射器，继续轻轻按摩肺叶并灌注肝脏，直至完全消化。通过将一对镊子的钝边缘轻轻压入左外叶来确认消化成功。
表面应出现一个凹痕，一旦镊子被移除，该凹痕就会慢慢填充。然后取下针头，用一把解剖剪刀上的短直刀片小心地切开连接韧带，切除整个肝脏和胆囊。将肝脏转移到装有 10 毫升冰冷 DMEM 的 10 厘米长的培养皿中，并使用齿镊夹住切断的肝上下腔。
使用中等尖镊子，对每个叶进行快速抚摸，以从 Glisson 胶囊中释放细胞，并将饱和的 DMEM 通过冰上 50 毫升锥形管中的 70 微米细胞过滤器。只有将肝细胞与 Glisson's Capsule 正确解离，才能实现活细胞的高产量。收集完所有细胞后，倒置试管以轻轻混合细胞悬液并通过离心沉淀细胞。
将上清液转移到新的 50 mL 锥形管中，再进行 3 次低离心离心。最后一次离心后，将上清液转移至新的 50 mL 试管中，并以更高的速度再次离心细胞。然后将非实质细胞沉淀重悬于 FACS 缓冲液中进行计数，并根据其下游应用在标记的 5 毫升圆底聚苯乙烯管中将肝细胞稀释至适当的浓度。
喂食高脂肪饮食或高脂肪高胆固醇饮食的小鼠在受影响组织（如主动脉）中表现出经典激活的 M1 巨噬细胞浸润增加。表达 RON 受体的主动脉 CD45 阳性 F4/80 阳性巨噬细胞表现出抗炎表型，在高脂肪、高胆固醇饮食喂养的小鼠中减少，而促炎 CD45 阳性 F4/80 阳性 CD11c 阳性巨噬细胞在从这些动物分离的主动脉中发现数量增加。此外，来自消化主动脉的分选表达 RON 受体的巨噬细胞显示精氨酸酶 1 基因的表达增加，精氨酸酶 1 基因是一种公认的 M2 巨噬细胞标志物。
事实上，肝脏驻留巨噬细胞的表征揭示了表达 RON 受体的亚群的普遍表型，其中 CD11c 阳性促炎巨噬细胞群体表现出与抗炎性 M2 表型密切相关的基因表达降低。在从消化的白色脂肪组织中分离的巨噬细胞群中观察到类似的趋势，促炎表型巨噬细胞群表现出 RON 受体表面表达降低。一旦掌握，如果执行得当，每只动物可以在 20 到 30 分钟内完成这项技术。
在此程序之后，可以进行其他方法，如流式细胞术、荧光激活细胞分选和/或定量 PCR，以进一步表征分离的肝源组织驻留巨噬细胞的表型。观看此视频后，您应该对如何从患病肝脏中正确分离组织驻留巨噬细胞有很好的了解。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
该协议允许研究人员从受饮食引起的代谢紊乱影响的炎症组织中分离和表征组织驻留巨噬细胞。该方法专注于优化从肥胖介导的炎症影响的组织中获得单细胞悬液的分离步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 炎症
- 代谢紊乱
背景
- 组织驻留巨噬细胞在慢性炎症性疾病中起着至关重要的作用。
- 饮食引起的炎症影响各种组织，特别是肝脏。
- 了解巨噬细胞表型可以为治疗策略提供信息。
- 该协议提高了分离巨噬细胞以进行研究的效率。
研究目的
- 从炎症组织中分离和表征巨噬细胞。
- 调查巨噬细胞在慢性炎症中的作用。
- 提供一种获得单细胞悬液的可靠方法。
使用的方法
- 从饮食引起的模型中分离肝脏组织。
- 使用乙醇浸泡的小鼠进行组织提取。
- 解剖技术以获得组织样本。
- 分离后巨噬细胞表型的表征。
主要结果
- 成功从肝脏组织中分离巨噬细胞。
- 表征与炎症相关的巨噬细胞表型。
- 优化的协议提高了细胞分离的效率。
- 对巨噬细胞在代谢紊乱中的作用有了新的认识。
结论
- 该协议对于研究组织驻留巨噬细胞是有效的。
- 研究结果有助于理解慢性炎症性疾病。
- 未来的研究可以在这种方法学基础上进行进一步的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Macrophage heterogeneity in obesity-driven inflammation is a critical determinant of disease progression and therapeutic targeting in metabolic and cardiovascular disorders. This protocol enables robust isolation and phenotypic characterization of tissue-resident macrophages from inflamed liver, aorta, and adipose tissue, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. Reliable access to well-characterized immune cell populations enhances translational continuity and de-risks mechanistic hypotheses across the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of macrophage-driven inflammatory pathways in disease-relevant tissues.
- Supports functional target validation by distinguishing pro- and anti-inflammatory macrophage phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative phenotypic analysis of immune cell subsets.
- Improves predictive confidence for portfolio triage in metabolic and cardiovascular indications.
Screening & Assay Development
- Provides standardized single-cell suspensions for downstream flow cytometry and FACS workflows.
- Ensures reproducibility and quantitative output for immune cell profiling assays.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for compound screening.
- Supports reliable evaluation of immunomodulatory agents in disease-relevant contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns macrophage phenotyping with translational biomarker strategies in metabolic disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of immune targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking cellular phenotypes to disease progression.
- De-risks preclinical models by enabling precise immune cell characterization.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from hypothesis testing to lead identification and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of macrophage function in inflamed tissues.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immune cell readouts for assay development.
- Analytics: Provides flow cytometry and gene expression data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects immune cell phenotypes to preclinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for immune cell isolation across metabolic disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes and streamlines immune cell isolation for scalable R&D workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune-modulating therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic digestion, and flow cytometry analysis.
- Demands access to FACS instrumentation and quantitative PCR capabilities for downstream characterization.
- Necessitates cross-team standardization of isolation and staining protocols for reproducibility.
- Adaptable to multiple inflamed tissue types, including liver, aorta, and adipose tissue.
- Dependent on careful troubleshooting to optimize cell yield and viability from dense or fibrotic tissues.
