Name: 适用于下一代测序的植物细菌DNA富集方法的优化与比较分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 了解差速离心与甲基化分馏两种植物细胞器DNA富集方法的优化与比较分析。本研究评估了这两种技术对小麦叶片线粒体和叶绿体DNA的分离效果及其在下一代测序中的应用价值。

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我们感谢美国农业部农业研究局和美国国家科学基金会（IOS 1025881 和 IOS 1361554）提供的经费支持。感谢 R. Caspers 在温室维护和植物养护方面的工作。同时感谢明尼苏达大学基因组中心，Illumina 文库构建和测序工作在该中心完成。我们还感谢期刊编辑和四位匿名审稿人提出的宝贵意见，这些意见进一步完善了我们的稿件。此外，我们感谢经济合作与发展组织（OECD）为 SK 提供的奖学金，以支持其将这些实验方案应用于与日本同事的协作项目中。

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迄今为止，大多数细胞器测序研究都集中在传统的差速离心（DC）方法上，以富集特定DNA。已有多种用于从不同植物中分离细胞器的方法被报道，包括苔藓40；单子叶植物如小麦15和燕麦11；以及双子叶植物如拟南芥11、向日葵17和油菜14。大多数实验方案主要针对叶片组织13,14,15,16,17，其中一些方法已被适配用于多种组织类型，包括种子11。从原生质体中分离细胞器的方法也已有报道<sup...

