Name: 在肉瘤细胞间质上皮转变的诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习利用microRNA-200家族与GRHL2诱导肉瘤细胞间质上皮转变的方法，研究表型可塑性对癌症侵袭性的影响，为开发新型治疗策略提供可重复的实验手段。

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JAS 感谢杜克癌症研究所、杜克大学泌尿生殖系统肿瘤实验室以及杜克大学骨科系的支持。HL 获得美国国家科学基金会（NSF）理论生物物理学中心（NSF PHY-1427654）和 NSF DMS-1361411 的资助，并获莱斯大学德克萨斯州癌症预防与研究所（CPRIT）癌症研究学者项目支持。KEW 获美国国立卫生研究院（NIH）F32 CA192630 奖项资助。MKJ 和 HL 从与 Mary C. Farach-Carson、J. N. Onuchic、Samir M. Hanash、Kenneth J. Pienta 以及 Donald S. Coffey 的有益讨论中获益。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>通过向500 mL DMEM中加入50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素-链霉素溶液（5,000 U/mL）来配制细胞培养用DMEM。该培养基可在4 °C保存长达六个月。</li>
	<li>用无核酸酶水重悬冻干引物，使其终浓度为10 µM。将重悬后的引物储存在-20 °C。</li>
	<li>配制放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（150 mM NaCl、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS、50 mM Tris，pH 8.0）。使用前加入蛋白酶抑制剂混合物，并在使用过程中将缓冲液置于冰上。4 °C保存。</li>
	<li>将聚凝胺（hexadimethrine bromide）以水配制成10 mg/mL溶液，并使用0.45 µm聚醚砜滤膜通过注射器滤器进行除菌过滤。溶液可在4 °C保存长达六个月。</li>
	<li>将10 mg硝基蓝四氮唑氯化物溶于10 mL PBS中，配制成1 mg/mL的工作溶液。4 °C保存。</li>
</ol>
2. GRHL2 的慢病毒转导
第1天
<ol>
	<li>在6孔板的每孔中接种3 × 105个HEK293T细胞，加入2 mL含补充物的DMEM培养基。使用自动细胞计数仪对细胞进行定量。在37 °C、5% CO2条件下过夜培养后，细胞融合度应达到40–60%。</li>
</ol>
第2天
<ol start="2">
	<li>在200 µL无血清培养基中稀释2 µg空载体（pCMV-UBC-EGFP）或2 µg pCMV-GRHL2-UBC-EGFP24,25，同时加入1.8 µg pΔ8.9和0.2 µg pCMV-VSV-G辅助质粒。另取一管，每转染样本用200 µL无血清培养基稀释4 µL脂质体转染试剂（两个样本则用400 µL稀释8 µL）。将200 µL转染试剂混合物加入各质粒溶液中，室温孵育20分钟。</li>
	<li>孵育期间，通过真空抽吸弃去培养基，并用1 mL PBS洗涤HEK293T细胞，随后弃去PBS并加入800 µL无血清培养基。20分钟后，将步骤2.2中得到的200 µL转染试剂:质粒混合物逐滴加入每孔中，于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
	<li>小心通过真空抽吸去除转染培养基，更换为2 mL含补加物的DMEM培养基。将细胞放回培养箱中过夜培养。 
	&#8203;注意：HEK293T细胞贴壁较松。更换培养基时需格外小心，以尽量减少细胞从培养皿或培养瓶底部脱落。</li>
</ol>
第3天
<ol start="5">
	<li>更换转染后的 HEK293T 细胞的培养基，并在 2 mL 添加物补充的 DMEM 中，将 3 × 105 个 RD 细胞接种至 6 孔板的每个孔中。过夜培养细胞。RD 细胞是一种 commercially-available 的人横纹肌肉瘤细胞系。</li>
</ol>
第4天
<ol start="6">
	<li>收集HEK293T细胞的病毒上清。用移液器将HEK293T细胞中的DMEM培养基转移至新的15 mL离心管中。小心更换为新的DMEM培养基，并将HEK293T细胞放回培养箱中继续培养至第二天。</li>
