Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

构象灵活性在蛋白质功能中起着关键作用，时间分辨电喷雾电离氢-氘交换质谱法的总体目标是探测驱动有序和无序蛋白质功能的快速结构变化。这种方法可以帮助回答结构生物学领域的关键问题，例如瞬时蛋白质确认的缩孔化，这对于电膀胱造影和 NMR 等经典高分辨率技术来说并不是最低限度的。该技术的主要优点是可以在毫秒级时间尺度上监测反应，这对于表征环脊、蜕皮和固有无序蛋白质非常重要。

这项技术的影响延伸到神经退行性疾病的治疗。因为它们通常涉及固有无序蛋白质区域的错误折叠或聚集。虽然这种方法可以深入了解每周结构蛋白，但它也可以应用于其他系统，例如经历催化周转的酶，或蛋白质、蛋白质与蛋白质、配体相互作用的表征。

要开始此过程，请使用激光雕刻机在标准 PMM8 模块上通过用于引入试剂的输入通道、pro 透析室和输出通道对板进行激光处理。然后，使用第 164 英寸厚的切割盘的旋转工具将 30 号不锈钢金属毛细管切成两个 10 厘米的小块。使用砂纸抚平毛细血管的末端，这可以通过在光学显微镜下观察来促进。

现在，使用慢烙铁将毛细管熔化到蚀刻的 PMM8 模块中。为了构建连续流动、时间分辨的动力学混合器，将 40 厘米的熔融纤毛玻璃毛细管插入约 15 厘米的 28 号钢制金属毛细管中。接下来，在内部玻璃毛细管的一端使用低功率激光雕刻机设置，产生一个两毫米的缺口，并密封内部玻璃毛细管的这一端。

这是确保蛋白质正交和有效混合的关键步骤，蛋白质通过常见的劣化缺口排出。切迹和毛细管末端之间的 2 毫米毛细管间距是混合物和体积。连接适当尺寸的接头和管道套管，并加入 T 型连接器，用于输送劣质。

接下来，将内部玻璃毛细管与金属毛细管的末端对齐，这可以通过在光学显微镜下观察来促进。将此标记为零毫米位置。将该动力学混合器连接到混合 T 的一端，然后将 40 厘米熔融石英玻璃毛细管连接到混合 T 上动力学混合器的另一端。为了活化胃蛋白酶，将 20 毫克来自波森纳气体粘膜的胃蛋白酶悬浮在 1 毫升偶联缓冲液中。

向重悬的蛋白质中加入 50 毫克 NHS 活化的农业速度，并在 4 摄氏度下轻轻旋转过夜。第二天，在室温下以 1000 倍 G 的速度离心混合物 2 分钟以收集树脂。然后吸出未结合的 protiyes。

之后，将 agros 放入 1 毫升封闭缓冲液中孵育，并在室温下轻轻旋转 1 小时。收集填料并吸出封闭缓冲液后，将胃蛋白酶与 1 毫升 5% 的醋酸一起孵育 5 分钟。将混合物以 1， 000 倍 G 的速度在室温下旋转 2 分钟，以收集树脂，然后吸出超级 Natent。

重复上述步骤后，总共洗涤 3 次，将珠子储存在 4 摄氏度的 1 毫升乙酸中以供长期使用。要组装该装置，请使用无菌刮刀将活化胃蛋白酶凝珠浆液填充到 5% 的醋酸中。将 PMMA 微塑料平台放在两个空白 PMMA 块之间作为盖子以密封设备，内衬硅橡胶以形成液密密封。

使用金属夹板对设备进行压力密封。然后使用适当的接头将混合 T 连接到设备的入口。现在，5% 的醋酸以每分钟 10 微升的速度流出酸线。

然后以每分钟 1 微升的速率将 50 毫米阿蒙尼亚酸缓冲液流过蛋白质管路。将设备耦合到改进的四极杆飞行时间或 Qtof 质谱仪的前端，使用可调节的绝缘载物台实现最佳电喷雾条件。设置 ESI-MS 条件后，采集仅胃蛋白酶谱图。

接下来，以每分钟 1 微升的速率引入 50 至 100 μmoler 的 tau 或磷酸化 tau 蛋白，其中 50 毫米的醋酸铵缓冲液之前流动。让系统平衡至少 10 分钟后，在采集前，采集仅蛋白质谱图。当 Tao 或磷酸化 tao 蛋白流动时，通过 T 连接器以每分钟 3 微升的速率引入氧化铵，并在动力学混合器中反应。

为了增加贴标时间，手动将内部玻璃毛细管的位置拉回，以实现 42 毫秒到 8 秒的混合时间，让系统在每次拉回之间平衡至少 10 秒。此动画描述了典型实验的工作流程。蛋白质通过缺口流出并与迎面而来的 duterium 混合。

骨架 M8 氢在分配的反应时间内进行交换，这可以通过拉回蛋白质毛细管来改变。然后对反应进行淬灭，然后在包含出口 ESI 针的微流体平台上消解。所得光谱包含消化的蛋白质。

计算单个肽段的氘摄取百分比，然后映射到 3D 蛋白质结构上。天然肽和磷酸化 tau 蛋白的消化曲线相似，序列覆盖率分别为 77.1% 和 71.7%，此处显示了四种简单肽的最佳拟合同位素分布和相关的氘摄取值。使用观察到的每种肽的氘摄取百分比与时间的动力学图来提取观察到的实验速率。

计算出的随机质量剖面被显示出来以进行比较，并用于提取理论内禀等级。正如预期的那样，在该范围内没有观察到通常与二级结构元素相关的保护因子，证实天然 tau 表现出较弱的内部氢键。在 N 和 C 末端、中央结构域和聚集突显区域观察到显著保护。

在高磷酸化相关 tau 蛋白中，观察到整个蛋白质的氘摄取普遍增加。在 N 和 C 末端以及六肽 2 区域有显著增加。保护等级系数显示为彩虹方案，如下所示。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在几个小时内完成。在尝试此过程时，使用 HPC 等级或更高等级的区域非常重要，以尽量减少污染物，因为它们会干扰分析。遵循此程序，可以执行其他方法，例如共价标记、化学交联、计算建模和文档研究，以匹配三维蛋白质结构，或确认蛋白质蛋白质和蛋白质 legin 相互作用的区域。

开发后，这项技术为结构生物学领域的研究人员铺平了道路，以探索本质上无序的蛋白质和结构域，这在核退行性疾病中最常见。看完这个视频，你应该对如何使用时间分辨电喷雾电离、氢氘交换、质谱法来研究蛋白质结构和动力学有了很好的了解。