Name: 变凹形形状 Microwells 的配对磁珠和磁体阵列 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习利用磁力辅助钢珠自锁技术在PDMS基底上制备凹形微孔阵列的方法。该技术可在3厘米×3厘米区域内形成数百个微孔，为三维细胞培养研究提供经济高效的微加工解决方案。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过科学、信息通信技术与未来规划部资助（项目编号：NRF-2014R1A1A2057527 和 NRF-2016R1D1A1B03934418）。

1. 通孔阵列铝板和磁铁阵列的制备
<ol>
	<li>准备两块 50 mm × 50 mm（或更大）的铝板，每块板的厚度为 300 &#181;m，为钢珠直径的一半。</li>
	<li>使用数控旋转雕刻机在一块铝板上加工出一个30 × 30的通孔阵列 &#934;550-&#181;m 微钻头，以 30 mm/s 的进给速率和 8000 RPM 的主轴转速进行加工。各孔之间的距离（中心到中心）为 1 mm（图1a 和 图2a, i).</li>
	<li>形成一个 30 × 30 的阵列 &#934;750-&#181;m通孔，采用与1.2步骤相同的程序（图1a 和 图2a, ii).</li>
	<li>使用胶带将两块板相互粘合固定 &#934;两块铝板的四个角均设有直径3 mm的对准孔。</li>
	<li>将铝板浸泡在15%的硫酸中12小时以清洁其表面。由于铝表面的薄层氧化铝具有抗腐蚀性，该酸处理不会改变铝板的孔径和厚度。</li>
	<li>形成一个 30 &#215; 30 个 1 × 1 × 1 mm 的钕磁铁阵列（磁力强度为 0.363 N）。确保每个磁铁与其相邻磁铁的极性相反。为防止磁铁阵列破裂或散开，使用双面胶带将一块 30 × 30 mm 的铝板固定在磁铁阵列底部。图2a,&#160;iii 及插图 图2).</li>
</ol>
2. 微珠捕获过程
<ol>
	<li>使用每块铝板四角预先制备的对准孔，将两块铝板（上板：750 µm 孔板，下板：550 µm 孔板）对准并叠放（图 1b）。</li>
	<li>将 M3 螺栓插入对准孔中，将两块铝板锁紧，并用螺母固定螺栓（图 1b）。</li>
	<li>将组装好的铝板叠放在预先准备的磁铁阵列上（图&#160;1b、2b 和 2c）。在叠放过程中，使磁铁阵列与铝板上的通孔阵列对齐，然后使用胶带固定磁铁阵列的位置。</li>
	<li>在铝板组件上放置足够数量的 Φ600 mm SUJ2 钢珠，并使用亚克力板（或非金属板）操作钢珠，使每个孔中均嵌入一颗钢珠（图 1c、1d 和 1e），同时去除未嵌入孔中的多余钢珠。</li>
	<li>小心移除上板，以避免被固定的钢珠发生意外散落或位移（图 1f）。</li>
</ol>
3. 凹形微孔的制备
<ol>
	<li>将上述步骤2.1至2.5制备的凹形微孔模具转移至培养皿中。</li>
	<li>按照制造商说明混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）单体与固化剂19 以 PDMS 单体与固化剂比例为 10:1。</li>
	<li>使用真空干燥器和真空泵对PDMS混合物进行脱气，以去除其中截留的气泡。</li>
	<li>将PDMS混合物倒入凹形微孔模具中，并使用与3.3步骤相同的方法再次进行脱气处理（图1f).</li>
	<li>在热板上将PDMS混合物于80 °C烘烤 &#176;C 下孵育 2 小时以形成嵌有微珠的 PDMS 基底（图 1g).</li>
	<li>将固化后的PDMS基底从模具中取出（图1g). 在去除过程中，使用洗瓶喷洒甲醇以使PDMS基底从模具上脱离。</li>
	<li>使用一种 &#934;15 mm × 2 mm 磁铁，从 PDMS 基底上移除被固定的钢珠（图 1h）。在此过程中，可使用任何具有足够强度以从PDMS基底中提取钢珠的磁铁。</li>
</ol>
4. 类球体培养
<ol>
	<li>使用Φ14 mm活检打孔器切割本研究中带有凹形微孔阵列的PDMS基底，以便适配24孔板。</li>
	<li>将所得Φ14 mm PDMS基底置于高压灭菌器中，在121 °C和15 psi条件下进行灭菌。</li>
	<li>将灭菌后的PDMS基底放入24孔板中。</li>
	<li>用4% (w/v) Pluronic F-127溶液对整个PDMS基底进行过夜包被，以防止细胞黏附于微孔表面。在包被过程中，通过移液或使用超声清洗机去除凹形微孔中截留的气泡。</li>
	<li>使用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗F-127溶液三次。</li>
	<li>在PDMS基底上接种1 mL细胞培养基（DMEM，Dulbecco改良Eagle培养基）溶液（含2 × 106个细胞）。请注意，接种密度可根据目标类球体大小和/或目标细胞类型进行调整。本实验中使用脂肪来源的干细胞（ASC）。</li>
	<li>使用1000 µL移液器吸除未被捕获在微孔中的多余细胞及1 mL培养基（图3）。</li>
	<li>将细胞置于36.5 °C、湿度&gt;95%、5% CO2条件下培养。在本研究使用的ASC情况下，细胞在48小时内聚集成类球体。</li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