	<li>在两个新的50 mL离心管中（一个用于空载体转染，另一个用于GRHL2转染），每毫升病毒上清中加入2 µL的10 mg/mL聚凝胺。通过从3 mL注射器中取出活塞，并在针头处连接一个0.45 µm聚醚砜滤器，对病毒上清进行注射器过滤。
	<ol>
		<li>将步骤2.6中收集的病毒上清加入注射器筒内，推动活塞将上清注入含有聚凝胺的50 mL离心管中。用真空抽吸法去除RD细胞中的培养基，然后向RD细胞中加入过滤后的病毒上清。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第5天
<ol start="8">
	<li>重复第4天的操作。收集病毒液后，可弃去HEK293T细胞。</li>
</ol>
第7天
<ol start="9">
	<li>用 1 mL PBS 清洗 RD 细胞，每孔加入 200 µL 0.05% 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 5 分钟，加入 2 mL 完全培养基，将细胞悬液转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中。在室温下以 250 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。用 1 mL DMEM（添加 5% FBS 和 1% 青霉素-链霉素）重悬细胞。 
	&#8203;注意：使用更高浓度的 FBS 可能在流式细胞术过程中引起堵塞
	<ol>
		<li>对细胞进行流式细胞术过滤。用移液器将 1 mL RD 细胞悬液通过 30 µm 滤膜加入流式细胞术管中，并将管子置于冰上。</li>
		<li>将 EGFP+ 细胞26 分选至含有 0.5 mL DMEM（添加 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素）的 1.5 mL 微量离心管中，置于冰上。将分选后的 EGFP+ 细胞以总共 1 mL 完全 DMEM 接种至 12 孔板的一个孔中，并放入培养箱中进行培养。 
		&#8203;注意：在此转导后，通过流式细胞术获得的 EGFP+ 细胞产量通常较低（50,000–100,000 个细胞）。在进入步骤 3 之前，可能需要将细胞培养 10–14 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. miR-200s 的逆转录转染
<ol>
	<li>使用无核酸酶的 H2O 配制 50 µM 的 miR-200 模拟物储备液。将储备液分装后于 -20 °C 保存，以避免反复冻融。</li>
	<li>将每种 50 µM 的 miR-200 模拟物（miR-200a、miR-200b 和 miR-200c）各取 3 µL 加入 300 µL 无血清培养基中，或取 9 µL 的 50 µM 阴性对照 miRNA 加入 300 µL 无血清培养基中。</li>
	<li>将 6 µL 的 siRNA 特异性转染试剂加入 600 µL 无血清培养基中，混匀后将 300 µL 该混合液分别加入两个离心管中，用于与步骤 3.2 中的两种 miR 混合物分别结合。将步骤 3.2 中的每种 300 µL miR 混合液与 300 µL 转染试剂混合液合并，室温孵育 20 分钟。</li>
	<li>在孵育期间，将第 2 部分中构建的表达 EV 或 GRHL2 的 EGFP+ RD 细胞以 600,000 个细胞/2.4 mL（250 个细胞/µL）的密度重悬于无血清培养基中，每种处理各准备一份。</li>
	<li>在 24 孔板中，将步骤 3.3 中的 miR-200 混合液或阴性对照混合液各取 100 µL 加入六个孔中，随后将每种细胞悬液各取 400 µL 分别加入对应 miR 混合液的三个孔中。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜，次日更换为完全补充的 DMEM 培养基。两天后收集细胞，使用适当的缓冲液进行分析（见下文）。RD 肉瘤细胞发生 MET 过程的时间序列成像作为补充材料提供。使用自动活细胞成像仪27，以 10X 物镜每 2 小时对每个孔进行一次成像。</li>
</ol>
4. RNA 提取、逆转录和 qPCR
<ol>
	<li>使用标准RNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取RNA24。提取的RNA可在-80 °C下长期保存。</li>
	<li>测定RNA浓度。将RNA样品在冰上解冻并操作。为测定RNA浓度，根据制造商方案，使用酶标仪分光光度计在260 nm处测量紫外吸光度。用无核酸酶水将所有样品稀释至最低浓度。</li>
