Name: IL-8瞬时转化的小鼠模型体内长期监测炎症反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解利用非侵入性生物发光成像技术在小鼠体内长期监测IL-8启动子依赖性肺部炎症激活的方法。该技术可在两个月内对同一动物进行重复评估，实时追踪炎症动态变化，为研究宿主-病原体相互作用和呼吸道疾病机制提供重要工具。

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本工作由意大利囊性纤维化基金会项目 FFC#18/2013、FFC#29/2015 以及意大利囊性纤维化联盟通过威尼托分会—威尼托抗囊性纤维化协会（Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus）资助。

所有所述动物实验均经维罗纳大学跨部门实验研究中心内部动物福利委员会批准，并符合欧盟指令2010/63/EU、意大利D.Lgs 26/2014以及《实验动物护理和使用指南》（华盛顿特区：国家科学院出版社，1996年修订版）。本方案及实验已获国家卫生研究院批准（编号273/15）。动物可自由获取标准啮齿类动物饲料和软化自来水，在任何处理前至少适应本地动物房环境5天（室温：20 - 24 °C；相对湿度：40 - 70%；光照-黑暗循环：12小时）。
1. 体内 基因递送
<ol>
	<li>使用层流罩制备 体内 递送试剂/核酸复合物。</li>
	<li>根据生产商提供的 体内 操作说明，确定实验方案和参数。
	<ol>
		<li>每只小鼠注射总体积为 200 µL 的复合物。</li>
		<li>起始使用 40 µg 溶于无内毒素水中的 DNA；优化范围可达到 60 µg。 
		注意：根据生产商说明，注射体积中核酸的最终浓度不得超过 0.5 µg/µL。</li>
		<li>使用 N/P 比值为 6 - 8（每 µg 核酸使用 0.12 - 0.16 µL 递送试剂）。计算相应体积的递送试剂。 
		注意：复合物应带正电荷，以实现有效的细胞摄取。N/P 比值定义为 体内 递送试剂中每个核酸磷酸基团（P）所对应的氮残基数（N），代表复合物内部的离子平衡程度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将计算量的核酸（见步骤 1.2.1）用 10% 葡萄糖储备液（提供）和无菌水稀释至终浓度为 5% 葡萄糖。确保稀释体积为最终注射体积的一半。轻轻涡旋或通过移液上下吹打混匀。</li>
	<li>将计算量的递送试剂（见步骤 1.2.3）用 10% 葡萄糖储备液（提供）和无菌水稀释至终浓度为 5% 葡萄糖，体积为注射体积的一半。轻轻涡旋后在 13,000 x g 离心 15 秒。</li>
	<li>将上述稀释后的递送试剂一次性加入稀释后的核酸中。轻轻涡旋混匀，并在 13,000 x g 离心 15 秒。</li>
	<li>将步骤 1.5 得到的混合物在室温下孵育 15 分钟。 
	注意：自此步骤起，复合物在室温下可稳定存在 4 小时，在 4 °C 保存时可稳定长达 7 天。</li>
	<li>使用已平衡至室温的复合物进行尾静脉注射。将小鼠尾巴浸入温水（50 - 53 °C）中 30 秒，以促进静脉扩张。
	<ol>
		<li>将小鼠放入固定装置中。以 20 - 30° 角度将 27 至 30 号针头插入尾静脉，缓慢注射 200 µL。注射完成后拔出针头，并对注射部位施加压力。 
		注意：注射过程中尾巴出现轻微隆起表明针头位置不正确。若发生此情况，应拔出针头并在先前注射位点的近端重新操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在静脉注射后 24 和 48 小时，通过 体内 生物发光成像（BLI）（见步骤 2）检测基因表达情况。</li>
</ol>
2. 在体实验 生物发光成像
注意：提前配制15 mg/mL的D-荧光素新鲜储备液，使用0.22 µm滤器过滤除菌，并于-20 °C保存。
<ol>
	<li>将小鼠放入透明的聚甲基丙烯酸甲酯麻醉室中。确保异氟烷储罐已充满。准备麻醉动物时，打开泵（左侧）和麻醉室（右侧）的开关。诱导麻醉时将异氟烷调节至2.5%，维持麻醉时调节至2%。在IVIS成像系统中，动物成像过程中持续保持2.5%异氟烷麻醉。</li>
	<li>小鼠完全麻醉后，在成像前15分钟，以10 mL/kg体重的剂量经腹腔注射D-荧光素溶液。 
	注意：应进行D-荧光素的动力学研究，以确定给予D-荧光素后信号峰值出现的时间。</li>
	<li>打开 在体 成像系统及成像室准备：用一张黑色卡纸衬垫成像室内部（使用后丢弃）。根据需要放置鼻罩以实施正确麻醉（每只小鼠使用一个鼻罩）。 
	注意：供应麻醉气体至仪器的管路被分流，以确保相同浓度的麻醉气体被输送至成像系统内部的麻醉气体分配装置。</li>
	<li>将小鼠（最多5只）从盒子转移到成像系统中连接至多通管的鼻罩，并关闭门。图像采集持续5分钟。</li>
