在肉瘤细胞间质上皮转变的诱导
April 7th, 2017
我们在这里提出用于诱导基于微小RNA-200家族成员及grainyhead样2（GRHL2）的合并的异位表达肉瘤细胞间质上皮转换（MET）的细胞培养方法。这种方法适用于更好地理解可塑性的癌症侵袭性和治疗方法的生物学影响。
该程序的总体目标是研究肉瘤间充质-上皮转化的表型后果。这种方法可以帮助回答有关为什么上皮样肉瘤相对于更间充质样肉瘤具有更好的结果的关键问题。该技术的主要优点是它提供了一种简单、可重复的方法来研究与肉瘤间充质-上皮转化相关的下游基因调控网络和表型。
通过更好地了解肉瘤的表型可塑性，我们希望确定治疗干预措施，使我们能够将肉瘤转变为更惰性上皮样状态。我们实验室的两名本科生 Jackson Xu 和 Shivee Gilja 将演示该程序。在转导的第一天，将 10 个细胞接种 3 次，将 HEK293T 10 个细胞放入 2 毫升补充的 DMEM 的 6 孔板的 2 个孔中
。将板在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育。培养过夜后，在显微镜下检查细胞。它们应达到 40% 至 60% 的汇合度。
接下来，在含有 200 μL 无血清培养基、1.8 μg p delta 8.9 和 0.2 μg pCMV-VSV-G 辅助质粒的单独试管中，稀释 2 μg 空载体和 2 μg 含有 GRHL2 的载体。在另一支试管中，每次转染在 200 μL 无血清培养基中稀释 4 μL 脂质体转染试剂。两个样品的含量分别为 8 微升和 400 微升。
向每个质粒溶液中加入 200 μL 转染试剂混合物，然后在室温下孵育样品 20 分钟。同时，使用真空抽吸器从 HEK293T 细胞中去除培养基。用 1 毫升 PBS 冲洗细胞一次，然后用 800 微升无血清培养基替换 PBS。
20 分钟后，向铺板细胞的每个孔中滴加 400 μL 转染试剂质粒混合物。将培养皿在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育 2 小时。孵育后，通过真空抽吸小心地去除转染培养基。
HEK293T细胞是松散粘附的，因此在吸取培养基时，请注意不要从培养皿或培养瓶底部去除细胞。用 2 毫升补充的 DMEM 替换吸出的培养基。将细胞放回培养箱中进行过夜培养。
第二天，在转染的 HEK293T 细胞上刷新培养基，然后在每孔含有 2 毫升补充 DMEM 的六孔板的每个孔中，将 10 次接种到第五个 RD 人横纹肌肉瘤细胞。将两个板培养过夜。第四天，使用移液管从HEK293T细胞中收集病毒培养基，并将其转移到两个新的 15 毫升锥形管中，一个用于含有空载体的慢病毒，另一个用于含有 GRHL2 质粒的慢病毒。
小心地用新的 DMEM 替换培养基，并将HEK293T细胞放回培养箱中过夜。接下来，将每毫升病毒培养基中加入 2 微升 10 毫克/毫升的聚凝胺，加入两个新的 50 毫升锥形管中，一个用于空载体转染，另一个用于 GRHL2 转染。从 3 毫升注射器中取出柱塞，并将 0.45 微米聚醚砜过滤器连接到注射器尖端。
将之前收集的病毒培养基加入注射器的针筒中，然后将其浸入含有聚凝胺的新型 50 毫升锥形管之一中。对另一个样品重复此步骤。然后通过真空抽吸从 RD 细胞中去除培养基，并将每种过滤的病毒培养基样品的 2 毫升加入 RD 板的单独孔中。
将 RD 细胞在 37 摄氏度下在加湿培养箱中孵育。第二天，重复病毒培养基收集并将感染培养基添加到包含先前感染的 RD 细胞的相同孔中。收集病毒培养基后，可以丢弃HEK293T细胞。
将细胞再孵育两天。第 7 天，用 1 毫升 PBS 洗涤 RD 细胞，然后向每个孔中加入 200 微升 0.05% 胰蛋白酶。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。
加入 2 mL 补充培养基，然后将细胞悬液转移到新的 15 mL 锥形管中。在室温下以 250 g 离心细胞 5 分钟。离心后，吸出培养基并将细胞重悬于补充有 5% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 1 毫升 DMEM 中。
为了过滤细胞以准备流式细胞术，请使用移液管将 1 ml RD 细胞悬液通过无菌 30 微米管顶过滤器注入流式细胞术管中。将试管放在冰上。使用流式细胞仪，将 EGFP 阳性细胞分选到 1.5 毫升微量离心管中，其中含有 0.5 毫升补充有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 DMEM。
将分选的细胞放回冰上。将来自空载体和 GRHL2 转导的 EGFP 阳性细胞接种在 12 孔板的单独孔中，放入总共 1 毫升补充的 DMEM 中。然后将细胞放入培养箱中进行培养。
流式细胞术后 EGFP 阳性细胞的产量通常很低，在 50， 000 到 100， 000 个细胞的范围内。因此，细胞可能需要额外培养 10 到 14 天，然后才能进行下一步。在微量离心管中，向 300 μL 无血清培养基中加入 3 μL 每 50 μmol miR-200 模拟物。
在单独的试管中，将 9 μL 50 μL 阴性对照 micro RNA 添加到 300 μL 无血清培养基中。接下来，在另一个微量离心管中，向 600 μL 无血清培养基中加入 6 μL siRNA 特异性转染试剂。将 300 微升这种混合物分成两管，两种 miR 混合物各一根管。
将 300 μL 的每种 miR 混合物与 300 μL 的转染试剂混合物混合。在室温下孵育 20 分钟。孵育时，制备 600， 000 个 EGFP 阳性 RD 细胞的细胞悬液，其中表达 MD 载体或 GRHL2，每次处理每微升无血清培养基含 250 个细胞。