	<li>将总RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。在20 µL反应体系中，加入不少于100 ng的总RNA，以及PCR缓冲液、dNTP混合物（100 mM）、随机六聚体引物、逆转录酶和无核酸酶水24。按照制造商方案运行逆转录（RT）程序。cDNA可在-20 °C下长期保存。</li>
	<li>向20 µL反应体系中加入80 µL无核酸酶H2O，稀释至总体积100 µL。</li>
	<li>每份样品中加入5 µL基于荧光嵌入染料的2x qPCR预混液、0.06 µL的10 µM正向和反向引物各一种，以及2 µL稀释后的逆转录反应产物，混匀。</li>
	<li>按照基于荧光的预混液制造商方案运行qPCR程序。</li>
	<li>采用ΔCT法计算mRNA的相对含量，并以GAPDH作为内参进行归一化。对每个处理组的生物学重复样本，绘制平均mRNA表达量±标准差的图表。 
	注意：操作RNA时应采取特殊预防措施，避免接触RNase，例如使用无RNase的塑料制品和试剂。非一次性使用的实验设备在使用前应进行处理以去除RNase。</li>
</ol>
5. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>完成步骤 3.6 后，使用真空抽吸法从 24 孔板中的 RD 细胞中吸除培养基。</li>
	<li>每孔加入 500 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞，在室温（RT）下孵育 15 分钟。固定完成后，将细胞置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，如需可于 4 °C 下保存过夜。</li>
	<li>每孔加入 500 µL 含 0.2% Triton-X100 的 PBS（PBS+0.2% Triton-X100），在室温下孵育 30 分钟以通透细胞。使用真空抽吸法去除通透液，并用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>每孔加入 500 µL 含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 进行封闭，在室温下孵育 30 分钟。如需可于 4 °C 下保存过夜。</li>
	<li>配制一抗稀释液。每孔取 200 µL 含 5% BSA 的 PBS 加入 15 mL 圆底离心管中（12 孔共需 2.4 mL），每毫升 5% BSA/PBS 中加入 1 µL 一抗。使用真空抽吸法去除封闭液，每孔加入 200 µL 稀释后的一抗。
	<ol>
		<li>在含 5% BSA/PBS 的溶液中，以 1:1,000 稀释比例加入一抗，于室温孵育 1 小时，或于 4 °C 过夜。孵育结束后，用 PBS 洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以与上述相同体积的 5% BSA/PBS 配制二抗稀释液。使用 1:2,000 的稀释比例加入远红外荧光染料标记的二抗，同时在混合液中加入 1 µg/mL 的 Hoechst 染料。吸除 PBS 后，每孔加入 200 µL 混合液。
	<ol>
		<li>在避光条件下于室温孵育 1 小时，用 PBS 洗涤三次，将细胞保留在 PBS 中，并用铝箔包裹避光。如需可于 4 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在倒置落射荧光显微镜下，使用 594–650 nm 激发波长，以总放大倍数 400X 对细胞进行成像。</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹法
<ol>
	<li>用预冷的 PBS 将 3.6 中的细胞洗涤两次。在冰上，加入 50 µL 含 1x 蛋白酶抑制剂混合液的 1x RIPA 裂解缓冲液裂解细胞。</li>
	<li>在 4 °C 下轻轻摇动裂解物 15 分钟，将裂解物收集至 1.5 mL 离心管中，然后以高速（20,000 × g）离心 5 分钟以澄清样品。如需长期保存，细胞裂解物可存放于 -80 °C。</li>
	<li>使用 Bradford 法测定总蛋白浓度，并将等量蛋白分装至新的 1.5 mL 微量离心管中。用 RIPA 缓冲液和含 2-巯基乙醇的 3x Laemmli 上样缓冲液将各样品补至相同体积。</li>
	<li>将样品在 1x Laemmli 上样缓冲液中于 95 °C 孵育 5 分钟，随后在 4–12% Tris-甘氨酸凝胶上以 200 V 电泳 45 分钟进行 SDS-PAGE。上样蛋白量因细胞系而异；在某些情况下，检测间充质细胞系中的 E-钙黏蛋白需上样 50–100 µg 总蛋白。</li>