	<li>使用制造商提供的软件按照以下步骤获取BLI。
	<ol>
		<li>初始化软件。在 体内 成像系统采集控制面板，在其旁边打勾 发光的确认激发滤光片设置为阻断，发射滤光片设置为开放。</li>
		<li>单击箭头：在发光成像模式下，选择5分钟曝光时间、Binning值为8、F/Stop为1；在摄影成像模式下，选择Binning值为4、F/Stop为8。</li>
		<li>从“视野”下拉列表中选择 D，19 cm，并设置“对象高度”为 1.5 cm。准备就绪后，单击“采集”以获取图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集完成后，将小鼠放回其笼中。</li>
	<li>使用制造商提供的软件对特定区域发射的光子进行定量分析。
	<ol>
		<li>点击 ROI 工具 工具调色板中。在 ROI 工具，选择 测量感兴趣区域 从“类型”下拉列表中。</li>
		<li>单击方形图标，绘制一个具有适当尺寸的方形感兴趣区域（ROI），以覆盖一只动物的胸腔。复制并粘贴该感兴趣区域至每只动物，以获得尺寸相同的感兴趣区域。在感兴趣区域工具面板中，单击 测量 ROI 以获取感兴趣区域（ROI）内总强度的测量值。</li>
		<li>观察在会话期间于图像或序列中创建的所有 ROI（每个 ROI 占一行）的 ROI 测量数据。点击“导出”并选择文件保存的文件夹。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用促炎性刺激物对小鼠进行攻毒实验
注意：在小鼠接受促炎性刺激物攻击之前，通过i检查其基础激活状态n 体内 BLI（参见步骤2）。两次操作之间必须间隔至少7天。 体内 基因递送及小鼠攻毒，以待轻微且短暂的炎症消退。
<ol>
	<li>准备气管内滴注所需的设备（参见 图1 和 图2）。
	<ol>
		<li>将5 ml一次性注射器与弹簧（C，E）、100 µL注射器（B）以及一次性量表（D）连接至三通旋塞阀（A）。将该系统置于支架（H）上。将该系统置于支架（H）上。</li>
		<li>将PE190微型医用管路（F）连接至一次性量表（D）和笔式导管（G）。</li>
		<li>用800 µL空气填充5 mL注射器，并旋转三通旋塞阀。 
		注意：通过在100 µL注射器中吸取50 µL Pseudomonas aeruginosa 培养上清液，以填充管路。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于微细医用导管介入操作的手术器械装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：气管内装置单个组件的示意图。 
(A) 三通旋塞阀，(B) 100 µL Hamilton 注射器，(C) 一次性5 mL注射器，(D) 一次性测量计，(E) 带弹簧的一次性5 mL注射器，(F) PE190微细医用导管，(G) 笔式固定器，以及(H) 支撑装置。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于蛋白质纯化的体外过滤系统装置；突出显示注射器连接、夹具和滤膜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：组装好的经气管装置示意图。 
标识与图 1中相同。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>使用异氟烷蒸气室麻醉小鼠，异氟烷浓度设定为2.5%，以氧气作为混合气体。</li>
	<li>3 - 5 分钟后观察动物，评估麻醉效果。 
	注意：为确认小鼠已完全麻醉，需仔细观察以下体征：呼吸频率应明显减慢，提起颈部时无前肢伸展反应，以及刺激后肢时无反应。若上述标准未达到，需额外等待数分钟并再次检查，确认后方可进行下一步操作。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于亚克力玻璃插管平台上，使其门齿钩住金属丝，悬吊固定。</li>
	<li>用左手（对于惯用右手的研究者）打开喉镜，并取一把钝头镊子。利用喉镜的尖端和镊子轻轻撬开口腔。</li>
	<li>用镊子将舌头拉出并固定于一侧。将喉镜片朝向口腔后部引导。保持喉镜非常轻柔地向下按压于一个 90° 角度，直至气管开口可见。固定喉镜位置。</li>
	<li>用另一只手取与PE管末端相连的输送管，将其插入气管。旋转三通阀以输送接种物。尽快将管子从气管中拔出。将小鼠保持直立数秒钟，使接种物吸入肺部。 
	注意：若气管阻塞时间过长，小鼠将窒息死亡。</li>
	<li>将小鼠从平台上取下。恢复时间可能因品系而异；需密切观察小鼠，确保其在操作后30分钟内完全清醒。</li>
	<li>腹腔注射 150 mg/kg D-荧光素，随后使用活体成像系统对肺部进行成像 体内 在气管内给予刺激物后 4、24 和 48 小时，使用成像系统进行成像。利用制造商提供的软件定量分析特定区域发射的光子数。</li>
</ol>

