使用全身免疫组织化学方法研究胆道的神经支配 Suncus murinus
2017年6月15日
一种全身免疫组织化学方法，可以显示Suncus murinus肝外胆道中的神经丝蛋白表达。在这里介绍。该方案可用于分析小鼠或其他物种中所有内脏器官的神经支配。
该程序的总体目标是采用整体免疫组织化学染色来可视化 Suncus murinus 胆道内的神经分布。该方法可用于分析许多物种内脏器官的神经分布，特别是难以通过标准方法评估的不规则或小器官。这种技术的主要优点是作简单。
它不需要复杂的程序，成功率高。与我一起演示该程序的是我实验室的研究生 Yidan Dai 和研究员 Shuang-Qin Yi。首先在通风柜中用单独的 PBS 和 4% 多聚甲醛灌注冲洗动物。
然后通过灌注导管将 2 到 3 毫升白色氯丁橡胶乳胶注入腹主动脉以标记血管。当所有感兴趣的组织都被标记后，提取腹部器官及其相关的神经和血管。然后将大约 0.1 毫升蓝色氯丁橡胶乳胶注射到胆囊中以标记胆道系统，并在 4 摄氏度下将组织在 4% 多聚甲醛中后固定过夜，以进行整体免疫染色。
第二天早上，将样品转移到玻璃瓶中，在章动器上用蒸馏水进行四次一小时的室温洗涤。最后一次洗涤后，将组织在新鲜制备的 1% 正周期酸中在室温下孵育 20 分钟，以防止任何内在过氧化物酶反应。接下来，在室温下用蒸馏水洗涤样品 10 分钟，然后在新鲜制备的 0.004% papillon 中在 37 摄氏度恒温水浴中轻轻摇动孵育 2 小时。
孵育结束时，用蒸馏水洗涤标本 50 至 60 分钟。然后将组织在 4 摄氏度的 4% 多聚甲醛中储存过夜。第二天早上，如刚才所示，用蒸馏水清洗样品，然后在新鲜制备的 papillon 中再孵育 2 小时。
在蒸馏水中再洗涤样品 50 至 60 分钟，然后在 4% 多聚甲醛中固定过夜。第 3 天早上，用蒸馏水洗涤组织 4 次，然后浸入 3 次连续上升的 30 分钟蔗糖孵育中。然后将样品在零下 20 摄氏度下冷冻 30 至 60 分钟，然后在室温下完全解冻。
在第三个冻融循环后，将样品转移到 2% Triton X-100 中，在 4 摄氏度下过夜孵育。第二天早上，根据样本的大小，将样本转移到装有目标一抗的容器中，在 4 摄氏度的章动器上轻轻摇动 3 到 6 天。适当的标记期后，在室温下用 PBS 洗涤四次，每次 1 小时，去除未结合的一抗，然后用适当的二抗标记样本，在 4 摄氏度下轻轻摇动，放置三天。
在二抗标记期结束时，在 PBS 中洗涤样本四次。然后将组织在 10 微升 30% 过氧化氢和 100 毫升新鲜制备的 0.002% DAB 着色溶液中，在 4 摄氏度下孵育 16 至 72 小时，轻轻摇动。当达到最佳染色强度时，将样品转移到 PBS 中的 0.04% 叠氮化钠中以停止着色反应。
然后小心地将样品浸入含有新鲜 PBS 的 10 厘米培养皿中，并使用安装在体视显微镜上的相机捕获组织的整体安装图像。除了肝外胆道神经支配的可视化外，用抗神经丝阳性神经纤维的抗体标记还可以明确识别迷走神经沿食道和进入胃的运行和分布密度。用白色氯丁橡胶乳胶标记胆囊血管显示薄神经纤维化，与周围组织形成鲜明对比，在胆囊颈部观察到的神经支配密度高于眼底。
在上胆管中，标记了两种类型的神经束，一种是形成不规则且密集的神经网络并粘附性地驻留在胆道上和胆道内的细神经束，另一种是平行于胆道表面分布的较厚的神经束。用蓝色氯丁橡胶乳胶标记胆总管，用白色氯丁橡胶乳胶标记血管，可以观察到胆总管末端和十二指肠区域的细神经纤维。在尝试此过程之前，请注意制定每个实验的时间表，因为整个过程需要两到三周才能完成。
为避免在更换溶液时损坏标本，请始终倒出溶液，而不是用镊子取出标本。观看此视频后，您应该能够将此技术应用于各种内脏器官内一系列神经的标记。
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概述
本文介绍了一种全胚免疫组织化学方法，用于可视化Suncus murinus肝外胆道的神经丝蛋白表达。该方法允许分析内脏器官的神经分布，特别是那些小型或不规则的器官。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫组织化学
- 内脏器官分析
背景
- 全胚免疫组织化学是一种用于可视化神经分布的技术。
- Suncus murinus是用于研究内脏器官神经支配的模型生物。
- 该方法对于标准技术难以评估的小型或不规则器官具有优势。
- 该协议简单明了，成功率高。
研究目的
- 可视化Suncus murinus胆道内的神经分布。
- 提供一种可靠的方法来分析各种内脏器官的神经支配。
- 为教育目的演示该程序。
使用的方法
- 用PBS和4%甲醛灌流动物。
- 全胚免疫组织化学染色。
- 可视化神经丝蛋白表达。
- 由研究生和研究员演示。
主要结果
- 成功可视化胆道内的神经分布。
- 证明该方法对小型和不规则器官的有效性。
- 全胚免疫组织化学技术的高成功率。
结论
- 全胚免疫组织化学方法对分析神经分布有效。
- 该技术可以应用于Suncus murinus之外的各种物种。
- 该协议简单易行，适合研究人员使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This whole-mount immunohistochemical method enables visualization of nerve distribution in visceral organs, supporting target validation in neurogastroenterology and autonomic nervous system research. By providing high-resolution mapping of innervation patterns in small or irregular organs, it aids mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in biliary tract function. The approach offers predictive confidence for early discovery programs focused on neural modulation of visceral organ physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to vagal and visceral nerve function in biliary tract regulation.