	<li>在 1x Tris-甘氨酸转移缓冲液中，以 50 V 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，持续 2 小时。</li>
	<li>用基于 BSA 的封闭缓冲液在室温封闭膜 1 小时，或在 4 °C 过夜封闭。</li>
	<li>将一抗用 5 mL 封闭缓冲液按 1:1,000 比例稀释，加至膜上，在室温轻柔摇动孵育 1 小时，或在 4 °C 过夜孵育。用含 0.05% Tween-20 的 PBS 洗涤膜 3 次。</li>
	<li>将膜在室温下与红外荧光标记的二抗孵育 1 小时，二抗按 1:20,000 比例稀释于上述封闭缓冲液中。</li>
	<li>用含 0.05% Tween-20 的 PBS 洗涤膜两次，再用 PBS 洗涤一次。</li>
	<li>使用标准红外荧光检测系统对膜成像。</li>
</ol>
7. 非贴壁依赖性生长实验
注意：有关软琼脂实验方案的详细信息，请参见28。
<ol>
	<li>将无菌的2倍浓度DMEM培养基在42 °C水浴中预热。在此期间，将预先高压灭菌的1%琼脂糖放入微波炉中加热3分钟，必要时每次再加热30秒，直至完全融化。随后将琼脂糖转移至42 °C水浴中。</li>
	<li>在无菌操作台中，将一个50 mL锥形管置于盛有42 °C水的烧杯内，按1:1比例混合1%琼脂糖与2倍浓度DMEM培养基，每孔6孔板需准备1.5 mL混合液。为避免移液误差和气泡产生，始终额外多准备一些DMEM/琼脂糖混合液。</li>
	<li>将混合液沿孔壁加入，确保无气泡形成，并在室温下静置30分钟。</li>
	<li>在底层凝固的同时，对第3步中转染的各组RD细胞进行处理：吸除培养基，用1 mL PBS洗涤一次，吸除PBS后加入0.2 mL 0.05%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>用0.8 mL培养基中和胰蛋白酶，并吹打细胞使其形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>计数细胞，并计算每孔接种10,000个细胞所需的细胞悬液体积。</li>
	<li>将0.6%琼脂糖放入微波炉中加热3分钟，之后每次加热30秒，直至完全融化。将琼脂糖转移至42 °C水浴中。</li>
	<li>在无菌操作台中，将一个50 mL锥形管置于盛有42 °C水的烧杯内。按1:1比例混合0.6%琼脂糖与稀释后的细胞悬液，每孔6孔板准备1.5 mL混合液。为避免移液误差和气泡产生，始终额外多准备一些细胞悬液/琼脂糖混合液。 
	&#8203;注意：此步骤必须在42 °C下操作。温度过低会导致混合液在接种前过早凝固，而高于42 °C则会影响细胞活力。</li>
	<li>通过多次吹打充分混匀细胞，将细胞混合液加入各孔中，确保无气泡形成，并在室温下静置20分钟使其凝固。</li>
	<li>每孔加入2 mL含补充物的培养基，将培养板转移至培养箱中。
	<ol>
		<li>每周更换一次培养基，持续3–4周，或直至形成多细胞克隆。吸除培养基时需小心，避免用真空抽吸触碰琼脂层。也可使用P1000移液器移除上层液体培养基。</li>
		<li>通过加入200 µL硝基蓝四氮唑氯化物溶液（1 mg/mL溶于PBS）对软琼脂平板进行染色，并于37 °C孵育过夜。次日用PBS替换培养基以进行成像。</li>
		<li>在倒置显微镜下以40倍总放大倍数对各孔进行成像。</li>
		<li>使用ImageJ软件分析克隆面积和数量。绘制生物学重复实验的平均克隆数±标准差图表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肉瘤是一种罕见但具有高度侵袭性的间充质来源肿瘤。尽管起源于间充质谱系，部分肉瘤似乎会发生表型转变，进入更接近上皮样的状态。这种类似MET（间充质-上皮转化）的转换具有预后意义，表现为上皮样特征更强的肿瘤患者其疾病侵袭性较低24。尽管这一现象具有临床相关性，目前仍鲜有研究探讨驱动肉瘤中这些表型转变的分子机制。
为了研究肉瘤细胞中的类似上皮转化（MET）过程，我们通过联合表达上皮因子GRHL2和miR-200家族，建立了一种MET诱导模型。该方法可快速诱导肉瘤细胞向更接近上皮样状态转变，这一转变可通过细胞形态和基因表达的变化加以测定。利用本方案在肉瘤细胞中诱导MET，有助于研究这些转化对驱动肉瘤侵袭性表型（如迁移、侵袭、增殖和抗凋亡）的影响，以及这些生物学变化如何影响药物耐药性。
在上皮来源的癌中，表达一种间充质因子通常就足以诱导EMT14。然而，在这种肉瘤来源的MET模型中，需要同时表达两种上皮因子GRHL2和miR-200s。有趣的...