<ol><li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+approaches+to+asthma-chronic+obstructive+pulmonary+disease+overlap+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes.</a> J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在之前的一项研究中11，已显示出bIL-8-Luc依赖性BLI与BAL标志物之间的差异，该差异依赖于不同小鼠品系间敏感性的不同程度12。因此，将bIL-8-Luc模型首次应用于另一种小鼠品系时，需要对炎症反应进行初步研究，包括BLI以及更为标准化的炎症标志物两方面。
小鼠转染可引起轻度肺部炎症及bIL-8-Luc的激活，该信号可通过生物发光成像（BLI）在DNA注射后3至4天内检测到。图41 周后完全消失1基因递送后，应始终通过检测 bIL-8-Luc 的表达来验证 体内 BLI，因为这是后续实验步骤成功所必需的条件。在转染7天后且对小鼠进行攻击前，应记录基线激活信号，以确认转染诱导的炎症已消失。
该方法已在炎症急性期进行过测试，但尚未在慢性期中得到验证。目前尚不清楚活体微生物攻击对此实验体系中所用启动子活性的影响。深入了解急性和慢性...

慢性肺部疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、囊性纤维化（CF）和支气管扩张症，其特征是气道炎症。气道炎症表现为水肿、细胞浸润、T淋巴细胞和肥大细胞活化、气道分泌物增加以及胶原过度沉积。囊性纤维化是一种多系统疾病，其发病和死亡的主要原因是肺部细菌感染，并伴随肺部急性加重的逐渐增多。肺功能的下降预示着显著更差的临床预后1,2,3,4。
呼吸道的炎症状态通常通过评估来自下呼吸道和上呼吸道样本（如痰液）中炎症过程中募集的免疫学标志物来观察，但结果存在可变性。此外，也可进行支气管镜检查5小鼠模型是研究以气道炎症为特征、且尚无有效治疗方法或治愈手段的疾病发病机制和演变过程的重要工具。肺部感染和炎症的动物模型已被用于研究哮喘以及宿主与病原体之间的相互作用，包括模拟人类疾病状态的化学物质的作用（例如， 香烟烟雾暴露，LPS，弹性蛋白酶，卵清蛋白，聚肌胞苷酸 等等。，以及上述方法的组合6测量炎症相关参数需要处死动物，因为必须采用侵入性方法来检测肺部细菌载量、细胞因子水平以及收集支气管肺泡灌洗（BAL）液。此外，通常还需进行组织学检查。若要获取炎症反应动力学的信息，则需要使用大量小鼠。因此，一种无需处死动物即可获得此类信息的技术，在技术、伦理、经济和操作层面均具有重要价值。
IL-8 在炎症过程中发挥关键作用，可招募白细胞至炎症组织，是研究炎症通路激活的分子读出指标。MIP-2 和 KC 可能是小鼠体内人源 IL-8 的功能同源物。小鼠仅表达一种潜在的 IL-8 受体，即人源 CXCR2 的同源物7,8，但其能够调控异源 IL-8 基因启动子驱动的报告基因。近期在发现牛源 IL-8 启动子/荧光素酶报告基因构建体可在小鼠体内发生转激活后，建立了一种肺部炎症小鼠模型。该特性使得可利用生物发光成像（BLI）在活体动物中监测炎症反应9。
该模型已用于研究由细菌外毒素（例如，脂多糖（LPS）或细菌菌株释放的产物）或TNFalpha10,11引发的炎症反应。药物研发的重点在于开发和优化新老抗炎分子，以治疗囊性纤维化（CF）、哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病。为了推动智能化临床试验的设计，这些新化学实体必须能够在动物模型中快速、便捷地进行测试，并与特定的临床表型相关联。