在 24 孔板中，每孔添加 100 μL 的 miR-200 或阴性对照混合物到 6 个孔中。然后将 400 μL 每种细胞悬液添加到每种 miR 混合物的三个孔中。将板在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳中孵育过夜。
第二天，将培养基更改为完全补充的 DMEM。两天后收集细胞，使用适当的缓冲液进行分析。使用自动活细胞成像仪，用 10 倍物镜每两小时对每个孔进行一次成像。
这些延时图像显示了表达 GRHL2、EGFP 和 miR-200 miRNA 的 RD 细胞中的间充质上皮转化 （MET）。细胞外观从纺锤形变为鹅卵石形，细胞间粘附增加，形态更圆润。在其他治疗条件下未观察到 MET。
相反，细胞表现出细长的纺锤形形态，几乎没有细胞间附着。在 MET 诱导过程中，GRHL2 和 miR-200 过表达后 RD 细胞的形态变化伴随着上皮标志物 E-cadherin 的上调，通过 qPCR 和 western blotting 测量。添加 miR-200 上调 E-cadherin 单独上调，但结合 miR-200 和 GRHL2 过表达协同增强 E-cadherin 表达。
如免疫荧光显微镜所示，上皮粘附分子 EpCAM 和 TJP-1 在细胞间连接处增加，如白色箭头所示。通过 QRT-PCR 上调上皮蛋白，下调间充质基因 ZEB1 和 Notch1。通过软琼脂生长测定法测量，MET 的诱导降低了 RD 细胞的锚定非依赖性生长。
软琼脂中的生长抑制仅由 miR-200 驱动，因为 GRHL2 的过表达导致不依赖锚定的生长增加。这与之前的报告一致，显示 GRHL2 表达诱导锚定非依赖性生长。在此程序之后，可以进行其他方法，包括测量细胞迁移、侵袭、转移和对治疗反应变化的测定，以阐明 MET 在肉瘤中的表型后果。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文介绍了一种诱导肉瘤细胞中间充质-上皮转化（MET）的细胞培养方法。该技术专注于microRNA-200家族成员和粒状头2（GRHL2）的组合异位表达，以更好地理解表型可塑性对癌症侵袭性和治疗的生物学影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞培养技术
- 癌症生物学
- 表型可塑性
背景
- 间充质-上皮转化（MET）对理解癌症行为至关重要。
- 上皮样肉瘤通常比间充质样肉瘤显示出更好的结果。
- 研究MET可以揭示治疗策略的洞见。
- 这种方法允许探索与MET相关的基因调控网络。
研究目的
- 调查肉瘤中MET的表型后果。
- 确定为什么上皮样肉瘤有更好的临床结果。
- 开发促进肉瘤更多惰性上皮样状态的治疗干预措施。
使用的方法
- 将microRNA-200家族成员和GRHL2导入HEK293T细胞。
- 在补充DMEM的六孔板中培养细胞。
- 监测下游基因调控网络。
- 利用本科生研究员示范该程序。
主要结果
- 该方法提供了一种可重复的肉瘤MET研究方法。
- 获得的洞见可能导致对癌症治疗结果的更好理解。
- 可能识别出肉瘤治疗的新治疗靶点。
- 本科生对程序的示范提高了教育价值。
结论
- 在肉瘤细胞中诱导MET可以阐明癌症侵袭性的机制。
- 这种方法可能促进新型治疗策略的开发。
- 理解表型可塑性是改善肉瘤患者预后的关键。
常见问题
Executive Industry Relevance
Inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells enables systematic interrogation of phenotypic plasticity and its impact on tumor aggressiveness. This approach provides a reproducible platform for dissecting gene regulatory networks and biomarker shifts relevant to early discovery and target validation. The method supports predictive confidence in evaluating how cellular state transitions influence migration, invasion, and therapy response, informing risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by modeling MET-driven phenotypic changes in sarcoma cells.
- Supports functional target validation through quantification of epithelial and mesenchymal biomarker modulation.
- Facilitates hypothesis testing on the role of GRHL2 and miR-200 in cellular state transitions.
- Provides a platform for interrogating gene regulatory networks underlying phenotypic plasticity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cell systems for downstream migration, invasion, and anchorage-independent growth assays.