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Shenghan Xu
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Shengnan Xu

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

表型可塑性是指细胞表型之间可逆的转变，通常分为两种类型：上皮-间质转化（EMT）和间质-上皮转化（MET）。这种表型可塑性在多细胞生物的正常生理过程中发挥重要作用，例如发育和伤口愈合1；然而，相同的通路和基因表达程序也可能导致疾病，如纤维化（综述见2,3,4）和癌转移（综述见参考文献5,6,7,8）。例如，在转移过程中，EMT会破坏细胞极性和细胞间相互作用，并促进侵袭9,10。总体而言，EMT有助于形成一种促进癌细胞播散的表型状态。此外，EMT还会引发一系列其他表型改变，从而驱动更具侵袭性的表型，包括癌细胞代谢失调6、耐药性形成11,12、肿瘤起始能力增强13,14以及逃避免疫系统监视15。
表型可塑性在癌进展中已被广泛研究；然而，肉瘤也表现出表型可塑性。有趣的是，似乎某些驱动癌表型可塑性的相同因素也参与了肉瘤的可塑性与侵袭性。例如，已发现来自肉瘤患者的循环肿瘤细胞（CTCs）表达EpCAM，这是一种通常存在于上皮细胞表面的蛋白质16。此外，250例软组织肉瘤样本根据基因表达被分类为上皮样或间质样。具有上皮样生物标志物特征的患者预后优于具有间质样生物标志物特征的患者17。这与多种癌一致：相较于具有更强间质样特征的肿瘤患者，具有更强上皮样特征的癌患者预后更好18。
尽管某些肉瘤表现出与间质-上皮转化（MET）一致的生物标志物和基因表达通路，但这种表型可塑性的分子基础仍不清楚。为了研究肉瘤中MET的机制和驱动因素，我们建立了一个MET诱导模型，使用了两个上皮特异性因子：microRNA（miR）-200家族和grainyhead样2（GRHL2）。miR-200是一类小分子非编码RNA，通过与信使RNA的3'非翻译区（3' UTR）结合，阻止其翻译成蛋白质，从而调控基因表达。miR-200家族包含两个亚组：一个包含miR-141和miR-200a，另一个包含miR-200b、miR-200c和miR-429。&#160;miR-200b、miR-200c 和 miR-429。miR-200 家族成员在上皮组织中富集，miR-200 的缺失与癌瘤的转移相关19miR-200 家族在软组织肉瘤中相较于正常组织也呈下调状态20与miR-200家族类似，GRHL2是上皮发育过程中的一个关键调控因子21GRHL2 转录因子通过两种方式上调上皮基因（如 E-cadherin）：1）在上皮细胞中，GRHL2 直接抑制 EMT 主要调控因子 ZEB122；以及 2) GRHL2 直接激活上皮基因的转录23我们之前的研究表明，在肉瘤细胞中共同表达miR-200s和GRHL2可诱导类似MET的表型24在此，我们提供了一种详细的方案，用于构建一个 体外 使用miR-200s和GRHL2异位表达构建肉瘤细胞中MET诱导的模型