<table><tbody><tr><td>FMT 2500 荧光断层成像系统</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina serie II 前临床 &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; 成像系统</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>MMPsense 750 FAST</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>NEV10001EX</td><td>避光保存，探针储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>雌性近交系 BalbC 小鼠</td><td>Harlan Laboratories Italy</td><td></td><td>使用前，动物需在本地动物房条件下适应至少 5 天</td></tr><tr><td>bIL-8-Luc 质粒</td><td>意大利帕尔马大学医学兽医科学系</td><td></td><td>质粒储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>pGL3basic 载体</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td>载体储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>JetPEI DNA 转染试剂</td><td>Polyplus transfection</td><td>201B-001G</td><td>DNA 与 JetPEI 混合物的最终 N/P 比为 7</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐 1 g</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>122796</td><td>避光保存，储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Living Image 软件</td><td>Caliper Life Sciences,</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>ESTEVE spa</td><td>571329.8</td><td>避免吸入</td></tr><tr><td>Bio-Plex 细胞因子检测试剂盒</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>M60-009RDPD</td><td>未开封试剂盒储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Dasit XT 1800J</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>Penn-century DP-4M 型干粉吹入器</td><td>Penn-century</td><td>DPM-EXT</td><td></td></tr><tr><td>气体麻醉系统 XGI-8</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>PE190 微型医用导管</td><td>2biological instruments snc</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 无针头注射器</td><td>Terumo</td><td>SS*05SE1</td><td>用剪刀剪去活塞的边缘</td></tr><tr><td>Hamilton 0.10 mL（型号 1710）</td><td>Gastight</td><td>81022</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 三通旋塞阀</td><td>Braun</td><td>4095111</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 带针头注射器</td><td>Pic solution</td><td>3,071,260,300,320</td><td>使用时去除针头</td></tr><tr><td>塑料饲管 18ga × 50 mm</td><td>2biological instruments snc</td><td>FTP-18-50</td><td>将管尖斜向剪切&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于 体内 长期监测炎症反应

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

气道炎症常与细菌感染相关，是肺部疾病的重要决定因素。 体内 确定各种因素的促炎能力具有挑战性，需要进行终末性操作，例如支气管肺泡灌洗以及肺组织的摘除 原位 分析，从而无法在同一只小鼠中进行纵向观察。此处通过气管内灌注诱导肺部炎症 铜绿假单胞菌 在瞬时转基因小鼠中，于异源牛IL-8启动子调控下表达荧光素酶报告基因，收集其培养上清液（SN）。通过检测肺部荧光素酶的表达水平进行监测。 体内 在滴注后的2.5至48小时时间范围内进行生物发光成像（BLI）分析。该操作可在2至3个月内重复多次，从而可在无需处死动物的情况下对同一小鼠的炎症反应进行评估。该方法可实现实时监测肺部发挥促炎和抗炎作用的因子，适用于功能学及药理学研究。

bIL-8-Luc 瞬时转基因小鼠模型被用于 体内 监测用含分泌性毒力因子的浓缩细菌上清液（30倍浓度）攻击后小鼠的肺部炎症。所诱导的炎症反应可通过以下方法检测： 体内 成像表现为BLI信号增强。促炎活性在滴注后2.5小时即可明显检测到，尽管BLI信号在5至24小时之间达到最高峰值，并在48小时时仍可检测到（图3).
<img alt="活体小鼠随时间变化的成像，生物发光检测，光子发射结果，实验图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：代表性 体内 由肺部炎症成像 P. aeruginosa IL-8 瞬时转基因...