该制备方法面临的主要挑战是如何在铝板的通孔阵列中牢固固定微珠。为解决这一问题，采用了一个30 × 30的磁铁阵列，利用磁力将微珠牢固固定，如图6和图7所示。该磁铁阵列具有相反的极性，其磁通密度在每块磁铁表面的中心处最强。由于磁力的强度取决于磁通密度，微珠因此被引导至每块磁铁顶面的中心位置并被固定在此处。若使用单个大尺寸磁铁（5 cm × 5 cm × 1 cm），则微珠（尤其是位于最外侧孔中的微珠）容易被吸引至磁铁边缘处形成的高强度磁场区域。使用大磁铁的另一个问题是微珠会自发聚集并形成微小的珠链结构（图8a）。
上板（750 µm 孔）的作用是提供凹坑结构以捕获微珠。由于这种凹坑结构，可以通过丙烯酸板刮擦的方式一次性创建大量被捕获的微珠阵列（方案 2.4 以及图 1c和1d）。如果不使用上板，则必须将每个微珠手动逐个插入到底板（550 µm 孔）中。
本方法的...

以球状体形式培养的细胞比二维平面培养更接近体内真实组织1。&#160;由于这一优势，球状体已被广泛应用于改善细胞间相互作用2,3、免疫激活4、药物筛选5和分化研究6。此外，近年来包含多种细胞类型的球状体已被应用于类器官（接近生理状态的三维（3D）组织），在人类发育与疾病研究中具有重要价值7。&#160;目前已有多种方法用于制备球状体。最简单的方法是使用非黏附表面，使细胞彼此聚集并形成球状体。可通过在培养皿表面包被牛血清白蛋白、Pluronic F-127或疏水性聚合物（如聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯）来实现表面非黏附性8,9。旋转烧瓶法是另一种广为人知的大规模制备球状体的方法10,11。该方法通过搅拌使细胞保持悬浮状态，防止其贴附于基质表面，从而促使悬浮细胞聚集形成球状体。非黏附表面法和旋转烧瓶法均可实现球状体的大规模生产，但存在难以精确控制球状体大小，以及难以对单个球状体进行追踪和监测等局限性。为克服上述问题，可采用另一种球状体制备方法——悬滴法12。该方法将细胞悬液滴加至培养皿盖的内侧表面。液滴体积通常为15至30 µL，每滴含有约300至3000个细胞13。当皿盖倒置时，液滴依靠表面张力保持原位。每个液滴内的微重力环境促使细胞聚集，并在液-气自由界面处形成单一球状体。与非黏附表面法和旋转烧瓶法相比，悬滴法的优势在于可获得尺寸分布均一的球状体，且便于对每个球状体进行追踪和监测。然而，该方法也存在明显缺点，即球状体的大规模制备及其操作过程极为耗时耗力。
微孔阵列是一种带有多个微尺度孔的平板，每个孔的直径范围为100至1000 µm。使用微孔制备类球体的原理与非黏附表面法类似。其优点在于，微孔之间留有空间，可用于分离细胞或类球体，从而易于控制类球体的大小，同时也便于对每一个单独的类球体进行监测。由于微孔数量众多，还可实现高通量的类球体制备。微孔的另一优势是可根据用户特定的实验需求，制备成不同形状的孔（如立方形、圆柱形、三棱柱形）。然而，通常认为三维（3D）凹形（或半球形）结构最适合制备大小均一的单个类球体。因此，凹形微孔已被广泛应用于多种细胞生物学研究，例如胚胎干细胞的心肌细胞分化14、胰岛细胞簇的胰岛素分泌15、肝细胞的酶活性16以及肿瘤类球体的药物抗性研究17。
遗憾的是，微孔的制备通常需要专业的微图形加工设备；基于传统光刻的方法需要曝光和显影设备，而基于反应离子刻蚀的方法则需要等离子体和离子束设备。这些设备成本高昂，加之制备工艺复杂，使得缺乏微技术条件的生物学家难以开展相关研究。为克服这些问题，已有其他低成本方法被提出，例如冰光刻法18（利用冻结的水滴）和柔性膜法14（利用膜、通孔基底和真空装置）。然而，这些方法也存在严重缺陷，例如难以控制图案尺寸、难以实现高深宽比以及难以制备大面积的微孔结构。
为解决上述问题，我们提出一种利用通孔基底、钢珠和磁铁阵列的新型凹形微孔制备方法。通过该方法，可利用磁力辅助自锁金属珠的机制，制备出数百个球形凹面微孔（图1）。该制备过程仅需极少昂贵且复杂的设备，且无需掌握多项高阶技能，因此即使无经验人员也能轻松完成。为验证所提出的方法，将人脂肪来源的干细胞在凹形微孔中培养，以生成球形细胞聚集体。