基因组测序是解析重要植物性状遗传基础的有力工具。大多数基因组测序研究集中于细胞核基因组，因为大部分基因位于细胞核内。然而，细胞器基因组，包括线粒体（存在于真核生物中）和质体（存在于植物中；其特化形式叶绿体参与光合作用），也提供了对生物体发育、应激反应及整体适应性至关重要的遗传信息1细胞器基因组通常包含在旨在进行核基因组测序的总DNA提取物中，尽管也有在DNA提取前采用减少细胞器数量的方法。2许多研究利用全基因组DNA提取物的测序结果来组装细胞器基因组3,4,5,6,7然而，当研究目标聚焦于细胞器基因组时，使用总基因组DNA会增加测序成本，因为会产生大量非目标区域的读长 &#34;丢失&#34; 与核DNA序列相比，尤其在核基因组较大的植物中，由于细胞器序列在核基因组中的复制和插入，以及细胞器之间的序列转移，将测序读长准确比对到正确的基因组位置在生物信息学分析上具有挑战性。2,8将细胞器基因组从核基因组中纯化是减少这些问题的一种策略。此外，可采用进一步的生物信息学方法来区分比对到线粒体与叶绿体同源区域的测序读段。
尽管许多植物物种的细胞器基因组已被测序，但关于野生种群或栽培育种群体中细胞器基因组多样性的广度仍知之甚少。细胞器基因组也被认为是动态分子，会因重复序列之间的重组而发生显著的结构重排9。此外，每个细胞器中含有多个细胞器基因组拷贝，而每个细胞中又含有多个细胞器。这些基因组拷贝并非完全相同，这种现象被称为异质性（heteroplasmy）。与传统的“主环”（&#34;master circles&#34;）模型不同，目前越来越多的证据支持细胞器基因组结构具有更复杂的形态，包括亚基因组环状结构、线性染色体、线性串联多聚体以及分支结构10。植物细胞器基因组的组装还因其相对较大的基因组尺寸以及大量存在的反向重复和正向重复序列而变得更加复杂。
传统的细胞器分离、DNA纯化及后续基因组测序方案通常繁琐且需要大量起始组织，往往需要数克乃至数百克的幼嫩叶片组织作为起始材料11,12,13,14,15,16,17。这使得在组织样本有限的情况下难以开展细胞器基因组测序。在某些情况下，种子数量有限，例如需要按世代进行测序，或必须通过杂交维持的雄性不育系。在这些情况下，可对细胞器DNA进行纯化后再进行全基因组扩增。然而，全基因组扩增可能引入显著的测序偏差，这在评估结构变异、亚基因组结构以及异质性水平时尤为突出18。近年来，短读长测序技术的文库制备方法取得了进展，已克服了低起始量的限制，从而避免了全基因组扩增。例如，Illumina Nextera XT文库制备试剂盒仅需低至1 ng的DNA即可作为起始材料19。然而，针对PacBio或Oxford Nanopore等长读长测序技术的标准文库制备方法仍需要相对较高的DNA起始量，这对细胞器基因组测序构成了挑战。近期，研究人员开发出新的自制长读长测序方案，以降低起始量需求，有助于在难以获得微克级DNA的样本中实现基因组测序20,21。然而，获得高分子量且纯净的细胞器组分以用于这些文库制备仍是当前面临的主要难题。
我们旨在比较并优化适用于下一代测序（NGS）的细胞器DNA富集与分离方法，且无需进行全基因组扩增。具体而言，我们的目标是确定从有限起始材料（例如叶片的子样本）中富集高分子量细胞器DNA的最佳实验方案。本研究对两种细胞器DNA富集方法进行了比较分析：（1）一种改良的传统差速离心法，与（2）基于 commercially available DNA CpG-甲基结合结构域蛋白下拉技术的DNA组分分离法22，后者应用于植物组织23。我们推荐了从小麦叶片组织中分离细胞器DNA的最佳实践方案，该方案可便捷地推广至其他植物及组织类型。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇（β-巯基乙醇；BME）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇（异丙醇），生物级试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖，Bio-Rad 认证 Megabase 琼脂糖</td><td>Bio-Rad</td><td>1613108</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷研磨柱，3/8 英寸 × 7/8 英寸</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>适用于组织匀浆器的低温块，用于固定 50 mL 管</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2664</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA），0.5 M 溶液，pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶染色剂</td><td></td><td></td><td>例如 GelRed 或溴化乙锭</td></tr><tr><td>研磨杵，适用于 2 mL 圆底管的宽头型号</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍，8 M 溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>来自哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的溶壁酶</td><td>Sigma</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>G Bioscience</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>ThermoFisher</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，LoBind 1.5 mL&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，标准无核酸酶 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>制冷微量离心机</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td>Legend X1R</td><td>或同等产品，必须能够达到至少 18,000 × g 的离心力，并配备适用于 50 mL 管、Oak Ridge 管和 1.5 mL 管的转子</td></tr><tr><td>常温微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>或同等产品，必须能够达到至少 18,000 × g 的离心力，并配备适用于 1.5 mL 和 2 mL 微量离心管的转子</td></tr><tr><td>Microcon DNA 快速流速离心过滤装置</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCFOR100</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth，每个样品使用 1 块，裁剪至适合漏斗大小</td><td>EMD Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext 微生物组 DNA 富集试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E2612L</td><td></td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Parafilm M</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>塑料花盆和托盘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮（PVP）</td><td>Fisher</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>脉冲场凝胶电泳装置（例如 CHEF DR III）</td><td>Bio-Rad</td><td>1703697</td><td></td></tr><tr><td>纯化磁珠，Agencourt AMpureXP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 20/g 基因组 DNA 提取柱试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>10223</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB（洗脱缓冲液）</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNA 提取缓冲液套装</td><td>Qiagen</td><td>19060</td><td></td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19015</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 仪（例如 Roche Light Cycler 480）</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR 板密封膜</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 板，96 孔板</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;nbsp;检测管</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 宽谱检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 高灵敏度检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（20 mL）及移液辅助器</td><td>Fisher</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>小漏斗，每个样品 1 个</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>软毛画笔，每个样品 2 支</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder 或其他类型的组织匀浆器</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>或使用其他性能相当的组织匀浆器。若无组织匀浆器，可使用预冷的研钵和研杵进行研磨（详见实验方案）。然而，使用匀浆器可获得更一致的结果，且总匀浆时间更短。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Omnipure</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T2819-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>管式旋转仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管，50 mL 聚丙烯圆底管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>离心管，50 mL 高速聚丙烯管&amp;nbsp;</td><td>ThermoScientific/Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>例如 Nalgene Oakridge 管或同等产品</td></tr><tr><td>蛭石</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水，无菌且经认证的无核酸酶水&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1481</td><td></td></tr><tr><td>水，无菌 milliQ 水</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

