Name: 时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱用于研究蛋白质结构与动态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱技术，用于研究有序和无序蛋白质的快速结构变化。该方法可在毫秒时间尺度监测蛋白质反应，为神经退行性疾病治疗提供新见解。

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我们衷心感谢 Markus Zweckstetter 博士提供了基于其核磁共振研究预测的“天然”tau 集合的 pdb 坐标文件，以及 Adnan Sljoka 博士提供的分析工具。本研究工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）ENGAGE 基金项目提供资助。

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。激光烧蚀聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）产生的烟雾可能具有毒性。务必确保激光雕刻机连接至正常工作的通风系统。在构建微流控装置时，应采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制措施（通风橱、锐器容器）和个人防护装备（护目镜、口罩、手套、实验服、长裤、封闭式鞋）。在分析过程中为减少干扰性污染物，应尽可能使用高效液相色谱（HPLC）级试剂，所有试剂均应为美国化学会（ACS）级或更高纯度。
1. 微流控装置的制备
<ol>
	<li>PMMA微流控平台的构建
	<ol>
		<li>取一块标准的PMMA块（8.9 × 3.8 × 0.6 cm），使用激光雕刻机在上面激光烧蚀出用于引入试剂的进样通道、蛋白水解室以及出样通道17,18。 
		注意：蛋白水解室应蚀刻为细长的椭圆形（30 × 5 × 0.05 mm）。进样和出样通道必须延伸至PMMA块的末端，且宽度和深度均不得超过75 µm，以便适配30号毛细管。</li>
		<li>使用带有1/64&#34;厚切割片的旋转工具，将一根30号不锈钢金属毛细管切成两段，每段长约10 cm。使用砂纸打磨毛细管末端（可在光学显微镜下观察以辅助操作）。</li>
		<li>使用电烙铁将毛细管熔融固定至刻蚀好的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）块中。进样通道将连接自动注射泵，出样通道则用于与质谱仪（MS）耦合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连续流动时间分辨动力学混合器的构建
	<ol>
		<li>取一根长约40 cm的熔融石英玻璃毛细管（内径：75 µm，外径：150 µm），插入一根长约15 cm的28号不锈钢金属毛细管中。根据所需反应时间，可选用更长或内径更大的外层金属毛细管。 
		注意：准确测定金属毛细管的“实际”内径对于获得精确的反应时间至关重要。可通过将金属毛细管连接至高效液相色谱仪（HPLC），使溶剂流经毛细管并记录背压，进而通过背压与内径的换算关系确定其真实内径。该计算可使用分子量计算器软件（Windows 6.49版）完成。</li>
		<li>使用低功率激光雕刻设置在内层玻璃毛细管一端制作一个2 mm的凹槽，并将该端密封（图2）。也可使用陶瓷玻璃毛细管切割工具或带精细切割刀片的旋转研磨机制作该凹槽。</li>
		<li>将内层玻璃毛细管与金属毛细管末端对齐（可在光学显微镜下观察以辅助操作）。</li>
		<li>将该动力学混合器连接至混合三通的一端（图2）。</li>
		<li>在混合三通的另一端连接一根长约40 cm的熔融石英玻璃毛细管（内径：75 µm，外径：150 µm），用于输送酸（5%乙酸，pH 2.4）以终止反应。 
		注意：反应物通过气密性注射器经聚四氟乙烯（PTFE）管路，由自动输注泵供给装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胃蛋白酶活化
	<ol>
		<li>称取20 mg来自猪胃黏膜的胃蛋白酶，悬浮于1 mL偶联缓冲液（0.1 M磷酸钠，0.15 M NaCl，pH 6.0）中。</li>
		<li>称取50 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的琼脂糖微珠，加入重悬的蛋白酶溶液中，于4 °C轻柔旋转孵育过夜。</li>
