适用于下一代测序的植物细胞器DNA富集方法的优化与比较分析

本实验的总体目标是比较两种用于从植物叶片组织中分离高质量细胞器DNA的方法，这两种方法均可提取适用于高通量测序的质体DNA和线粒体DNA。这些方法有助于回答植物生物学中的关键问题，例如不同分类群之间细胞器多样性的程度，以及细胞器基因组序列或结构的变化如何影响发育和应激反应。我们将比较两种技术：一种是差速离心法，可富集特定类型的细胞器；另一种是微量分级分离技术，可从小份冷冻组织样品中回收总细胞器DNA。

小麦幼苗的标准培养方法是将种子种植于蛭石中，使用方形花盆，每个角落播种4至6粒种子。将花盆转移至具有16小时光照周期的温室中，并每天为植株浇水。

在种子萌发时，用四分之一茶匙颗粒状20-20-20 MPK肥料为植株施肥，并在萌发后七天再次施肥。对于小麦幼苗的暗适应处理，播种及植株培养按照标准操作程序进行，但将花盆置于黑暗的生长培养箱中。

替代在暗生长室中培养这些幼苗的方法，是在温室中用覆盖物遮盖植株，同时确保适当通风。该实验步骤的第一步是分离细胞器。取五克新鲜组织，在冰上预冷的烧杯中用冰冷的无菌水冲洗。

使用剪刀将叶片组织直接剪成约一厘米大小的片段，放入预冷的50毫米离心管中，管内含有两个陶瓷研磨珠。整个操作过程中，样品需始终保持在冰上。为避免交叉污染，每次处理不同样品时必须更换剪刀。

将样品转移至通风橱中，向每个50毫升离心管中加入20毫升STE缓冲液。将样品放入组织研磨仪中预冷的低温研磨块中，在1,750转/分钟的条件下研磨30秒。随后将样品置于冰上约1分钟。

将样品位置旋转，然后在每分钟1,750转的条件下继续研磨30秒。将样品放回冰桶中。对于每个样品，将一个漏斗插入置于冰中的洁净50毫升离心管中，并在漏斗内放入一层过滤布。

用 5 毫升 STE 缓冲液预润湿滤膜，并保留滤过液。将匀浆后的组织倒入漏斗中。用 15 毫升 STE 缓冲液冲洗研磨管，盖上管盖后倒置，以冲洗管壁和管盖，然后将冲洗液全部倒入漏斗中。

小心取出陶瓷珠，然后将过滤布中的液体挤出并拧入漏斗中。为避免交叉污染，不同样品之间需更换手套。用石蜡膜包裹管盖，以防液体溢出。

在 4 °C 条件下，以 2,000 × g 离心 10 分钟。随后，使用血清移液管小心吸除上清液，避免扰动沉淀物，并将上清液转移至带有紧密密封垫圈的 50 毫升高速离心管中。将一个小烧杯放在天平上，去皮并称量每份上清液。

使用 STE 缓冲液将离心管平衡至相差 0.1 克以内，然后在 4 摄氏度下以 18,000 × g 离心 20 分钟。离心完成后，将样品放回通风橱中，弃去上清液。向沉淀中加入 1 毫升 ST 缓冲液，用软毛刷轻轻重悬。

加入 24 毫升 ST 缓冲液，使终体积为 25 毫升。轻轻旋转刷子使其在悬液中混匀，然后将刷子在离心管壁上轻压以去除所有液体，再取出刷子。平衡离心管后，在 4 摄氏度条件下以 18,000 × g 离心 20 分钟。

在离心过程中，按照文本方案配制DNA溶液1，并按每份样品200微升分装至1.5毫升离心管中。离心结束后，弃去上清液，并将离心管倒置轻拍以吸除残留液体。向每个高速离心管中加入300微升STE缓冲液，使用软毛刷轻轻重悬沉淀。