<table><tbody><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>生命技术</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp 梯度PCR仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR 微孔板</td><td>康宁</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Fast Universal qPCR 试剂盒</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>起始阻断缓冲液（PBS）阻断缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>基于BSA的封闭缓冲液</td></tr><tr><td>低电渗琼脂糖</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/甘氨酸/SDS缓冲液</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>161-0732</td><td>运行缓冲液</td></tr><tr><td>10x Tris/甘氨酸缓冲液</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>161-0734</td><td>转移缓冲液</td></tr><tr><td>RIPA缓冲液</td><td>Sigma生命科学</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &amp;mu;m 硝酸纤维素</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep 试剂盒</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 样品缓冲液 (4X)</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot 转印系统</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra 电泳槽</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>生命技术</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>生命技术</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA模拟物阴性对照#1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>hsa-miR-200 mirVana miRNA 模拟物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA 模拟物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA 模拟物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>无血清培养基</td></tr><tr><td>抗E-cadherin抗体</td><td>BD生物科学</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>抗β-肌动蛋白</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>抗EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>抗ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR 公司</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR 公司</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 AlexaFluor 647</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 AlexaFluor 647</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 双色蛋白标准品</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>希森美康</td><td>04-004-2326</td><td>30 &amp;mu;m 滤膜用于流式</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>硝基蓝四氮唑&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>六亚甲基溴化物</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>polybrene</td></tr><tr><td>3 mL注射器</td><td>BD生物科学</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚丙烯圆底管</td><td>352063</td><td></td><td>流式细胞术管</td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4368814</td><td>逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

肉瘤细胞中诱导间充质-上皮转化

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

表型可塑性是指细胞短暂获得其他谱系特征的一种现象。在癌进展过程中，表型可塑性驱动了肿瘤的侵袭、播散和转移。事实上，尽管大多数关于表型可塑性的研究集中在上皮来源的癌，但研究发现起源于间充质组织的肉瘤也表现出表型可塑性，其中一部分肉瘤会发生类似于间充质-上皮转化（MET）的现象。在此，我们建立了一种利用miR-200家族和grainyhead样2（GRHL2）的方法，以模拟在肉瘤患者样本中观察到的这种类似MET的现象。我们分别通过细胞转导和转染依次表达GRHL2和miR-200家族，以更深入地理解肉瘤细胞中这些表型转变的分子基础。表达miR-200和GRHL2的肉瘤细胞在细胞形态上表现出增强的上皮特征，并伴有上皮和间充质生物标志物的改变。未来利用该方法的研究可进一步阐明类似MET过程对肉瘤细胞表型的影响，例如迁移、侵袭、转移倾向以及治疗耐药性。

肉瘤细胞中MET诱导的示意图
肉瘤细胞中诱导发生类似MET变化的一般时间线如图1所示。该实验方案首先转导GRHL2（图1A），随后转染miR-200家族成员（图1B）。单独表达GRHL2或miR-200家族成员均无法影响RD细胞的形态，但同时异位表达GRHL2和miR-200家族则可导致RD细胞出现类似上皮样的形态学改变。细胞从梭形转变为更圆润的形态，并表现出增强的细胞间接触（图1C）。
诱导肉瘤细胞发生类似MET的改变
在RD细胞中，GRHL2和miR-200过表达引起的形态学改变伴随着上...

本文介绍一种基于过表达miR-200家族成员与grainyhead样2（GRHL2）来诱导肉瘤细胞发生间充质-上皮转化（MET）的细胞培养方法。该方法适用于深入理解表型可塑性对癌症侵袭性及治疗反应的生物学影响。