适用于下一代测序的植物细胞器dna富集方法的优化与比较分析

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

植物细胞器基因组包含大量重复元件，这些元件可能发生配对或重组，形成复杂的结构和/或亚基因组片段。细胞器基因组在同一细胞或组织类型中也以混合形式存在（异质性），且在发育过程或受到胁迫时，不同亚型的丰度可能发生改变（亚化学计量漂移）。要深入理解细胞器基因组的结构与功能，需要借助新一代测序（NGS）技术。传统的测序研究采用多种方法获取细胞器DNA：（1）若使用大量起始组织，则将其均质化后进行差速离心和/或梯度纯化；（2）若使用较少组织量（即， 若种子、材料或空间有限，则采用与（1）相同的方法，随后进行全基因组扩增以获得足够的DNA。（3）可利用生物信息学分析对总基因组DNA进行测序，并分离出细胞器来源的读段。上述所有方法均存在固有的挑战与权衡。在方法（1）中，可能难以获取足量的起始组织；在方法（2）中，全基因组扩增可能引入测序偏差；而在方法（3）中，核基因组与细胞器基因组之间的同源性可能干扰序列组装与分析。在核基因组较大的植物中，富集细胞器DNA有助于降低测序成本，并减少生物信息学分析中的序列复杂性。本文比较了一种传统的差速离心法与第四种方法——改良的CpG甲基化富集法，用于将总基因组DNA分离为核与细胞器组分。两种方法均可获得适用于下一代测序（NGS）的DNA，且所得DNA均高度富集细胞器序列，但在线粒体与叶绿体间的富集比例有所不同。本文展示了这两种方法在小麦叶片组织中的优化过程，并结合样本投入量、操作难易程度及下游应用等方面，讨论了各自的主要优缺点。

本论文中介绍的方案描述了两种从植物组织中富集细胞器DNA的不同方法。此处提供的条件是针对小麦组织优化的结果。图1概述了两种方案中的关键步骤、所需起始组织量以及DNA产出情况。我们测试的差速离心（DC）方案步骤与先前报道的方法类似（图1A）。采集的组织必须新鲜处理，并通过差速离心和/或梯度离心分离完整的细胞器。在裂解细胞器之前，先去除核DNA，最后提取DNA并用于后续实验。相比之下，在甲基化过滤（MF）方案中，植物组织可在采集后储存再使用，且无需获得完整细胞器。该方法基于DNA的甲基化状态，从总基因组DNA中分离核DNA与细胞器DNA。两种方案获得的细胞器DNA总量大致相当（图1C）。就单位组织输入所获得的总细胞器DNA产量而言，当组织样本有限时，MF方案更具优势，因其仅需单株植物的小量样品，且可保留植株继续生长以供进一步分析。通常情况下，DC方案需要多株幼苗的全部地上部分组织，这些植株在实验后即...

本文介绍了两种植物细胞器DNA富集方法的比较与优化：传统的差速离心法，以及基于甲基化状态对总基因组DNA进行分馏的方法。我们评估了所获得DNA的数量和质量，展示了其在短读长的下一代测序中的表现，并讨论了其在长读长单分子测序中的应用潜力。