<table><tbody><tr><td>数控旋转雕刻机</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>微型钻头</td><td>HAM Pr&amp;auml;zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&amp;Phi; 0.55 和 0.75 mm</td></tr><tr><td>98% 硫酸</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>用于清洗铝板。&lt;br/&gt; 用蒸馏水稀释成15%溶液</td></tr><tr><td>钕磁铁</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 × 1 × 1 mm</td></tr><tr><td>轴承钢珠</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&amp;Phi; 600 &amp;mu;m 钢珠</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>用磷酸盐缓冲液稀释至4% (w/v) 溶液</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>脂肪来源的间充质干细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于构建具有可变成凹几何形状微孔的配对微珠与磁铁阵列

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

类球体培养是一种用于理解细胞行为的有效工具，因为它提供了一个类似体内环境的三维结构。in vivo 细胞相互作用、免疫激活、药物筛选、干细胞分化和类器官生成的研究中，已采用多种类球体生成方法，如非黏附表面、旋转瓶、悬滴法和微孔阵列。在这些方法中，具有三维凹面几何结构的微孔阵列因其能够生成尺寸均一的类球体，并便于对单个类球体的反应进行监测，已引起科学家和工程师的关注。尽管已有成本较低的方法被提出，例如使用柔性膜和冰光刻技术，但这些技术存在严重缺陷，如难以控制图案尺寸、难以实现高纵横比以及难以制备大面积的微孔阵列。为克服这些问题，我们提出了一种无需复杂高成本设备即可制备凹面微孔阵列的可靠方法。该方法利用一个30 × 30通孔阵列、数百个微米级钢珠以及磁力，在3 cm × 3 cm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上制备出900个微孔。为验证该方法在细胞生物学应用中的适用性，我们将脂肪干细胞培养3天，并成功利用该微孔平台生成了类球体。此外，我们还进行了静磁模拟，以探究磁力如何将钢珠固定在通孔中的机制。我们认为，所提出的微孔阵列制备方法可广泛应用于基于类球体的多种细胞研究，如药物筛选、组织再生、干细胞分化和癌症转移研究。

通过执行步骤2.1至3.7，成功制备了凸形模具和微孔阵列图案（图4）。商用钢珠被固定在30 × 30的通孔阵列中，钢珠被紧密固定，与相应通孔之间无任何间隙（图4a）。所制备的凹形微孔呈凹半球形，直径为600 µm，与钢珠的直径相同（图4b）。凹形微孔的横截面（图4c）显示，相邻微孔之间的距离为1 mm（中心到中心），与通孔间距一致。直径为Φ14 mm的凹形微孔基底置于24孔板中，包含超过120个微孔（图4d）。
将脂肪来源的干细胞培养在凹形微孔阵列中。我们在直径为14 mm的凹形微孔阵列上接种了2 × 106个细胞。24小时后，细胞已聚...

本论文介绍了一种无需复杂高成本设备即可制备凹形微孔的可靠方法。利用磁力、钢珠和通孔阵列，在3 cm × 3 cm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上形成了数百个微孔。