表型可塑性是指细胞短暂获得其他谱系特征的一种现象。在癌进展过程中，表型可塑性……

本实验的总体目标是研究间充质-上皮转化在肉瘤中的表型效应。该方法有助于解答关键问题，例如为何类上皮型肉瘤的预后优于类间充质型肉瘤。该技术的主要优势在于，它提供了一种简便且可重复的方法，用于研究与肉瘤中发生间充质-上皮转化相关的下游基因调控网络及表型特征。通过更深入地理解肉瘤中的表型可塑性，我们希望发现能够将肉瘤转变为更具惰性的上皮样状态的治疗干预手段。本次实验操作将由本实验室的两名本科生 Jackson Xu 和 Shivee Gilja 演示。在转导的第一天，将 HEK293T 细胞以每孔 3 × 10⁵ 个细胞的数量接种于六孔板中的两孔内，每孔加入 2 mL 添加补充物的 DMEM 培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。过夜培养后，在显微镜下观察细胞，其融合度应达到40%至60%。接下来，在含有200微升无血清培养基的单独离心管中，分别加入1.8微克p delta 8.9质粒和0.2微克pCMV-VSV-G辅助质粒，再分别稀释2微克空载载体和2微克含有GRHL2的载体。另取一支离心管，每转染样本用200微升无血清培养基稀释4微升脂质体转染试剂。两个样本共需8微升转染试剂和400微升无血清培养基。向每种质粒溶液中加入200微升转染试剂混合物，然后在室温下孵育20分钟。与此同时，使用真空抽滤器吸除HEK293T细胞中的培养基。用1毫升PBS清洗细胞一次，然后将PBS替换为800微升无血清培养基。20分钟后，将400微升转染试剂-质粒混合物逐滴加入至接种细胞的每孔中。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时。孵育结束后，通过真空抽吸小心移除转染培养基。HEK293T 细胞为松散贴壁细胞，因此在吸除培养基时需小心，避免将细胞从培养皿或培养瓶底部移除。用两毫升添加了补加物的 DMEM 培养基替换吸除的培养基。将细胞放回培养箱中进行过夜培养。第二天，更换转染后的 HEK293T 细胞的培养基，然后在六孔板的每孔中接种 3 × 10⁵ 个 RD 人横纹肌肉瘤细胞，每孔加入 2 毫升含补充物的 DMEM 培养基。将两块培养板均在培养箱中过夜培养。第四天，使用移液器收集 HEK293T 细胞的病毒上清液，并将其转移至两个新的 15 毫升锥形管中，其中一管用于含有空载体的慢病毒，另一管用于含有 GRHL2 质粒的慢病毒。小心更换为新鲜的 DMEM 培养基，并将 HEK293T 细胞放回培养箱中孵育过夜。接下来，向两个新的 50 毫升锥形管中每毫升病毒培养基加入 2 微升 10 毫克/毫升的聚凝素（polybrene），其中一个用于空载体转染，另一个用于 GRHL2 转染。取下 3 毫升注射器的活塞，并在注射器前端连接一个 0.45 微米的聚醚砜（polyethersulfone）滤器。将先前收集的病毒上清液加入注射器筒内，然后注入含有聚凝胺的新的50毫升锥形管中。对另一个样本重复此步骤。随后，通过真空抽吸法去除RD细胞中的培养基，并将每种过滤后的病毒上清液各两毫升分别加入RD培养板的不同孔中。将RD细胞置于37摄氏度的湿润培养箱中孵育。次日，重复收集病毒培养基，并将感染培养基加入含有先前已感染RD细胞的相同孔中。在收集病毒培养基后，可弃去HEK293T细胞。继续培养细胞两天。第7天时，用1毫升PBS洗涤RD细胞，然后每孔加入200微升0.05%胰蛋白酶。在37摄氏度孵育5分钟。加入2毫升添加了补剂的培养基，然后将细胞悬液转移至新的15毫升锥形管中。在室温下以250 g离心5分钟。离心结束后，吸除上清培养基，并将细胞重悬于1毫升添加了5% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。为进行流式细胞术前过滤细胞，使用移液器将一毫升 RD 细胞悬液通过无菌的 30 微米管顶滤器加入流式细胞术管中。将管子置于冰上。使用流式细胞仪将 EGFP 阳性细胞分选至含有 0.5 毫升添加了 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 的 1.5 毫升微量离心管中。将分选后的细胞放回冰上。将空载体和GRHL2转导的EGFP阳性细胞分别接种于12孔板的不同孔中，每孔加入总体积为一毫升的含补充物的DMEM培养基。然后将细胞放入培养箱中进行培养。流式细胞术分选后获得的EGFP阳性细胞产量通常较低，约为50,000至100,000个细胞。因此，在进行下一步操作前，可能需要将细胞额外培养10至14天。在微量离心管中，将3微升每种50微摩尔的miR-200模拟物加入300微升无血清培养基中。在另一个离心管中，将9微升50微摩尔的阴性对照微小RNA加入300微升无血清培养基中。接着，在另一微量离心管中，将6微升特异性siRNA转染试剂加入600微升无血清培养基中。将该混合液取300微升均分为两份，分别加入两个含有miR混合物的离心管中，每管一份。将每种miR混合物的300微升与300微升转染试剂混合液混合，在室温下孵育20分钟。孵育期间，每种处理组用无血清培养基制备600,000个表达MD载体或GRHL2的EGFP阳性RD细胞悬液，总体积为2.4毫升，细胞密度为每微升250个细胞。在24孔板中，向6个孔中每孔加入100微升miR-200或阴性对照混合液。然后将每种细胞悬液各400微升分别加入每种miR混合液的三个孔中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。第二天，更换为完全补充的 DMEM 培养基。再过两天后，用适当的缓冲液收集细胞进行分析。使用自动活细胞成像仪，以 10X 物镜每两小时对每个孔成像一次。这些延时图像显示了表达 GRHL2、EGFP 和 miR-200 miRNA 的 RD 细胞中的间充质-上皮转化（MET）。细胞形态由纺锤形转变为铺路石样，细胞间黏附增强，形态更加圆润。在其他处理条件下未观察到 MET 现象。相反，细胞呈现细长的纺锤形形态，细胞间连接较少。在MET诱导过程中，RD细胞在GRHL2和miR-200过表达后发生的形态学变化，伴随上皮标志物E-cadherin的上调，该结果通过qPCR和蛋白质印迹法测定证实。单独添加miR-200即可上调E-cadherin，而miR-200s与GRHL2共同过表达则协同增强E-cadherin的表达。免疫荧光显微镜结果显示，上皮细胞黏附分子 EpCAM 和 TJP-1 在细胞间连接处表达增加，白色箭头所示。上皮蛋白的上调伴随间充质基因 ZEB1 和 Notch1 的表达下调，qRT-PCR 检测证实了这一结果。通过软琼脂生长实验测定，MET 的诱导降低了 RD 细胞的非贴壁依赖性生长能力。软琼脂中的生长抑制仅由miR-200s介导，而GRHL2的过表达则导致锚定非依赖性生长增加。这与先前报道一致，即GRHL2的表达可诱导锚定非依赖性生长。按照此方法，还可进一步开展其他实验，包括检测细胞迁移、侵袭、转移能力以及对治疗反应的变化，以阐明间叶源性肿瘤中发生MET的表型后果。