- Operational Value: Provides a reliable method for functional target validation through direct visualization of neurofilament-positive nerve fiber distribution.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying neural pathway involvement in biliary tract homeostasis and disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline innervation maps in the biliary tract.
- Quantitative Output: Enables measurement of nerve fiber density and distribution patterns, supporting assay standardization and reproducibility.
- Platform Reuse: Adaptable to other neuronal antibodies, allowing scalable application across visceral organ systems after initial optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling consistent innervation analysis from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by clarifying neural contributions to biliary tract function in preclinical models.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural innervation changes with functional readouts in translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for neuro-modulatory approaches to biliary and visceral organ disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing nerve distribution in the biliary tract and associated organs like esophagus and stomach.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preparation and high-success-rate immunostaining, enabling reliable compound effect evaluation on neural structures.
- Analytics: Generates quantitative neuroanatomical data on nerve bundle density and distribution, aiding comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling consistent innervation assessment across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histology platform for visceral organ innervation studies, adaptable to multiple species and neuronal markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neural control of visceral organs.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a straightforward protocol with high success rate, minimizing technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clear neural anatomy data, reducing late-stage biological risk in neuro-visceral therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated innervation patterns in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, tissue dissection, and confocal or stereo microscopy for whole-mount imaging.
- Dependent on access to primary and secondary antibodies, enzymatic inactivation reagents, and DAB substrate for colorimetric detection.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, permeabilization (e.g., Triton X-100), and antibody incubation conditions across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying to different visceral organs or species, particularly regarding antibody optimization and permeabilization times.
- Limited by the two- to three-week timeline per experiment, requiring planning for longitudinal studies.