		<li>在室温下以1,000 × g离心2 min，收集树脂。</li>
		<li>吸除未结合的蛋白酶。</li>
		<li>将琼脂糖加入1 mL封闭缓冲液（1 M Tris-HCl，pH 6.0）中，在室温下轻柔旋转孵育1 h。</li>
		<li>在室温下以1,000 × g离心2 min，收集树脂。</li>
		<li>吸除封闭缓冲液。</li>
		<li>将胃蛋白酶-琼脂糖微珠与1 mL 5%乙酸（pH 2.4）孵育5 min。</li>
		<li>以1,000 × g离心2 min，收集树脂。</li>
		<li>吸除上清液。</li>
		<li>重复步骤1.3.8至1.3.10，共进行三次洗涤。</li>
		<li>将微珠储存于1 mL乙酸中，4 °C长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>装置组装
	<ol>
		<li>使用无菌刮勺将活化的胃蛋白酶-琼脂糖微珠悬浮液（溶于5%乙酸中）填充至蛋白水解室。</li>
		<li>将PMMA微流控平台夹在两块空白PMMA块之间作为盖板，用硅橡胶密封，形成液密性封装。</li>
		<li>使用金属夹紧板对装置进行加压密封。 
		注意：该夹具为定制加工，专为适配微流控平台设计，由两块尺寸为10.1 cm × 7.4 cm × 1.2 cm的金属板组成。</li>
		<li>以10 µL/min的流速通入5%乙酸（pH 2.4）。同时以1 µL/min的流速通过蛋白通道通入50 mM乙酸铵缓冲液（pH 6.9）。 
		注意：在整个实验过程中，必须确保乙酸持续流经装置。应确认无泄漏现象，且液体仅从出样通道流出，该通道将作为电喷雾电离（ESI）源。</li>
		<li>使用可调绝缘平台将装置连接至经改装的四极杆飞行时间（Q-TOF）质谱仪前端，以实现最佳电喷雾条件。 
		注意：引入一个旁路开关，以模拟商用ESI源的存在17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 时间分辨电喷雾电离氢氘交换
<ol>
	<li>胃蛋白酶及仅蛋白质谱图的获取 
	注意：电喷雾电离质谱（ESI-MS）在正离子模式下进行，电压为+4,500至+5,000，去簇电压为60 V，聚焦电压为250 V。质谱扫描范围为350–1,500 m/z，扫描速率为1 s-1。
	<ol>
		<li>获取仅含胃蛋白酶的质谱图。该谱图中出现的任何峰在加入蛋白质后均应予以扣除。</li>
		<li>以1 µL/min的流速将50–100 µM的tau/磷酸化tau蛋白（按先前所述方法纯化并制备13,19）引入，取代之前流动的50 mM乙酸铵缓冲液。</li>
		<li>获取仅含蛋白质的质谱图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>时间点的获取
	<ol>
		<li>在100 µM tau/磷酸化tau蛋白以1 µL/min流速流动的同时，通过三通连接器以3 µL/min的流速引入D2O，并使其在动力学混合器中发生反应。在开始采集谱图前，确保系统至少平衡10分钟。 
		注意：氢氘交换反应后，通过以10 µL/min流速流动的pH 2.4乙酸溶液使标记反应淬灭，随后标记后的蛋白质在蛋白水解室中发生消化。</li>
		<li>为延长标记时间，可手动回撤内层玻璃毛细管的位置，以实现42 ms至8 s的混合时间。每次回撤后，需让系统至少平衡10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据与统计分析
<ol>
	<li>鉴定肽段并计算氘代交换百分比
	<ol>
		<li>使用 mMass 软件（版本 5.5.0）进行质谱图分析20。</li>
		<li>利用 ExPASy FindPept 蛋白质组学服务器鉴定肽段，并在需要时通过碰撞诱导解离（CID）加以确认21。 
		注：此处使用实验室自主开发的 FORTRAN 软件进行同位素分布分析，以测定氘掺入量22,23。</li>
		<li>使用 SPHERE 网络工具，基于一级序列计算理论固有交换速率22,24。</li>
		<li>采用单指数非线性回归拟合数据，并使用绘图与统计软件（例如，SigmaPlot）进行归一化处理。 
		注：kint / kobs 的比值得到保护因子（PF），该值是衡量特定区域在构象集合中结构化程度的半定量指标。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