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上皮-间质转化（EMT）使癌症细胞获得侵袭能力。为研究EMT，可采用基于神经干细胞（NSC）的方法 体外...

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究

直接注射癌源性细胞外囊泡（EVs）可导致骨髓重编程，从而促进肿瘤进展；然而，介导这一效应的具体细胞类型尚不明确。本文中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，用于研究EV介导的肿瘤-间充质干细胞（MSC）相互作用。...

一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型

我们描述了一种通过荧光激活细胞分选法从人源异种移植性肉瘤组织中分离肿瘤起始细胞的详细方案，该方法以人白细胞抗原-1（HLA-1）作为阴性标记物，并进一步对这些HLA-1阴性的肿瘤起始细胞进行验证和表征。...

从肉瘤患者来源的异种移植瘤中分离与表征肿瘤起始细胞

体外诱导内皮-间充质转化（EndMT）的实验方案，可用于研究参与EndMT的细胞信号通路。在此实验模型中，通过TGF-β处理MS-1内皮细胞以诱导EndMT。...

转化生长因子-β信号诱导的内皮-间充质转化的分子分析

骨细胞外基质（BEM）骨肉瘤（OS）模型已得到充分建立，如图所示。该模型可作为模拟原发性肿瘤生长的合适支架 体外...

三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

我们描述了一种系统性工作流程，通过研究TGF-β信号通路中涉及的蛋白和基因表达，来探究TGF-β信号传导及TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）。该方法包括蛋白质印迹（Western...

研究乳腺癌及正常细胞中TGF-β信号通路与TGF-β诱导的上皮-间质转化

本实验方案描述了3D培养体系的建立方法 '在非转化型乳腺上皮细胞系 MCF10A 的上层培养物中，该细胞系经改造用于研究血小板活化因子（Platelet Activating Factor,...

三维培养中磷脂介质诱导的转化

学习利用microRNA-200家族与GRHL2诱导肉瘤细胞间质上皮转变的方法，研究表型可塑性对癌症侵袭性的影响，为开发新型治疗策略提供可重复的实验手段。

肉瘤细胞中诱导间充质-上皮转化

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