将毛刷放入先前准备好的含有 200 微升 DNA 溶液 1 的 1.5 毫升离心管中，旋转毛刷以去除刷毛上残留的任何沉淀物。用移液器将 DNA 溶液 1 转移至高速离心管中，轻轻旋转混匀。在每根离心管顶部包裹石蜡膜，并于 37 摄氏度水浴中孵育 30 分钟。

孵育期间，轻轻晃动混匀。使用带有宽口的移液枪头，将沉淀混合物轻柔地从管中移出，并置于一个1.5毫升低吸附管中。向高速离心管中加入500微升400毫摩尔/升EDTA（pH 8.0）。

轻轻吹打以彻底去除残留沉淀，并将EDTA转移至含有沉淀混合物的低吸附管中。通过倒置轻轻混匀。在4 °C条件下以18,000 × g离心20分钟。

随后，弃去上清液，用吸水纸吸干每根离心管，立即使用沉淀物进行DNA提取。本方法中，细胞器DNA是从使用商用DNA提取柱提取的总基因组DNA中富集而来的。根据制造商说明书制备所需量的与MBD2 FC蛋白结合的磁珠，并按比例调整反应体系，使总投入DNA量在1至2微克之间。

在此实验中，每微克总输入 DNA 需要 160 微升磁珠。为捕获甲基化的核 DNA，将每份单独样品的 1 微克输入 DNA 加入含有 160 微升 MBD2 结合磁珠的离心管中，并用宽口吸头轻轻吹打数次。加入适量的 5× 结合洗涤缓冲液，使终浓度为 1×，再用宽口吸头吹打样品数次以充分混匀。

室温下旋转孵育管子15分钟。为了确保下拉实验成功，在孵育过程中必须充分混匀磁珠，尤其是在出现明显磁珠聚集的情况下。为防止磁珠聚集并确保甲基化DNA的有效下拉，在孵育过程中应使用宽口吸头轻轻吹打样品，并轻轻弹动管子2至3次。

短暂离心含有DNA和磁珠混合物的离心管。将离心管置于磁力架上至少五分钟，使磁珠吸附至管壁一侧。此时溶液应变得澄清，其中含有未甲基化的细胞器富集DNA。

使用宽孔枪头，小心移除上清液，避免扰动磁珠，并将上清液转移至洁净、低吸附的 2 毫升微量离心管中。将样品储存在 -20 或 -80 摄氏度条件下。采用急性 PCR 检测方法，评估总基因组 DNA 及两种方法获得的细胞器 DNA 组分中三种细胞器特异性扩增子的相对丰度。

总体而言，数据表明差速离心法能够优先富集线粒体。经甲基化分馏的总基因组DNA中的未甲基化组分，显示出对两种细胞器内含子序列的显著富集。比对到线粒体或叶绿体中国春和克里斯栽培小麦参考基因组的读段百分比，与qPCR结果一致。

差速离心法获得的 DNA 富含线粒体 DNA，而甲基分馏法获得的 DNA 更可能反映两种细胞器基因组的天然丰度。样本标签中，E 代表经 idyllation 处理的样本，NE 代表未经 idyllation 处理的样本。有趣的是，idyllation 处理并未改变细胞器基因组的丰度。

两种方法中，即使将12个文库进行多重测序，线粒体或叶绿体参考基因组的理论覆盖深度仍超过100倍。总基因组DNA在脉冲场凝胶电泳后呈弥散的涂布状条带迁移，长度超过50千碱基。甲基化分选后的细胞核组分片段尺寸减小，但仍集中在约50千碱基左右，表明甲基化分选得到的DNA最适合长读长测序。

一旦掌握，这两种细胞器 DNA 提取技术均可在一天到两天内完成，从样品采集到最终产物的评估，前提是操作得当。由于甲基分离技术所需的组织投入量极低，因此有望将细胞器 DNA 研究的范围大幅扩展至稀有且难以处理的样品。然而，当后续研究仅需线粒体 DNA 时，差速离心法可能仍是更优选择。

同样，如有需要，可调整离心步骤以优先提取质体DNA。两种细胞器DNA提取方法所获得的DNA均适用于下一代测序，但甲基分馏法可获得高分子量DNA，更适合长读长测序。