尽管X射线晶体学和核磁共振（NMR）等结构生物学方法能够提供蛋白质的极为详细的结构信息，但这些图像通常是静态的。当使用这些传统方法研究瞬时物种和弱结构化结构域时，仍难以实现有效表征。因此，为了获得此类系统的动态信息，必须在快速的时间尺度上开展研究。我们已成功应用TRESI-HDX-MS技术，在肽段局部水平上深入揭示了一种被广泛研究的固有无序蛋白（IDP）所发生的构象变化。该技术的一个关键局限在于，胃蛋白酶是一种非特异性蛋白酶，单独使用时通常难以实现完整的序列覆盖。一种提高序列覆盖度和特异性的方法是将Aspergillus saitoi来源的蛋白酶XIII型引入消化室26。
在整个实验过程中，必须将消化室的 pH 值保持在 2.4，以有效终止交换反应并减少回交换量11。任何蛋白水解步骤及后续分析都必须尽快完成。以往的研究已优化了消化室的尺寸，并提出了相应的流速建议，以确保在室温下回交换水平降至可忽略的程度（≤5%）22。强烈...

在过去的几十年中，用于测定蛋白质结构和动力学的分析技术取得了显著进展1,2,3,4。尽管X射线晶体学仍是确定蛋白质结构的主要工具，但该方法需要高浓度的蛋白质，并且需要进行大量优化以获得可用于衍射的晶体。对于难以结晶的蛋白质（如膜相关蛋白和内在无序蛋白），传统上采用氢-氘交换（HDX）核磁共振（NMR）进行研究5。然而，在最近几十年中，将电喷雾电离质谱（ESI-MS）与HDX联用的技术迅速得到广泛应用6,7。
质谱技术为克服X射线晶体学和核磁共振所面临诸多限制提供了解决方案。特别是，质谱具有高度灵敏性（所需浓度为nM至µM级别），且对蛋白质分子大小几乎无限制。此外，质谱分析的高占空比使得研究蛋白质在酶促转化、错误折叠、复合物形成及其他生物学相关过程中的动态变化成为可能。这些过程通常发生在毫秒到秒的时间尺度上，因此在分析前需要实现试剂的快速混合。
Wilson 和 Konermann 于 2003 年开发的时间分辨电喷雾电离（TRESI）技术，使得可通过电喷雾质谱（ESI-MS）以伪实时方式监测反应过程。他们的装置包含一个带有连续可调反应室体积的毛细管混合器8。该装置由两根同轴毛细管组成，内层毛细管为封闭式，其侧壁上开有一缺口，使溶液可在内层毛细管末端至缺口之间的狭窄环形间隙中混合（通常长度为 2 mm）。在应用于氢氘交换（HDX）实验时，内层毛细管输送目标蛋白质，外层毛细管输送标记用的 D2O 溶液，两者在进入可调反应室前于间隙中混合，从而在样品直接进入电喷雾电离（ESI）源之前完成氢氘交换标记。
简而言之，氢氘交换（HDX）依赖于蛋白质骨架酰胺氢与溶液中的氘原子发生交换9,10。在生理pH条件下，该交换由碱催化；当pH低于约2.6时，则以酸催化为主。交换速率主要受四个因素影响：pH、温度、溶剂可及性以及分子内氢键作用。由于前两个因素在实验过程中保持恒定，因此交换速率（特别是在肽骨架酰胺位点）主要取决于蛋白质结构11。具有广泛且稳定氢键网络的紧密折叠区域（如α-螺旋和β-折叠）吸收氘的速度显著慢于环状结构和无序区域（有时甚至不发生吸收）12。这使得HDX可用于全局性蛋白质分析，当结构发生扰动（例如，发生聚集或底物结合时），会导致氘吸收量的变化（图1）。
动力学毛细管混合器可整合到一种微流控平台中，该平台包含用于定位氘摄取的蛋白水解室。该蛋白水解室需维持在低pH条件下，以有效淬灭氢氘交换反应，并需要固定化的酸性蛋白酶将蛋白质消化为局部肽段（图2）。在毫秒至秒级时间尺度上监测骨架氢氘交换，对于表征难以解析的环区、熔融球状结构以及内在无序蛋白（IDPs）中的构象变化尤为重要13,14。此外，TRESI-HDX还可结合COREX算法（DX-COREX方法），用于研究目前尚无X射线晶体学或核磁共振（NMR）解析原子结构的蛋白质15,16。本详细实验方案将应用TRESI-HDX技术，研究内在无序蛋白tau在其天然形式及其致病性高磷酸化状态下的结构特征。尽管天然tau蛋白是研究最为深入的内在无序蛋白之一，但对其淀粉样变体的认识仍然有限13。

