使用荧光探针定量培养神经元中内体和溶酶体的运动性

本成像分析的总体目标是观察神经元中囊泡的运动性并对其进行简便的量化。该方法能够以简单且省时的方式分析神经元中的膜运输过程。开始此操作时，将子宫转移至一个新的培养皿中，并加入70%乙醇。

接下来，将子宫转移至另一含有 HBSS 的培养皿中。然后使用灭菌的解剖镊子和手术剪从子宫中取出胚胎。之后将其放入盛有 HBSS 的新培养皿中。

在体视显微镜下，用无菌解剖镊去除皮肤和颅骨，并取出脑组织。然后将其转移至另一含有HBSS的培养皿中。使用无菌解剖镊去除脑膜。

然后修剪掉多余组织。接着将皮层组织转移至含有HBSS的新培养皿中。使用一次性滴管或25毫升移液管收集所有皮层组织，并放入15毫升离心管中。

随后，用移液器吸除 HBSS。然后，向含有皮质的试管中加入三毫升脑皮质酶解液。将试管放入水浴中，在 37°C 下孵育五分钟。

随后，向含有皮质的离心管中再加入三毫升脑皮质酶解液，在37°C水浴中继续孵育五分钟。五分钟后，移除脑皮质酶解液，并加入五毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基。使用带有无菌P1000吸头的五毫升移液器，轻轻吹打数次，使皮质组织充分解离。

然后使用带有P200吸头的5毫升移液器再次吹打皮层组织。将40微米尼龙细胞筛置于50毫升离心管上，过滤悬液以去除碎片。随后，在室温下以420 × g离心5分钟，然后弃去DMEM培养基。

随后，加入 5 毫升大脑皮层培养基，轻轻重悬细胞沉淀。然后使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用大脑皮层培养基调整细胞浓度。接下来，将每份含有 3 × 10⁶ 个皮层神经元的 2 毫升细胞悬液接种至每个编码的 35 毫升玻璃底培养皿中。

在此步骤中，将四微克质粒与200微升无血清培养基混合。在另一管中，将八微升转染试剂溶于200微升无血清培养基中。然后，在室温下孵育该溶液五分钟。

五分钟后，将质粒溶液与转染试剂溶液混合，并在室温下孵育20分钟。随后，将混合物加入编码的玻璃底培养皿中。将神经元在37摄氏度下孵育30分钟。

随后，将培养基更换为2 mL大脑皮层培养基，于37°C培养神经元1至2天。进行成像时，使用配备CCD相机和40X物镜的荧光显微镜，并通过培养系统维持37°C的温度。

使用图像采集软件控制，在100秒的时间内每隔5秒采集一帧神经元图像。为分析图像，使用ImageJ软件中的“手动追踪”功能打开所有连续图像。要合并连续图像，请依次选择“图像”、“堆栈”、“图像转为堆栈”，然后单击“确定”。随后，选择“插件”，然后选择“手动追踪”。

将弹出一个跟踪窗口。勾选“显示参数”复选框，并在“参数”部分中定义跟踪参数。然后点击“添加轨迹”以开始新的跟踪。

确定目标囊泡后，点击连续图像中信号的中心位置，以记录其 xy 坐标。重复此操作，从所有连续图像中收集囊泡的 xy 坐标；每次选定参考点后，图像将自动切换至下一幅。该图像显示了转染两天后（自体外培养第4天开始）小鼠皮层神经元树突中含 LAMP-EGFP 囊泡的运动情况。

插图显示了LAMP-EGFP阳性囊泡的时间推移图像。红色箭头指示一个移动的囊泡，蓝色箭头指示一个静止的囊泡。橙色箭头指示荧光信号更强的区域。

这是 LAMP-EGFP 阳性囊泡随时间变化的 X 轴位置。红色圆圈中标记为 b 的囊泡处于运动状态，而蓝色圆圈中标记为 a 的囊泡处于静止状态。该柱状图表示 LAMP-EGFP 运动的总距离。

此柱状图显示了含有 LAMP-EGFP 的囊泡的平均运动距离。