适用于下一代测序的植物细胞器DNA富集方法的优化与比较分析

植物细胞器基因组包含大量重复元件，这些重复元件可能发生配对或重组，从而形成复杂的结构和/或亚基因组……

本实验的总体目标是比较两种用于从植物叶片组织中分离高质量细胞器DNA的方法，这两种方法均可提取适用于高通量测序的质体DNA和线粒体DNA。这些方法有助于回答植物生物学中的关键问题，例如不同分类群之间细胞器多样性的程度，以及细胞器基因组序列或结构的变化如何影响发育和应激反应。我们将比较两种技术：一种是差速离心法，可富集特定类型的细胞器；另一种是微量分级分离技术，可从小份冷冻组织样品中回收总细胞器DNA。小麦幼苗的标准培养方法是将种子种植于蛭石中，使用方形花盆，每个角落播种4至6粒种子。将花盆转移至具有16小时光照周期的温室中，并每天为植株浇水。在种子萌发时，用四分之一茶匙颗粒状20-20-20 MPK肥料为植株施肥，并在萌发后七天再次施肥。对于小麦幼苗的暗适应处理，播种及植株培养按照标准操作程序进行，但将花盆置于黑暗的生长培养箱中。替代在暗生长室中培养这些幼苗的方法，是在温室中用覆盖物遮盖植株，同时确保适当通风。该实验步骤的第一步是分离细胞器。取五克新鲜组织，在冰上预冷的烧杯中用冰冷的无菌水冲洗。使用剪刀将叶片组织直接剪成约一厘米大小的片段，放入预冷的50毫米离心管中，管内含有两个陶瓷研磨珠。整个操作过程中，样品需始终保持在冰上。为避免交叉污染，每次处理不同样品时必须更换剪刀。将样品转移至通风橱中，向每个50毫升离心管中加入20毫升STE缓冲液。将样品放入组织研磨仪中预冷的低温研磨块中，在1,750转/分钟的条件下研磨30秒。随后将样品置于冰上约1分钟。将样品位置旋转，然后在每分钟1,750转的条件下继续研磨30秒。将样品放回冰桶中。对于每个样品，将一个漏斗插入置于冰中的洁净50毫升离心管中，并在漏斗内放入一层过滤布。用 5 毫升 STE 缓冲液预润湿滤膜，并保留滤过液。将匀浆后的组织倒入漏斗中。用 15 毫升 STE 缓冲液冲洗研磨管，盖上管盖后倒置，以冲洗管壁和管盖，然后将冲洗液全部倒入漏斗中。小心取出陶瓷珠，然后将过滤布中的液体挤出并拧入漏斗中。为避免交叉污染，不同样品之间需更换手套。用石蜡膜包裹管盖，以防液体溢出。在 4 °C 条件下，以 2,000 × g 离心 10 分钟。随后，使用血清移液管小心吸除上清液，避免扰动沉淀物，并将上清液转移至带有紧密密封垫圈的 50 毫升高速离心管中。将一个小烧杯放在天平上，去皮并称量每份上清液。使用 STE 缓冲液将离心管平衡至相差 0.1 克以内，然后在 4 摄氏度下以 18,000 × g 离心 20 分钟。离心完成后，将样品放回通风橱中，弃去上清液。向沉淀中加入 1 毫升 ST 缓冲液，用软毛刷轻轻重悬。加入 24 毫升 ST 缓冲液，使终体积为 25 毫升。轻轻旋转刷子使其在悬液中混匀，然后将刷子在离心管壁上轻压以去除所有液体，再取出刷子。平衡离心管后，在 4 摄氏度条件下以 18,000 × g 离心 20 分钟。在离心过程中，按照文本方案配制DNA溶液1，并按每份样品200微升分装至1.5毫升离心管中。离心结束后，弃去上清液，并将离心管倒置轻拍以吸除残留液体。向每个高速离心管中加入300微升STE缓冲液，使用软毛刷轻轻重悬沉淀。将毛刷放入先前准备好的含有 200 微升 DNA 溶液 1 的 1.5 毫升离心管中，旋转毛刷以去除刷毛上残留的任何沉淀物。用移液器将 DNA 溶液 1 转移至高速离心管中，轻轻旋转混匀。