<table><tbody><tr><td>聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）</td><td>Professional Plastics</td><td>SACR.250CCP</td><td>8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm</td></tr><tr><td>熔融石英玻璃毛细管</td><td>Polymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>内径：75 &amp;micro;m，外径：150 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>金属毛细管</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &amp;ndash; 89875K97&lt;br/&gt; 30 ga&amp;nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>氟化乙烯丙烯（FEP）管</td><td>IDEX</td><td>1477&lt;br/&gt; 1548</td><td>内径：0.007&amp;rdquo;，外径：1/16&amp;rdquo;&lt;br/&gt; 内径：0.020&amp;rdquo;，外径：1/16&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>标准聚合物管切割器</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>适用于外径为1/16&amp;rdquo; 和 1/8&amp;rdquo; 的管材</td></tr><tr><td>微型静态混合三通接头</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>适用于外径为1/16&amp;rdquo; 的管材</td></tr><tr><td>或</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢三通接头，孔径0.25&amp;nbsp;mm</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td><td>ZT1C</td><td>适用于外径为1/16&amp;rdquo; 的管材</td></tr><tr><td>适用于外径1/16&amp;rdquo; 管材的PEEK三通接头</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 雌接头至雌鲁尔接头</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK双翼螺母</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>适用于外径1/16&amp;rdquo; 管材的卡套</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>100系列旋转工具</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>切割片</td><td>Jobmate</td><td></td><td>厚度1/64&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>Stereomaster数字变焦显微镜</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>电烙铁</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser</td><td>Universal Laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>容量500&amp;nbsp;&amp;micro;L</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS活化琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>来自猪胃黏膜的胃蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-10X0.6ML</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>色谱纯水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件/在线工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分子量计算器</td><td></td><td>版本 6.49</td><td>开源质谱工具</td></tr><tr><td>mMass</td><td></td><td>版本 5.5.0</td><td>开源质谱工具</td></tr><tr><td>ExPASy FindPept</td><td>瑞士生物信息学研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software</td><td>版本 11.0</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&amp;ouml;dinger</td><td>版本 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite 混合型 Q-TOF 质谱仪</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

由于缺乏稳定的二级结构元件，内在无序蛋白（IDP）长期以来一直对结构生物学家构成挑战。在快速时间尺度上测量的氢-氘交换（HDX）能够特异性地检测短暂存在的结构和氢键网络，从而实现对天然构象集合中瞬时构象体的表征。将HDX与质谱技术联用具有多项关键优势，包括高灵敏度、样品消耗量低以及对蛋白质大小无限制。该技术在过去几十年中取得了显著进展，现已能够监测毫秒时间尺度的HDX标记过程。此外，通过将HDX工作流程整合到包含酸性蛋白酶微反应器的微流控平台上，我们能够在肽段水平上定位蛋白质的动态特性。在本研究中，将时间分辨电喷雾电离质谱（TRESI-MS）与HDX联用，用于深入解析tau蛋白中的残余结构及其在过度磷酸化后所诱导的构象变化。

天然 tau 蛋白与磷酸化 tau 蛋白的消化谱相似，序列覆盖度分别为 77.1% 和 71.7%。通过使用实验室自主开发的 FORTRAN 软件生成的理论同位素分布，拟合实验观测到的同位素分布，从而确定各肽段的氘代摄取值。最佳拟合分布如图所示（图 3a），并附有相应的氘代摄取值。随后生成摄取动力学曲线，并以单指数方程进行良好描述。对在三个或更多标记时间点（n = 3）被检测到的所有肽段的动力学曲线进行分析。这些对观测摄取值的单指数拟合得到了每个肽段的交换速率常数 kobs。该值与基于一级序列的“随机线圈”本征速率常数 kint 进行比较。在 1.52 秒时计算得到的保护因子 PF（kint / kobs）被映射到天然态和过度磷酸化 tau 蛋白的代表性结构上（图 4）。
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构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。