类球体培养是研究细胞行为的有用工具，因为它提供了一个类似体内环境的三维结构。各种……

本方法的总体目标是利用磁力辅助的自锁金属珠制备凹球面微孔。大家好，我叫 Gi Hun Lee，是韩国中央大学的助教。我们实验室的研究兴趣是制备多种微尺度器件和平台，以促进我们在生物仪器开发、细胞培养以及新型微结构方面的研究。我们的研究兴趣之一是开发新型的微装置和方法，以在三维环境中实现细胞收缩。我们称之为“三维培养”。三维培养对于理解细胞的三维响应非常有用，因为它比传统的二维平面培养更接近真实的组织环境。已尝试多种用于制备薄层的方法，例如在烧瓶或试管中、在滚筒网中以及使用微波法。在这些方法中，凹面微孔法是一种非常强大的工具，可用于制备三维结构产物。该方法可对每个微孔单元进行独立监测，并能够控制球状结构的尺寸及其分布。本文提出了一种利用磁珠和小磁体阵列制备凹面微器件的方法。通过该技术，可借助磁力辅助固定磁珠的机制，制备出100个凹面微器件。每个凹面结构的增材过程各不相同，且无重复性的比例尺度。首先，使用数控旋转雕刻机制作了尺寸为 230 乘 30 的通孔阵列铝板。该放置装置将为珠子提供导向滚轮，具体将在后续部分展示。放置装置使用不同直径的钻头进行钻孔，并将具有较小孔径的铝板置于底部。外角处也需钻孔，以便对齐板片。随后将两块板对齐、叠放，并通过在边缘孔中插入 N 个螺栓并用螺母紧固，使二者锁定在一起。如前所述，制造商必须将孔径较小的板置于底部，以便珠子能够固定在导引孔内。下一步是制备一个 30 × 30 的钕磁铁阵列。我们首先手动分离磁铁，并将其排列成 2 × 2 的阵列，然后使用镊子将其对齐成更大的阵列。为了制作一个合适的磁体阵列，每块磁体必须与其相邻磁体具有相反的极性。此外，为防止阵列断裂或散开，需使用双面胶带将一块铝板固定在磁体阵列的底部。现在，我们已准备好将制作的各个部件组装成微孔模具。使用普通胶带将磁铁阵列小心地固定在底板上。需要注意的是，磁铁阵列应使磁铁朝下放置。在铝板和磁铁阵列正确组装后，将钢珠放置在板组件上。本文中使用的珠子是SUJ2钢珠，直径为600微米。我们的排列过程非常简单：将足量的珠子倒入装配区域，然后用丙烯酸板将其刮平。底部的磁铁会捕获磁珠，使磁珠进入铝板的孔洞中，在刮除过程中，未卡入孔洞的多余磁珠将被去除。使用另一块磁铁去除多余的磁珠。当磁珠正确地卡入导引孔后，我们继续移除上层板。在此过程中，有时会出现微珠脱落并发生移位的情况。此时，需使用镊子将微珠手动重新插入孔中。至此，凹面微孔模具已准备就绪。将平台转移至另一个培养皿中，并为下一步操作做好准备。我们按照制造商的说明配制聚二甲基硅氧烷（PDMS），将PDMS单体与固化剂按10:1的比例混合。为去除PDMS混合物中截留的气泡，将混合物置于真空干燥器中脱气约一小时。完成此步骤后，取脱气的PDMS混合物，将其倒入凹形微孔模具中，并再次进行脱气处理。随后将PDMS混合物置于80°C的加热板上烘烤两小时，以形成嵌入式PDMS子托盘。下一步操作必须格外小心。为了便于移除，将甲醇倒入底板托盘中，并依次移除外周的PDMS底板托盘。需要注意的是，操作人员应确保甲醇充分渗透到各缝隙中，以保证干净彻底地移除。随后将PDMS底板托盘从铝板上分离；在剥离前先将边缘剪开更容易操作。最后，我们从PDMS副槽中移除磁珠。在移除之前，需拉伸并轻弹副槽一段时间，以松动磁珠与PDMS副槽之间的结合。实际移除磁珠的过程非常简便，使用一个较大的磁铁即可完成。凹面微孔的制备已完成，微孔已准备好用于细胞培养。为了检测我们的PDMS平台是否适用于细胞培养，我们进行了以下操作：首先，使用直径为14毫米的活检打孔器切割带有凹面微孔图案的PDMS子托盘。在对 PDMS 子培养皿进行灭菌后，将其放入 24 孔板中。随后，用 4% 的普朗尼克 F-127 溶液对整个 PDMS 子培养皿进行过夜包被，以防止细胞黏附于微孔表面。在包被过程中，应通过移液或使用超声波清洗器去除微孔中截留的任何气泡。确保无残留气泡后，将含有约两百万个细胞的1毫升细胞培养基溶液接种到PDMS子培养皿中。接下来，使用1000微升移液器吸去未被捕获在微孔中的多余细胞，随后即可将细胞放入培养箱中培养。具有微孔阵列结构的凸模已成功制备，商用钢珠已被固定在30乘30的通孔阵列中。微珠被紧密固定，微珠与相应的通孔之间无任何气体存在。所制备的凹形微孔呈凹半球形，直径为600微米，与钢珠的直径相同。凹形微孔的横截面显示，相邻微孔之间的距离为1毫米，与通孔之间的间距一致。将脂肪来源的干细胞培养在凹形微孔中。我们在直径为14毫米的凹形微孔阵列上接种了两百万个细胞。24小时后，细胞已聚集形成球状体。在微孔阵列中形成的球状体的平均直径为185.68微米。在第3天，细胞聚集程度增加，但球状体的平均直径减小至147微米。采用本方法，可通过一种成本较低且相对简单的工艺制备出100个凹面球形微孔。

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