在每根离心管顶部包裹石蜡膜，并于 37 摄氏度水浴中孵育 30 分钟。孵育期间，轻轻晃动混匀。使用带有宽口的移液枪头，将沉淀混合物轻柔地从管中移出，并置于一个1.5毫升低吸附管中。向高速离心管中加入500微升400毫摩尔/升EDTA（pH 8.0）。轻轻吹打以彻底去除残留沉淀，并将EDTA转移至含有沉淀混合物的低吸附管中。通过倒置轻轻混匀。在4 °C条件下以18,000 × g离心20分钟。随后，弃去上清液，用吸水纸吸干每根离心管，立即使用沉淀物进行DNA提取。本方法中，细胞器DNA是从使用商用DNA提取柱提取的总基因组DNA中富集而来的。根据制造商说明书制备所需量的与MBD2 FC蛋白结合的磁珠，并按比例调整反应体系，使总投入DNA量在1至2微克之间。在此实验中，每微克总输入 DNA 需要 160 微升磁珠。为捕获甲基化的核 DNA，将每份单独样品的 1 微克输入 DNA 加入含有 160 微升 MBD2 结合磁珠的离心管中，并用宽口吸头轻轻吹打数次。加入适量的 5× 结合洗涤缓冲液，使终浓度为 1×，再用宽口吸头吹打样品数次以充分混匀。室温下旋转孵育管子15分钟。为了确保下拉实验成功，在孵育过程中必须充分混匀磁珠，尤其是在出现明显磁珠聚集的情况下。为防止磁珠聚集并确保甲基化DNA的有效下拉，在孵育过程中应使用宽口吸头轻轻吹打样品，并轻轻弹动管子2至3次。短暂离心含有DNA和磁珠混合物的离心管。将离心管置于磁力架上至少五分钟，使磁珠吸附至管壁一侧。此时溶液应变得澄清，其中含有未甲基化的细胞器富集DNA。使用宽孔枪头，小心移除上清液，避免扰动磁珠，并将上清液转移至洁净、低吸附的 2 毫升微量离心管中。将样品储存在 -20 或 -80 摄氏度条件下。采用急性 PCR 检测方法，评估总基因组 DNA 及两种方法获得的细胞器 DNA 组分中三种细胞器特异性扩增子的相对丰度。总体而言，数据表明差速离心法能够优先富集线粒体。经甲基化分馏的总基因组DNA中的未甲基化组分，显示出对两种细胞器内含子序列的显著富集。比对到线粒体或叶绿体中国春和克里斯栽培小麦参考基因组的读段百分比，与qPCR结果一致。差速离心法获得的 DNA 富含线粒体 DNA，而甲基分馏法获得的 DNA 更可能反映两种细胞器基因组的天然丰度。样本标签中，E 代表经 idyllation 处理的样本，NE 代表未经 idyllation 处理的样本。有趣的是，idyllation 处理并未改变细胞器基因组的丰度。两种方法中，即使将12个文库进行多重测序，线粒体或叶绿体参考基因组的理论覆盖深度仍超过100倍。总基因组DNA在脉冲场凝胶电泳后呈弥散的涂布状条带迁移，长度超过50千碱基。甲基化分选后的细胞核组分片段尺寸减小，但仍集中在约50千碱基左右，表明甲基化分选得到的DNA最适合长读长测序。一旦掌握，这两种细胞器 DNA 提取技术均可在一天到两天内完成，从样品采集到最终产物的评估，前提是操作得当。由于甲基分离技术所需的组织投入量极低，因此有望将细胞器 DNA 研究的范围大幅扩展至稀有且难以处理的样品。然而，当后续研究仅需线粒体 DNA 时，差速离心法可能仍是更优选择。同样，如有需要，可调整离心步骤以优先提取质体DNA。两种细胞器DNA提取方法所获得的DNA均适用于下一代测序，但甲基分馏法可获得高分子量DNA，更适合长读长测序。

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遗传学

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