内在无序蛋白（IDPs）由于缺乏稳定的二级结构元件，长期以来一直对结构生物学家构成挑战。

构象灵活性在蛋白质功能中起着关键作用，而时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱技术的总体目标是探测有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。该方法有助于回答结构生物学领域的关键问题，例如瞬时蛋白质构象的表征，而这些问题难以通过X射线晶体学和核磁共振等传统高分辨率技术解决。该技术的主要优势在于，可在毫秒时间尺度上监测反应过程，这对于表征环状结构域、熔融球状体以及内在无序蛋白质至关重要。该技术的应用前景涉及神经退行性疾病的治疗，因为这类疾病通常与内在无序蛋白区域的错误折叠或聚集有关。尽管该方法可为弱结构化蛋白提供深入见解，也可应用于其他体系，例如发生催化循环的酶，或蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体相互作用的表征。首先，使用激光雕刻机在标准的 PMM8 块上通过输入通道激光刻蚀一个微流控芯片，该芯片包含用于引入试剂的输入通道、透析室和输出通道。随后，使用旋转工具配合厚度为 1/64 英寸的切割片，将一根 30 号不锈钢金属毛细管切成两段，每段长 10 厘米。使用砂纸打磨毛细管的末端，可在光学显微镜下观察以辅助完成端面的平滑处理。现在，使用电烙铁将毛细管熔接到刻蚀的 PMM8 模块上。为了构建连续流动的时间分辨动力学混合器，将一根 40 厘米长的熔融石英玻璃毛细管插入一根约 15 厘米长的 28 号钢制毛细管中。接下来，在内层玻璃毛细管的一端使用低功率激光雕刻设置加工出一个 2 毫米的凹槽，并将该端的内层玻璃毛细管密封。这是一个关键步骤，可确保蛋白质的有效正交混合，蛋白质将通过毛细管末端的切口流出。切口与毛细管末端之间两毫米的毛细管间空间即为混合体积。安装适当尺寸的接头和套管，并接入一个T型连接器，用于输送去污剂。接下来，在体视显微镜下观察，将内层玻璃毛细管与金属毛细管末端对齐，并标记此处为零毫米位置。将该动力学混合器连接至混合T型管的一端，再将一根40厘米长的熔融石英玻璃毛细管连接至混合T型管上动力学混合器的另一端。对于胃蛋白酶的激活，取20毫克来源于Porsena gassic黏膜的胃蛋白酶，悬浮于1毫升偶联缓冲液中。向重悬的蛋白质中加入50毫克NHS活化的琼脂糖珠，于4°C轻轻旋转孵育过夜。次日，在室温下以1000 × g离心2分钟，收集树脂，然后吸除未结合的蛋白质。随后，将琼脂糖珠与1毫升封闭缓冲液在室温下轻柔旋转孵育1小时。收集树脂并吸除封闭缓冲液后，将胃蛋白酶琼脂糖珠与1毫升5%乙酸溶液孵育5分钟。在室温下以1,000 × g离心2分钟，收集树脂，然后吸除上清液。重复上述步骤，共进行三次洗涤后，将珠子储存于 1 毫升乙酸中，于 4 摄氏度条件下长期保存。组装装置时，使用无菌刮勺将活化的胃蛋白酶琼脂糖珠悬浮液（溶于 5% 乙酸中）填充至透析室。将 PMMA 微流控平台置于两块空白的 PMMA 块之间作为盖板以密封装置，并用硅橡胶垫圈密封，确保液体不泄漏。使用金属夹紧板对装置进行加压密封。然后使用合适的接头将混合T型管连接至装置的入口。现在以每分钟10 µL的流速通过酸通道注入5%的乙酸。然后以每分钟1微升的流速，将50毫摩尔氨甲酸缓冲液通过蛋白质通道。使用可调节的绝缘级接口，将装置连接至经改造的四极杆飞行时间质谱仪（Qtof）前端，以获得最佳电喷雾条件。设置好ESI-MS条件后，采集仅含胃蛋白酶的质谱图。接下来，以每分钟1微升的流速，在先前流动50毫摩尔乙酸铵缓冲液的位置引入50至100微摩尔的Tau蛋白或磷酸化Tau蛋白。在开始采集前，让系统平衡至少10分钟，然后采集仅含蛋白的质谱信号。当Tau或磷酸化Tau蛋白正在流动时，通过T型连接器以每分钟3微升的流速引入重水（D₂O），并使其在动力学混合器中发生反应。为了延长标记时间，手动回拉内层玻璃毛细管的位置，以实现42毫秒至8秒的混合时间，每次回拉后需让系统至少平衡10秒。此动画展示了一次典型实验的工作流程。蛋白质从切口处流出，并与迎面而来的氘发生混合。在指定的反应时间内，骨架M8氢原子会发生交换，通过回拉蛋白质毛细管可调节反应时间。随后在含有出口电喷雾针头的微流控平台上进行反应淬灭和蛋白消化。所得质谱图中包含已消化的蛋白质片段。针对各个肽段计算其氘代摄取百分比，然后将其映射到蛋白质的三维结构上。天然型与磷酸化 tau 蛋白的酶解谱图相似，序列覆盖度分别为 77.1% 和 71.7%。此处展示了四个简单肽段的最佳拟合同位素分布及其相应的氘代摄取值。通过各肽段的氘代摄取百分比随时间变化的动力学曲线图，可提取出观测到的实验速率。计算得到的随机特征谱图用于对比，并用于提取理论内在等级。与预期一致，在通常与二级结构元件相关的范围内未观察到保护因子，证实天然tau蛋白内部氢键作用较弱。在N端和C端、中心结构域以及易聚集区域观察到显著的保护作用。在高磷酸化相关的tau蛋白中，观察到整个蛋白质的氘吸收量普遍增加。在N端和C端以及六肽区域二处有显著增加。保护程度因子以彩虹色谱方案显示，如此处所示。一旦掌握，该技术若操作得当，可在数小时内完成。在进行此操作时，重要的是使用HPC级或更高级别的试剂区域，以尽量减少污染物，因为污染物可能干扰分析。在此步骤完成后，可进一步采用其他方法，如共价标记、化学交联、计算建模和对接研究，以匹配蛋白质的三维结构，或确认蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体相互作用的区域。该技术问世后，为结构生物学领域的研究人员探索内在无序蛋白及其结构域开辟了道路，这类蛋白在神经退行性疾病中最为常见。观看本视频后，您应能充分理解如何利用时间分辨电喷雾离子化、氢氘交换和质谱法来研究蛋白质结构与动态变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱用于研究蛋白质结构与动态