本文所述方法可通过非侵入性生物发光成像（BLI）技术，对小鼠肺部由IL-8启动子依赖性炎症激活进行可视化观察。在递送荧光素酶报告载体后，同一动物可在长达两个月的时间内多次接受BLI检测。

气道炎症常与细菌感染相关，是肺部疾病的重要决定因素。体内测定……

本实验的总体目标是在小鼠接受细菌培养上清液等促炎刺激物的非侵入性刺激后，实时监测其肺部炎症反应。该方法有助于解答有关宿主-病原体相互作用的具体问题，例如哪些细菌产物导致呼吸系统感染疾病。该技术的主要优势在于其非侵入性，且可对同一批动物在不同时间点进行重复监测。该方法的可视化演示非常重要，因为仅通过文字难以掌握安装步骤。实验操作将由本研究小组的外部合作者Francesca Ruscitti、Angela Sandri和Federico Boschi进行演示。进行体内基因递送时，首先将核酸复合物恢复至室温。接下来，将实验动物的尾巴置于50至53摄氏度的水中加热30秒。当尾静脉扩张后，将小鼠放入适当的固定装置中，以20至30度的角度将27至30号针头插入扩张的尾静脉，注入200 µL复合物。待全部液体注射完毕后，拔出针头并对注射部位施加压力。在注射后24至48小时，于活体成像前15分钟，向最多五只完全麻醉的复合注射动物腹腔内注射每千克体重10毫升的新鲜配制的D-荧光素。打开活体成像系统，将一张黑色卡纸放入成像室，然后将小鼠置入成像室中。打开活体成像系统软件并初始化系统。在发光项前打勾，并确认激发滤光片设置为阻断，发射滤光游戏副本设置为开启。对于发光成像模式，选择曝光时间为五分钟，binning 为八，F/Stop 为一。对于拍照成像模式，选择 binning 为四，F/Stop 为八。在视野菜单下，选择 D 视野，其面积为 19 厘米 × 19 厘米，样本高度为 1.5 厘米。所有参数设置完成后，点击“采集”以成像动物。成像完成后，将动物送回笼中，并在监测下观察至完全恢复。为了定量分析特定感兴趣区域发射的光子，请打开成像系统软件并选择感兴趣区域工具。在类型菜单中，选择“测量用感兴趣区域”，使用方形工具在一只动物的胸部周围绘制一个方形感兴趣区域。将该感兴趣区域复制并粘贴到其他每只动物身上，以生成尺寸相同的感兴趣区域，然后点击“测量感兴趣区域”以测定所有感兴趣区域的总强度。然后点击“导出”并选择保存感兴趣区域测量数据的文件夹。体内基因递送至少七天后，将5毫升注射器与弹簧、100微升Hamilton注射器及一次性套管通过三通阀连接。将一段PE 190微型医用导管连接至一次性套管和Pen Sentry针头。用5毫升注射器抽取800微升空气。旋转三通阀，用100微升注射器吸取试管中的上清液，然后将麻醉后的实验小鼠放入有机玻璃气管插管平台中，并用门齿固定动物。用非优势手打开喉镜，另一只手使用钝头镊子，并借助喉镜的尖端轻轻撬开小鼠口腔。用镊子将舌头拉向一侧，并引导喉镜片进入口腔后部。以90度的向下角度非常轻柔地按压喉镜，直至可见气管开口。用另一只手将连接在PE管末端的输送管插入气管，然后旋转三通阀以注入铜绿假单胞菌接种物，在接种物完全注入后立即迅速拔出导管。将小鼠保持直立状态数秒钟，以使接种物吸入肺部。最后，向接种动物腹腔注射150毫克/千克的D- Luciferin，并在气管刺激接种后的4、24和48小时，利用活体成像系统对肺部进行成像，随后按前述方法进行光子定量。此处，采用生物发光成像对经浓缩细菌上清液（含分泌型毒力因子）刺激的牛白细胞介素-8荧光素酶瞬时转基因BALB/c小鼠肺部炎症进行实时活体监测，方法如前所述。诱导的炎症反应在植入后2.5小时即可通过生物发光信号的增强被检测到，光子发射在5至24小时之间达到峰值，并在刺激后至少48小时内仍可检测。完成该操作后，可进一步开展支气管肺泡灌洗等其他方法，以探究治疗后产生的免疫细胞数量及类型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在小鼠中建立肺部炎症模型，并利用生物发光成像技术在活体中对其进行实时监测。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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眼表炎症会损害眼表组织，并影响眼睛的重要功能。本实验方案描述了一种在睑板腺功能障碍（MGD）小鼠模型中诱导眼表炎症并采集受损组织的方法。...

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了解利用非侵入性生物发光成像技术在小鼠体内长期监测IL-8启动子依赖性肺部炎症激活的方法。该技术可在两个月内对同一动物进行重复评估，实时追踪炎症动态变化，为研究宿主-病原体相互作用和呼吸道疾病机制提供重要工具。

一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于体内长期监测炎症反应

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一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于 体内 长期监测炎症反应

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