- Enables reproducible induction of MET for standardized phenotypic screening workflows.
- Generates quantitative outputs via qPCR, western blot, and immunofluorescence for biomarker assessment.
- Supports assay scalability and cross-study comparability by standardizing MET induction conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro phenotypic transitions with disease-relevant states observed in patient sarcoma samples.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical evaluation of migration, invasion, and therapy resistance.
- Supports translational biomarker identification by linking MET status to functional outcomes.
- Provides a foundation for risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting phenotypic plasticity.
Pipeline & Workflow Integration
This MET induction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven manipulation of sarcoma cell states and downstream functional assays.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing on the impact of GRHL2 and miR-200 on epithelial marker expression and cellular morphology.
- Screening: Standardizes MET induction for reproducible phenotypic and biomarker screening across experimental conditions.
- Analytics: Provides quantitative readouts (e.g., E-cadherin, EpCAM, ZEB1) for comparative analysis of MET versus control states.
- Translational Research: Links in vitro MET induction to disease-relevant phenotypes such as migration, invasion, and therapy resistance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for modeling phenotypic plasticity in diverse sarcoma models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in phenotypic plasticity studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable MET induction for cross-functional R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking cellular state transitions to functional outcomes relevant to metastasis and therapy response.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic strategies targeting phenotypic plasticity in sarcomas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, viral transduction, and RNA transfection techniques.
- Needs access to flow cytometry, qPCR, western blot, and live cell imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of MET induction protocols for reproducibility.
- Adaptation may be necessary for different sarcoma subtypes or cell lines.
- Yield limitations after cell sorting may extend culture timelines before downstream assays.