蛋白质构象与动力学对于理解蛋白质结构与功能之间的关系至关重要。氢交换结合高分辨率质谱法是一种多功能方法，可用于研究蛋白质的构象动力学，以及表征蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用，包括结合界面和变构效应。...

利用氢交换质谱法分析蛋白质动力学

本文介绍了针对固态粉末中蛋白质的固态酰胺氢/氘交换质谱法（ssHDX-MS）和固态光解标记质谱法（ssPL-MS）的详细实验方案。这些方法可提供非晶态固态中蛋白质构象及其相互作用的高分辨率信息，可能对制剂设计具有重要意义。...

质谱技术在冻干粉末中研究蛋白质结构与相互作用的应用

蛋白质复合物的结构对其功能至关重要。结合多种质谱技术已被证明是研究其组装过程的有力手段。本文提供了化学交联和天然质谱的技术方案，并展示了这两种互补技术如何帮助阐明多亚基蛋白质复合物的结构架构。...

结合完整蛋白质复合物的化学交联与质谱技术研究多亚基蛋白组装体的结构

质谱法（MS）已成为研究大分子组装体结构与动态的重要工具。本文整合了基于质谱的方法，用于探究蛋白质复合物的形成及配体结合。...

通过整合结构质谱法分析蛋白质结构与蛋白质-配体复合物

兰肽合成酶在肽类天然产物的生物合成过程中催化多步反应。本文介绍了一种连续的自下而上的氢氘交换质谱（HDX-MS）工作流程，可用于研究兰肽合成酶以及其他参与肽类天然产物生物合成的类似酶的构象动态。...

一种用于研究肽类生物合成酶的氢-氘交换质谱（HDX-MS）平台

本文介绍了一种基于毛细管电泳的氢/氘交换（HDX）方法，并结合自上而下的质谱技术。该方法通过同时进行差异化的HDX反应和电泳分离，表征不同蛋白质种类（包括处于不同状态的蛋白质和不同的蛋白质异构体）在高级结构上的差异。...

基于毛细管电泳的氢/氘交换结合自上而下质谱法用于蛋白质构象表征

中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。...

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

单体α-突触核蛋白的结构集合影响其生理功能和理化性质。本方案描述了如何在生理条件下，对这种内在无序蛋白的单体进行毫秒级氢/氘交换质谱分析及后续数据处理，以获得其构象信息。...

毫秒级氢/氘交换质谱法用于生理条件下α-突触核蛋白结构动力学研究

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。...

脂滴分离用于定量质谱分析

学习时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱技术，用于研究有序和无序蛋白质的快速结构变化。该方法可在毫秒时间尺度监测蛋白质反应，为神经退行性疾病治疗提供新见解。

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

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